注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白生物学活性检测方法学研究

目的通过对注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生物学活性检测方法进行研究,建立该药物的生物学活性检测方法。方法参考重组人干扰素生物学活性测定法,以人羊膜细胞(WISH)病变抑制法开展注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生物学活性检测方法研究。结果该方法的专属性好,精密度试验中生物学活性相对标准偏差(RSD)为10.6%,准确性试验平均回收率98.2%,RSD为9.0%,符合生物制品质量检验方法要求。结论本研究制定的实验方法准确、可靠,适用于注射用重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白的生物学活性检测。     

人血清白蛋白融合干扰素α2b体外抑制乙肝病毒的实验研究

目的:研究长效干扰素人血清白蛋白融合干扰素(HSA-IFNα2b)对HepG2.2.15细胞增殖、凋亡及其HBsAg与HBeAg表达的影响,探讨其体外抑制乙肝病毒的机制。方法:采用SRB法分析HSA-IFNα2b作用HepG2.2.15细胞3,6 d后对其增殖的影响,酶联免疫分析不同剂量HSA-IFNα2b作用不同时间后HepG2.2.15细胞HBsAg与HBeAg的表达水平,Hochest33342、PI双染法观察细胞的凋亡和死亡,Western Blot印迹检测Bcl-2、Bax的表达。结果:HepG2.2.15细胞的增殖在加HSA-IFNα2b作用3,6 d后都有所抑制,细胞培养上清中HBsAg表达明显下降,并与浓度相关,HSA-IFNα2b浓度为10 000 U.mL-1时,培养6 d后HBsAg的抑制率达87%以上。Hochest33342、PI双染结果显示当HSA-IFNα2b浓度在1 250U.mL-1时可见少量的凋亡细胞,凋亡细胞数随着药物浓度的增大而增多,并有少量死亡细胞出现。Western Blot印迹检测随药物浓度的增加Bcl-2的表达降低而Bax的表达增加。结论:HSA-IFNα2b体外可明显抑制HepG2.2.15细胞的增殖及HB-sAg的表达,并可引起HepG2.2.15细胞的凋亡和死亡。     

高质量重组人干扰素α2b的分离纯化研究

重组人干扰素2b作为一种上市药物,被广泛用于治疗慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎、恶性黑色素瘤等多种疾病的治疗,产生了良好的临床疗效和经济效益。目前国内厂家生产的重组人干扰素以大肠杆菌基因工程表达为主。大肠杆菌表达的人干扰素2b以包涵体的形式表达,包涵体产物需通过变性复性以及其后的纯化才能获得生物活性。干扰素复性得率低,纯化时需要经过四步色谱处理,工艺繁琐,成本高,而且无法去除未完全复性的中间产物,从而影响产品质量和疗效。建立可溶性重组人干扰素α2b的高密度发酵工艺,并在此基础上,建立其高效、快速和稳定的纯化工艺。通过发酵工艺优化获得可溶性重组人干扰素α2b的高密度发酵,收集菌体后,通过高压破菌、硫酸铵分级沉淀、phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析、Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析、Octyl Sepharose Fast Flow疏水层析进行分离纯化,并对纯化产物进行生物活性分析。重组人干扰素α2b工程菌的发酵密度A₆₀₀达到38.5,可溶性重组人干扰素α2b占...     

重组毕赤酵母生产干扰素α-2b的研究

目的为探求生产干扰素-α2b的方法。方法采用重组毕赤酵母发酵,纯化生产干扰素-α2b。结果重组毕赤酵母生产干扰素α-2b,产量高达70mg/L(发酵液),目标蛋白干扰素α-2b不需要复性,在纯化过程中,不需要价格昂贵的单抗柱,即可从发酵液中提取获得纯度达96%以上的目标蛋白,蛋白质比活性大于1.0×109IU/mg。结论PichiaPastoris高效酵母分泌表达系统取代大肠杆菌表达系统生产干扰素-α2b。结论采用重组毕赤酵母生产干扰素-α2b,能提高蛋白质比活性,简化生产工艺,降低生产成本。     

重组人干扰素α-2b原液的制备

目的优化重组人干扰素α-2b原液的发酵纯化方法,降低生产成本,提高产品的安全性。方法构建重组大肠杆菌,通过逐级扩大培养、发酵、纯化,收集菌体;菌体裂解后,进行变性、复性,通过不同的纯化方法,得到符合质量标准的重组人干扰素α-2b原液;通过对各步工艺的考察,优化重组人干扰素α-2b的发酵、纯化方法。结果制得的重组人干扰素α-2b菌种表达量高,原液纯度可达95.0%以上,生物学比活性高于1×108U.mg-1,符合《中华人民共和国药典》的质量要求,安全性强。结论此法可应用于重组人干扰素α-2b原液的生产。     

