pvdQ基因对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响

目的 观察pvdQ(PA2385)基因对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响.方法 构建pvdQ基因表达质粒pME6032-pvdQ,鉴定后,采用电穿孔法将其转入PAO1野生株中,构建pvdQ高表达株.同时将空质粒pME6032采用电穿孔法转入PAO1野生株中,构建pME6032空质粒株,采用Real-time PCR检测各株...     

铜绿假单胞菌pvdQ基因在肠道上皮细胞Caco-2中的表达及其功能研究

目的 探讨铜绿假单胞菌pvdQ基因阻止密度感应系统自体诱导因子3O-oxo-C12-HSL干扰肠道上皮细胞Caco-2的作用.方法 构建带有FLAG标签的pvdQ基因真核表达质粒pIRES2-EGFP-pvdQ并鉴定,将带有pvdQ基因的质粒转染入Caco-2细胞,并用Western blot法检测pvdQ基因在Caco-2细胞中的表达.3O-oxo-C12-HSL干扰转染前后的Caco-2细胞,利用质谱分析仪检测Caco-2细胞上清中3O-oxo-C12-HSL浓度变化.结果 经酶切鉴定pvdQ基因真核表达载体构建成功,Western blot检测结果显示pvdQ基因能在人肠道上皮细胞Caco-2中表达.质谱分析结果显示,转染pvdQ基因后,Caco-2细胞上清中3O-oxo-C12-HSL浓度明显减少(P＜0.05).结论 pvdQ基因成功在人肠道上皮细胞Caco-2中表达,并降解细胞周围3O-oxo-C12-HSL分子,为进一步研究pvdQ基因对Caco-2细胞的保护作用奠定基础.     

阿奇霉素对铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵及耐药性的影响

目的 探讨阿奇霉素对铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵的影响,为指导临床合理选择抗生素提供依据.方法 排泵抑制剂(苯丙氨酸精氨酸β-萘酰胺PAβN)干预铜绿假单胞菌后,采用微量肉汤稀释法测定常见药物的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)值的变化,筛选主动外排表型阳性菌株.PCR扩增主动外排表型阳性菌株oprM、mexB和mexR;real-time PCR检测主动外排表型阳性菌株mexB的mRNA水平;对主动外排表型阳性菌株进行mexR基因测序分析.在阿奇霉素作用下,观察铜绿假单胞菌的mexB基因表达及对头孢他啶、左氧氟沙星、环丙沙星和美罗培南的MIC值变化.结果 从20个临床多重耐药的铜绿假单胞菌菌株中筛选出8株主动外排表型阳性菌.检测表明这8株菌oprM、mexB和mexR均呈阳性,mexB的mRNA水平均较PAO1显著增高.对8株MexABOprM高表达菌mexR基因进行测序,发现菌株PAO03的mexR基因存在突变.阿奇霉素可显著降低mexR基因未突变MexAB-OprM高表达菌株的mexB基因的表达和对头孢他啶、左氧氟沙星、环丙沙星和美罗培南的MIC值,而对菌株PAO03和nalB突变株(mexR基因突变MexAB- OprM高表达菌株)无显著影响.结论 阿奇霉素可抑制铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵的表达,提高铜绿假单胞菌对抗生素的敏感性.     

月桂挥发油体外抗病原微生物活性研究

目的 探讨月桂挥发油对临床分离细菌和真菌的体外抗菌活性,为月桂在治疗感染性疾病中的开发与运用奠定基础.方法 采用琼脂平板二倍稀释法测定了月桂挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌共16种65株临床分离细菌、14株白假丝酵母和1株非白假丝酵母临床分离真菌的最低抑菌浓度.用SPSS 17.0软件中单因素方差分析法比较分析了月桂挥发油分别对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、洛菲不动杆菌和白假丝酵母菌共5个不同种属细菌和真菌抑菌活性的强弱.结果 月桂挥发油除对铜绿假单胞菌无明显抗菌活性外,对其余受试细菌均有较强的抗菌活性,MIC为0.27 mg/mL～2.15 mg/mL;月桂挥发油对白假丝酵母菌和非白假丝酵母菌均有较强的抗菌活性,MIC分别为0.07～0.54 mg/mL和0.03 mg/mL;月桂挥发油对白假丝酵母菌和洛菲不动杆菌的抑菌活性明显强于对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌活性（P＜0.01）,对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的抑菌活性比较,差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 月桂挥发油有较强的抗细菌和抗真菌活性,具有用于防治感染性疾病-新型抗菌药物的开发和运用前景.     