重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白质控方法与质量标准的建立

目的:建立重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白(rHSA-IFNα2a)的质控方法和质量标准。方法:分别使用抗HSA抗体和抗IFNα2a抗体、采用免疫印迹法对成品进行鉴别试验,采用WISH细胞病变抑制法测定成品和原液的生物学活性,原液以胰蛋白酶酶切后,用HPLC分析肽图,其余项目按2010年版中国药典(三部)的规定进行检测。结果:样品与抗HSA抗体和抗IFNα2a抗体均呈阳性反应,比活性>1.5×105 IU.mg-1,其肽图与参考品的一致,其余项目均符合2010年版中国药典(三部)的规定,根据检测结果建立了rHSA-IFNα2a的质量标准。结论:建立的质控方法和质量标准可以保证rHSA-IFNα2a的安全、有效和质量可控,可以用于rHSA-IFNα2a的常规检定。     

白蛋白融合干扰素α-2b猕猴长期毒性试验

用人血清白蛋白(HSA)对干扰素进行修饰,制成的新型白蛋白-干扰素融合蛋白(Albumin-Interferon fusion protein,A-IFN,Woferon),不仅保留了干扰素的生物学功能,而且使用时更加安全。为了确定Woferon的安全性,开展了猕猴皮下给药长期毒性试验,观察动物重复给药后的一般生活状态及心电图、血液学、血液生化和尿液等指标的变化。结果猕猴皮下注射高剂量(800μg/kg)白蛋白融合干扰素α-2b会引起可逆性白细胞(WBC)、血小板(PLT)下降和天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)的升高;猕猴对200μg/kg剂量有较好的耐受性;50μg/kg为无毒性反应剂量。TK研究表明:50μg/kg剂量,Cmax为(434.8±38.0)ng/ml,临床拟用剂量下血浆药物浓度为8ng/ml,安全倍数超过50倍。     

重组毕赤酵母胸腺肽α1-人血清白蛋白基因工程菌高密度发酵及分离纯化

目的研究重组毕赤酵母胸腺肽α1-人血清白蛋白(Tα1-HSA)基因工程菌在30 L发酵罐中高密度发酵表达Tα1-HSA融合蛋白的发酵工艺及产物的分离纯化方法。方法采用两步发酵法进行重组毕赤酵母Tα1-HSA基因工程菌的高密度发酵。发酵液经超滤浓缩,阴离子交换色谱,亲和色谱,凝胶过滤色谱等步骤进行分离纯化。结果发酵结束后,菌体细胞湿重达到350 g/L,发酵液中蛋白产量达到2.0 g/L。发酵液经分离纯化后获得了纯度较高的重组Tα1-HSA融合蛋白,HPLC分析纯度达97.5%。结论重组毕赤酵母Tα1-HSA基因工程菌高密度发酵的成功及分离纯化方法的建立为Tα1-HSA的进一步研究和开发奠定了基础。     

白蛋白融合干扰素α-2b在猕猴体内的免疫原性研究

研究白蛋白融合干扰素α-2b(Woferon)对猕猴的免疫源性,从而为药物安全性评价提供数据支持。实验方法为猕猴皮下注射白蛋白融合干扰素α-2b,每周一次,连续5次,在不同时间点采取血样,用ELISA方法检测血样中抗白蛋白融合干扰素α-2b抗体的产生情况。结果(1)在给药剂量50、200和800μg/kg范围内,第15天有83%(15/18)的动物产生了抗Woferon抗体,66%(16/18)的动物产生了抗普通干扰素抗体,27%(5/18)的动物产生了抗人白蛋白抗体;第28天有94%(17/18)的动物产生了抗Woferon抗体和抗普通干扰素抗体,77%(14/18)的动物产生了抗人白蛋白抗体。(2)在试验剂量范围内,产生抗体的效价与给药剂量无显著相关性。(3)当抗体效价在1∶800以上时,产生的抗Woferon抗体可完全中和药物,使其失去抗病毒活性。     

重组人干扰素α2b包涵体纯化方法的研究

目的研究重组人干扰素α 2b包涵体的纯化方法。方法超声破碎菌体 ,干扰素α 2b包涵体经洗涤液洗涤后 ,SDS -PAGE检测其纯度 ,VSV -WISH细胞系统测定干扰素活性。结果差速离心很难完全将包涵体和细菌碎片分开。超声破碎 6次和 9次的干扰素α 2b包涵体纯度和活性相近 ,均明显高于 3次超声破碎处理的包涵体。用含2～ 4mol/L尿素、1%TritonX - 10 0的洗涤液对干扰素α 2b包涵体洗涤 ,能提高包涵体纯度。结论建议超声破碎 6次 ,用含 2～ 4mol/L尿素、1%TritonX - 10 0的洗涤液纯化干扰素α 2b包涵体     