肽核酸体外抑制铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成的研究

目的研究肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用,探讨其潜在的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的应用价值。方法采用计算机软件设计和斑点杂交联合筛选出能与铜绿假单胞菌PAO1早期生物膜形成关键基因motA mRNA结合紧密的反义寡核苷酸序列,根据其序列合成肽核酸(PNA)并连接穿膜肽(cell pene-trating peptide,CCPs)(KFF)3K形成CCPs-PNA,分别采用不同浓度的CCPs、PNA和CCPs-PNA处理铜绿假单胞菌PAO1,定量测定并用显微镜观察其对生物膜形成的抑制作用。结果 PNA和CCPs-PNA对铜绿假单胞菌PAO1生物膜的早期形成都有抑制作用,并且随着浓度的增加,其抑制作用也增加,但CCPs-PNA对生物膜形成的抑制明显优于PNA组。1、5、10μmol/L的(KFF)3K-PNA对PAO1生物膜形成的抑制率分别约为30%、50%、70%。而1μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成基本没有影响,5、10μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成的抑制率却分别为3%和10%左右。各个浓度的CCPs对细菌生物膜的形成都没有影响。与对照组相比,CCPs-PNA处理之后的PAO1,其运动能力明显下降,PAO1处理组与对照组在运动培养基上的扩散直径之比约为3∶5。结论针对motA基因的PNA通过抑制PAO1的运动能力、降低吸附,从而对铜绿假单胞菌PA01起始阶段的生物膜形成产生抑制作用,穿膜肽(KFF)3K大大增强了此作用。推测铜绿假单胞菌的motA基因或其编码产物可能是一个良好的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的靶点。     

肉豆蔻挥发油体外抗病原微生物活性研究

目的 探讨肉豆蔻挥发油体外抗病原微生物活性。方法 采用琼脂平板2倍稀释法测定肉豆蔻挥发油对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌等16种67株临床分离菌和白假丝酵母菌14株、非白假丝酵母菌1株临床分离真菌的最低抑菌浓度（MIC）;单因素方差分析法比较肉豆蔻挥发油对金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌、大肠埃希菌、洛菲不动杆菌与肺炎克雷伯菌等不同种属真菌和细菌的抑菌活性。结果 肉豆蔻挥发油除对铜绿假单胞菌抑菌活性相对较低（MIC为4.25~8.50 mg/mL）外,对其余受试细菌有较强的抑菌活性（MIC为0.07~1.06 mg/mL）;肉豆蔻挥发油对白假丝酵母菌和非白假丝酵母菌均有较强的抗真菌活性,MIC分别为0.07~0.53mg/mL和0.07mg/mL。统计分析表明,肉豆蔻挥发油对白假丝酵母菌的MIC明显低于对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的MIC（P〈0.01）,对肺炎克雷伯菌的抑菌活性明显强于对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌活性（P〈0.01,P〈0.05）,对其它种属细菌之间的抑菌活性差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 肉豆蔻挥发油具有较强的抗细菌和抗真菌活性,可用于新型抗菌药物的开发,运用前景广阔。     

0～10岁呼吸道感染儿童咽拭子培养的病原菌调查

目的了解我院0—10岁儿童呼吸道感染的病原菌分布,为预防和治疗提供依据。方法将咽拭子接种于血平板、巧克力、伊红美兰或麦康凯培养基。结果共检测标本1043例,检出病原菌330株,阳性检出率33．64％。其中金黄色葡萄球菌1叭株（9．7％）,鲍曼不动杆菌46株（4．4％）,肺炎克雷伯菌肺炎亚种44株（4．2％）,大肠埃希氏菌34株（3．3％）,阴沟肠杆菌23株（2．2％）,铜绿假单胞菌13株（1．2％）,链球菌10株（O．95％）,肺炎链球菌9株（0．86％）,白假丝酵母菌7株（0．67％）。结论该院患儿呼吸道感染的病原菌是以金黄色葡萄球菌,鲍曼不动杆菌,肺炎克雷伯菌肺炎亚种,大肠埃希氏菌,阴沟肠杆菌多见,其次为铜绿假单胞菌,链球菌,白假丝酵母菌。     

原白头翁素对铜绿假单胞菌群体感应系统调控的毒力因子表达量的影响

目的 研究原白头翁素对铜绿假单胞菌（PA）的生长及群体感应系统（QS系统）调控的毒力因子表达的影响。方法 测定原白头翁素对PA的最低抑菌浓度和生长曲线,以40 μmol/L的呋喃酮C-30作为阳性对照,测定原白头翁素（40、80 μmol/L）对铜绿假单胞菌标准株PAO1生长曲线的影响以及QS系统调控的毒力因子中胞外3种毒力因子（绿脓菌素、蛋白水解酶和弹性蛋白酶）表达量的影响。结果 在实验所采用的浓度下,原白头翁素对铜绿假单胞菌的生长未表现出明显的抑制作用,但对PAO1的3种毒力因子均有抑制作用,并呈现出剂量相关性。结论 原白头翁素抗感染的机制可能是作用于铜绿假单胞菌的QS系统,抑制毒力因子表达,从而降低该菌的毒力。     

两种中药复方体外对白假丝酵母菌生物膜形成的影响

目的：观察两种中药复方体外对白假丝酵母菌生物膜形成的影响。方法：采用结晶紫染色法和MTT法评价白假丝酵母菌生物膜的体外生长动力学,微量稀释法检测两种中药复方对白假丝酵母菌悬浮菌及其生物膜的抑制作用以及药物包被对白假丝酵母菌生物膜形成作用。结果：生物膜内白假丝酵母菌数量随培养时间延长而增加。两种中药复方对白假丝酵母菌悬浮菌的最低抑菌浓度50%（MIC50）分别为3.725、3.925mg/mL,对生物膜的SMIC50与SMIC80分别是3.725和7.725mg/mL,3.925和7.85mg/mL。两种中药复方包被浓度分别在3.322、2.269mg/mL以上时对其生物膜形成的抑制作用有显著性。结论：两种中药复方对体外白假丝酵母菌生物膜具有明显的抑制作用。     

铜绿假单胞菌QS系统缺陷对生物膜形成及大鼠肺部慢性感染的影响

目的研究lasI rhlI基因缺陷对铜绿假单胞菌体外生物膜形成的影响;观察铜绿假单胞菌PAO1野生型及其群体感应系统的lasI rhlI基因缺陷型菌株人工生物膜致病性的差异,了解群感应系统的lasI rhlI基因在铜绿假单胞菌生物膜感染致病过程中的作用。方法采用生理盐水-吸痰管系统进行铜绿假单胞菌体外生物膜的培养,3d后用扫描电子显微镜观察PAO1、PAO1 lasI rhlI形成生物膜的情况。从大鼠支气管内直接予以PA(菌种为铜绿假单胞菌PAO1野生型,PAO1 lasI rhlI基因缺陷型)海藻酸盐微菌粒悬液(1×109CFU/mL)攻击,建立PAO1野生型及QS系统的lasI rhlI基因缺陷型菌株人工生物膜肺部感染动物模型。于感染2周后评估各组大鼠的肺部病理学、细菌学的变化。结果3d后PAO1野生型的生物膜较厚,lasI rhlI基因缺陷型菌株所形成的生物膜结构呈薄膜状,明显薄于PAO1野生型。感染2周后,PAO1野生型组的病理学改变和细菌学改变均显著重于lasI rhlI基因缺陷组(P<0.001)。结论QS系统的lasI和rhlI基因影响铜绿假单胞菌体外形成生物膜的能力,并且在PA肺部感染过程中发挥着重要作用。     