发酵液中重组人血清白蛋白的纯化

采用摇瓶培养重组毕赤氏酵母（Pichia pastoris）表达并分泌重组人血清白蛋白（recombinant human se-rum alburmin，rHSA）至胞外，发酵液经（NH4）2SO4沉淀、离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤分离纯化rHSA，纯化样品经SDS-PAGE检测为单一条带。     

幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白高效表达研究

目的高密度培养重组细菌和高效表达重组幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白。优化细菌培养和重组幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白表达的发酵工艺条件。重组细菌的培养条件：培养温度为35℃，培养基pH值为7．0～7．5，葡萄糖浓度为0．5％～2．0％，采用合理的策略控制发酵过程代谢副产物乙酸盐浓度不高于4mg/ml,，在BiofloⅢ发酵罐中，3批实验结果表明：重组细菌的平均生物量大约为60g/L发酵液(DCW)，重组幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白平均表达量为35％左右。     

重组人干扰素α-2b两步柱色谱分离纯化工艺研究

通过改进柱色谱条件,两步柱色谱分离纯化重组人干扰素α-2b,简化了工艺,缩短了生产流程,纯化倍率达到5.6倍,纯度98%.蛋白比活性1.43×108IU/mg蛋白,活性回收率58%.     

Effect of Serum, α-1 Acid Glycoprotein,Lipoproteins and Albumin on Human Mononuclear Leucocyte β-Adrenoceptors

Abstract: The effects of serum, α-1 acid glycoprotein (AAG), serum lipoproteins (SLP) and human serum albumin (HSA) on ³H-(-)-dihydroalprenolol (³H-(-)-DHA) binding and (-)-isoproterenol ((-)-IPR) induced cyclic AMP (cAMP) elevation in human peripheral blood mononuclear leucocytes (MNL) were investigated. The saturable binding of ³H-(-)-DHA was decomposed into two classes of binding sites with maximum binding capacity of approximately 1400 and 30000 sites/cell and with dissociation constants (K_d) of approximately 0.7 and 65 nM. Stimulation of the MNL β-adrenoceptors by (-)-IPR caused a concentration dependent cAMP accumulation (EC50 ～0.2 μM) with maximum level approximately 250% above basal. For all single leucocyte preparations, 30–35 min. exposure to serum, AAG and SLP increased the number of β-adrenoceptors with 100–200% and the maximal responsiveness to (-)-IPR with 30–90%. The presence of proteins did not change the K_d or the EC50. (-)-Alprenolol inhibited concentration dependently the serum induced increment in (-)-IPR-responsiveness. Serum, AAG and SLP did also increase the number of low affinity binding sites with 25–40% without effect on the K_d. HSA had no consistent effect on β-adrenergic binding or stimulation. The present study shows that serum, AAG and SLP influence the number and function of MNL β-adrenoceptors in vitro.     

Release of Human Serum Albumin from Poly(lactide-co-glycolide) Microspheres

Human serum albumin (HSA) was encapsulated in a 50:50 copolymer of DL-lactide/glycolide in the form of microspheres. These microspheres were used as a model formulation to study the feasibility of controlling the release of large proteins over a 20- to 30-day period. We show that HSA can be successfully incorporated into microspheres and released intact from these microspheres into various buffer systems at 37°C. A continuous release of the protein could be achieved in physiological buffers at 37°C over a 20- to 30-day period from microspheres with high protein loadings (11.6%). These results demonstrate the potential of poly(DL-lactide-co-glycolide) microspheres for continuous delivery of large proteins.     

RP-HPLC法测定注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白的含量

目的:建立测定注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白(简称TACI-Fc)含量的方法。方法:采用反相高效液相色谱法。色谱柱为VydacC18,流动相A液为含0.1%三氟乙酸的水溶液,流动相B液为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,梯度洗脱,流速为1.3mL·min-1,检测波长为280nm。结果:TACI-Fc进样量在5.0～20.0μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系(r=0.9997);方法平均回收率为99.71%,RSD=1.14%(n=9)。结论:本方法操作简便、重复性好、结果准确,适用于测定注射用TA-CI-Fc的含量。     