低浓度乙醇对铜绿假单胞菌生长及相关毒力因子影响的研究

目的：研究低浓度乙醇对铜绿假单胞菌磷脂酶C基因（PLCH）表达的影响。方法：观察不同浓度乙醇对铜绿假单胞菌生长曲线影响,荧光定量实时PCR检测不同乙醇浓度培养的铜绿假单胞菌PA01的PLCH表达量变化。、结果：工程株PA01在0．1％、0．5％、1％乙醇浓度下,其生长曲线与对照基本一致,在孵育18h都达到最高生长密度;在2％～5％的乙醇浓度下,细菌生长极其缓慢,6％以上的乙醇浓度下几乎不生长．．与对照相比,在0．1％、0．5％和1％乙醇诱导下．PLCH的表达量的分别比对照组上升了44倍、30倍和8倍．在2％乙醇浓度下,PLCH表达量略为下降。结论：低浓度乙醇有助于铜绿假单胞菌相关毒力因子表达上调,增加生存力．在感控消毒中,保持足够的酒精浓度对清除铜绿假单胞菌至关重要。     

青橄榄叶提取物体外抑菌活性研究

[目的]测定青橄榄叶提取物及大孔树脂AB-8不同极性洗脱产物对供试菌株的体外抑菌活性.[方法]采用96孔板微量稀释法测定青橄榄叶总提取物及不同极性洗脱产物对白色念珠菌、铜绿假单胞杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐药白色念珠菌、酿酒酵母和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC).[结果]大孔树脂水洗极性部位对白色念珠菌的MIC为20.62 g/ml,50％乙醇洗脱部分对铜绿假单胞杆菌的MIC为82.5 μg/ml,90％乙醇洗脱部分对白色念珠菌、铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐药白色念珠菌、酿酒酵母和金黄色葡萄球菌的MIC分别为41.25,20.62,20.62,10.32,165.0和2.58μg/ml.[结论]青橄榄叶洗脱产物的水、50％乙醇及90％乙醇洗脱部分对白色念珠菌、铜绿假单胞杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐药白色念珠菌、酿酒酵母和金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,尤其是90％乙醇洗脱部位的抑菌范围广,活性强且呈现量效依赖关系.     

甜菜碱体外抑菌活性的研究

目的 研究甜菜碱对临床病原菌的体外抑菌活性.方法 采用试管二倍稀释法进行体外抑菌试验,测定甜菜碱对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的最小抑菌浓度.结果 甜菜碱对4种病原菌标准菌株的最小抑菌浓度（MIC）为大肠杆菌的MIC 6.25 mg/ml、铜绿假单胞菌的MIC 3.125 mg/ml、金黄色葡萄球菌的MIC 6.25 mg/ml、白色念珠菌的MIC 25 mg/ml.结论 甜菜碱对4种病原菌的标准菌株都有明显的抑菌作用,尤其对铜绿假单胞菌的MIC值最低.     

喹诺酮信号分子对铜绿假单胞菌毒力的影响

目的探讨喹诺酮信号分子（PQS）对铜绿假单胞菌（PA）毒力的影响。方法选择PAO1作为实验菌,分为PQS组、PQS与
抑制剂组、抑制剂组以及正常组。QPCR方法检测Ⅲ型分泌系统（T3SS）的调节基因ExsA和毒力蛋白基因ExoS的转录水平;分
光光度计检测绿脓素生成量;作用肺泡上皮细胞A549,用平板计数法比较PAO1粘附和侵袭力;构建小鼠腹膜炎模型,观察PQS
对小鼠存活时间的影响。结果PQS增多和减少不影响PAO1 的成长情况。与正常组相比,PQS组的ExsA与其调控表达的
ExoS 毒力蛋白基因转录水平均显著升高（P<0.01）;PQS组PAO1 产生的绿脓素也明显升高,抑制组却明显下降（P<0.01）;与
A549细胞作用时,抑制剂组PAO1的粘附和侵袭力均显著降低;腹膜炎模型小鼠PQS组存活时间也降低明显（P均<0.01）。抑
制剂组Exos的转录水平有降低,差异有统计学意义（P<0.05）。与正常组比较,抑制剂组的ExsA转录水平无明显差异,PQS组
PAO1的粘附力和侵袭力没有改变（P均>0.05）。结论在PA感染宿主的整个过程中,PQS能维持粘附和侵袭能力,PQS的浓度
与绿脓素的产生有正相关关系,从而最终使宿主的存活时间成负相关。
     

同源重组构建铜绿假单胞菌新的mucA基因突变菌株

目的 构建铜绿假单胞菌新的mucA基因突变菌株,为研究新突变的mucA基因功能提供实验菌株.方法 首先将含新突变的mucA基因同源片段与自杀质粒pEX100T相连接,构建质粒pEXmucA56,再将质粒pEXmucA56转化人大肠埃希菌DH5α,与铜绿假单胞菌标准菌株PAO1共培养进行同源重组,并用羧苄青霉素(Carbenicillin)平板、假单胞菌分离平板(Pseudomonas isolation agar,PIA)和蔗糖(sucrose)平板进行筛选,获得染色体上含新突变的mucA基因的PAO1菌株.结果 经酶切及聚合酶链反应(polyrnerase chain reaction,PCR)鉴定质粒pEXmucA56构建及转化成功,经PCR及测序分析证实同源重组菌株PAOmucA56构建成功.结论 成功构建了含新的mucA基因突变的铜绿假单胞菌菌株PAOmucA56,为研究新突变的mucA基因的功能奠定了基础.     

两种铜绿假单孢菌慢性大鼠肺部感染模型的建立方法探讨

目的 建立两种铜绿假单孢菌慢性大鼠肺部感染模型,并根据细菌学和病理学指标对其进行评价.方法 (1)随机将健康清洁级Sprague-Dawley大鼠300只分为3组:野生型铜绿假单孢菌感染组(PAO1组),变异型铜绿假单孢菌感染组(PAO-JP2组)和对照组.(2)应用锐孔喷射装置,将两株铜绿假单孢菌的藻酸盐混悬液制成两种铜绿假单孢菌藻酸盐包裹体凝胶小珠,通过气管插管法将其接种至大鼠肺部,以无菌生理盐水-藻酸盐包裹体接种组作为空白对照组.在接种后3、7、14、28 d,取每组大鼠肺分别进行肺组织匀浆菌落计数和病理学检查.结果 (1)细菌学指标:感染后3、7、14、28 d,对照组肺组织均未培养出细菌,PAO1组和PAO-JP2组肺组织均分别培养出野生型和变异型铜绿假单孢菌,感染后3、7 d,PAO1组和PAO-JP2组大鼠肺组织匀浆菌落计数均＞105 CFU/g(对数值:3 d:PAO1组19±6,PAO-JP2组17±7;7 d:PAO1组13±4,PAO-JP2组:12±4),感染后14、28 d,上述两组大鼠肺组织菌落计数均＞103 CFU/g,PAO1组明显高于PAO-JP2组(P＜0.05)(对数值:14 d:PAO1组11.3±2.8,PAO-JP2组9.6±3.3;28 d:PAO1组9.1±1.5,PAO-JP2组4.2±3.0).(2)病理学指标:接种后3、7 d,感染动物肺组织均有不同程度的脓肿、实变、水肿、出血表现,镜下可见中性粒细胞聚集在藻酸盐包被体周围,形成脓肿.接种后14、28 d,实变逐渐减少,以局部肺不张、纤维增生、肉芽肿形成为主要表现,而以PAO1组表现得更为明显.结论 使用锐孔喷射装置,制成两种铜绿假单孢菌藻酸盐包裹体凝胶小珠并接种至大鼠肺部,可以成功地建立两种细菌的慢性大鼠肺部感染模型,方法较简便可行.     

复方三黄酊体外抑菌活性的研究

目的 评价两种不同工艺制备的抗感染药物复方三黄酊的体外抗菌活性。方法 采用抑菌圈试验和胰酪大豆胨液体培养基稀释法对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌和白色念珠菌进行体外抑菌试验,进行了最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的试验研究。结果 两种工艺制备的抗感染药物复方三黄酊对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌具有较强的抑菌和杀菌活性,以金黄色葡萄球菌较为敏感。结论 本院生产的抗感染药物复方三黄酊具有明显的体外抑菌活性。