重组人干扰素α2b聚乳酸乙醇酸共聚物微球在大鼠体内的药动学研究

目的:考察重组人干扰素α2b聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)微球在大鼠体内的药动学特征。方法:首先对双抗体夹心酶联免疫吸附法用于大鼠血清中干扰素α2b浓度测定进行了方法学考察,然后给2组大鼠分别肌内注射1MIU重组人干扰素α2b的市售注射用灭菌粉末和PLGA微球,按不同时间点取全血,分离血清,测定血清中的干扰素α2b浓度,用3p97软件计算药动学参数。结果:所建立的浓度测定方法可满足药动学研究的方法学要求;大鼠肌内注射2种制剂后,药动学特征均符合二室模型,tmax、t1/2β、AUC分别为0·72h和1·39h、22·71h和33·32h、21668·72和38655·87pg·mL·h-1。与注射用灭菌粉末相比,微球组的tmax、t1/2β明显延长,AUC值增加。结论:所制干扰素α2bPLGA微球在大鼠体内具有较明显的缓释特征。     

Albubnp,a Recombinant B-type Natriuretic Peptide and Human Serum Albumin Fusion Hormone,as a Long-Term Therapy of Congestive Heart Failure

PURPOSE: B-type natriuretic peptide (BNP) has been in clinical use for the treatment of decompensated congestive heart failure. However, BNP has a very short half-life in circulation, which limits its application to acute CHF and requires continuous i.v. infusion. To provide superior pharmacological benefits of BNP to other stages of chronic congestive heart failure and to eliminate problems associated with drug delivery via continuous i.v. infusion, we have designed and evaluated AlbuBNP, a long-acting form of BNP by recombinant fusion to human serum albumin for use in chronic congestive heart failure, post-acute follow-up, and postmyocardial infarction. METHODS: Human BNP (1-32) was seamlessly fused to mature human serum albumin at N-terminus to create AlbuBNP. The bioactivities of AlbuBNP were evaluated by natriuretic peptide receptor-A mediated cGMP activation assay, hemodynamic responses, and plasma cGMP elevation. The pharmacokinetic properties were determined after single i.v. or s.c. bolus injection in C57/BL6 mice. RESULTS: AlbuBNP had approxiamtely the same maximal bioactivity as BNP to activate cGMP in the in vitro NPRA/cGMP assay. The EC50s were 28.4+/-1.2 and 0.46+/-1.1 nM for AlbuBNP and BNP, respectively. In spontaneously hypertensive rats, AlbuBNP lowered both systolic and diastolic blood pressure, having sustainable mean arterial pressure reduction for more than 2 days. Six nmol/kg AlbuBNP i.v. bolus in mice increased plasma cGMP level 5.6-fold over the baseline. The elimination half-life in mice was dramatically increased from 3 min for BNP to 12-19 h for AlbuBNP. CONCLUSIONS: AlbuBNP is bioactive and has desired pharmacokinetic properties for long-term use. It has the potential to be further developed as a new therapeutic option for chronic, acute, and post-acute CHF to alleviate symptoms, improve clinical status, and slow the disease progression by sustained drug exposure via infrequent simple subcutaneous injections.     

热休克蛋白65及其融合蛋白Hsp65-6×P277的分离纯化和稳定性研究

来源于牛分枝杆菌的热休克蛋白65(Hsp65)在没有佐剂的情况下可作为载体分子将抗原表位递呈给免疫系统。热休克蛋白具有蛋白酶的催化活性,容易发生自溶而降解,这制约了基于Hsp65疫苗的研究。该研究中,建立了纯化Hsp65及其融合蛋白Hsp65-6×P277(P277为来源于人热休克蛋白60的肽段,线性重复6次)的方法。Hsp65与Hsp65-6×P277以可溶形式表达于大肠杆菌。在低温及添加EDTA的条件下经细胞裂解、硫酸铵沉淀及阴离子交换树脂等纯化方法,可得到电泳纯的目的蛋白。用纯化的融合蛋白Hsp65-6×P277免疫小鼠,可激发机体产生强烈的免疫应答,该融合蛋白有希望作为免佐剂的糖尿病疫苗加以进一步研究开发。     

热休克蛋白65及其融合蛋白Hsp65-6×P277的分离纯化和稳定性研究

来源于牛分枝杆菌的热休克蛋白65（Hsp65）在没有佐剂的情况下可作为载体分子将抗原表位递呈给免疫系统。热休克蛋白具有蛋白酶的催化活性，容易发生自溶而降解，这制约了基于Hsp65疫苗的研究。该研究中，建立了纯化Hsp65及其融合蛋白Hsp65-6×P277（P277为来源于人热休克蛋白60的肽段，线性重复6次）的方法。Hsp65与Hsp65—6×P277以可溶形式表达于大肠杆菌。在低温及添加EDTA的条件下经细胞裂解、硫酸铵沉淀及阴离子交换树脂等纯化方法，可得到电泳纯的目的蛋白。用纯化的融合蛋白Hsp65-6×P277免疫小鼠，可激发机体产生强烈的免疫应答，该融合蛋白有希望作为免佐剂的糖尿病疫苗加以进一步研究开发。