地高辛标记的大鼠p75 RNA探针的制备和应用

目的制备用地高辛标记的神经生长因子低亲和力受体(p75)的RNA探针.研究p75在海马组织中的表达.方法设计p75引物,构建p75/pGEM-T重组质粒,分别用ApaⅠ和Sac Ⅰ进行酶切得到线性化DNA片段,以Sp6和T7聚合酶转录合成酶合成地高辛标记的(dig-)正反义RNA探针.运用点膜杂交的方法检验探针的敏感度,运用该探针,通过原位杂交分析p75在海马中的表达.结果构建了p75/pGEM-T质粒,获得高效价的正、反义dig-p75 RNA探针,应用该探针发现p75 mRNA在海马中的表达.结论成功制备了地高辛标记的p75RNA探针,为进一步研究p75在海马中发育和损伤过程中的表达打下基础.     

地高辛标记的大鼠nNOS mRNA探针的制备和应用

目的　制备大鼠神经元型一氧化氮合酶 (neuronalnitricoxidesynthase,nNOS)地高辛 (digoxigenin)标记的RNA探针 ,探讨nNOS在脊髓中的表达定位。方法　采用RT PCR方法 ,从大鼠脑组织中扩增nNOS基因mRNA部分片段 ,并经序列测定。以dig nNOSmRNA为探针 ,采用原位杂交观察成年大鼠脊髓组织中nNOSmRNA表达。结果　RT PCR法扩增出一特异产物与预期长度 2 4 0bp相符 ,T载体克隆测序与nNOS基因 10 0 %同源。原位杂交结果显示阳性信号出现在成年大鼠脊髓组织中。结论　采用RT PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织nNOS基因克隆 ,dig nNOSmRNA探针原位杂交显示正常SD大鼠腰段脊髓组织中表达nNOSmRNA。     

地高辛精标记RNA探针原位杂交的简便方法

用地高辛精标记ＴＨ基因合成ＲＮＡ探针，在冰冻组织切片上进行原位杂交，通过碱性磷酸酶催化的呈色反应，检测在基因治疗帕金森病大鼠动物模型研究中酪氨酸羟化酶基因在脑内的表达。实验结果表明，简化原位杂交方法可适应于任何实验室。     

用PCR制备地高辛精标记的单链探针进行原位杂交

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法制备地高精标记的单链探针，用以原位检测低丰度的β肾上腺素能受体ＭＲＮＡ在大鼠肺组织中扮布。结果表明本方法制备的探针的检测敏感性显著高于用随机引物法标记的双链探针。已克隆于载体的ＣＤＮＡ或ＲＴ－ＰＣＲ产物均可作为模板合成单链探针，江ＤＡＴＰ、ＤＣＴＰ、ＤＧＴＰ浓度各为２００μｍｏｌ／Ｌ，ｄＴＴＰ＋Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度降至５０－７５ μｍｏｌ／Ｌ，扩增产量无显著变化，ｄＴＴ     

地高辛标记的小鼠β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ RNA 探针的制备和应用

为了制备小鼠β-1,4-半乳糖基转移酶I(β-1,4-galactosyltransferase 1,β-1,4-GalT-1)地高辛标记的RNA探针以探讨β-1,4-GalT-I mRNA在坐骨神经组织的表达定位,本研究用提取的小鼠脑总RNA,采用RT-PCR方法,得到β-1,4-GalT-I的DNA片断,将其克隆到pGEM-T载体;采用体外转录的方法合成地高辛标记的正、反义β-1,4-GalT-I RNA探针;运用点杂交的方法分析标记探针的灵敏度;最后应用该探针,通过原位杂交的方法,分析β-1,4-GalT-I mRNA在小鼠坐骨神经的表达.结果:构建了β-1,4-GalT-I/pGEM-T质粒,获得了高效价的地高辛标记的正、反义β-1,4-GalT-I RNA探针,应用该探针发现β-1,4-GalT-J在小鼠坐骨神经髓鞘中有表达.以上结果表明,制备的地高辛标记的正、反义β-1,4-GalT-I RNA原位杂交探针可特异地检测β-1,4-GalT-1 mRNA在组织中的表达.本研究为进一步分析β-1,4-GalT-I在坐骨神经及其它神经组织发育和损伤过程中的表达奠定基础.     

地高辛标记cDNA探针组织及细胞mRNA原位杂交技术

地高辛标记ｃＤＮＡ探针组织及细胞ｍＲＮＡ原位杂交技术＊杜卫东周晓虹马学玲吴浩翟为溶张月娥＊国家自然科学基金重点项目和国家教委博士点专项基金资助课题作者单位：上海医科大学病理学教研室２０００３２（第一作者现工作单位：中国科学院上海生理研究所２０００３１...     

地高辛标记的小鼠β—1，4—半乳糖基转移酶IRNA探针的制备和应用

为了制备小鼠β—1，4—半乳糖基转移酶I(β—1，4—galactosyltransferase I，β—1，4—GalT—I)地高辛标记的RNA探针以探讨β—1，4—GalT—I mRNA在坐骨神经组织的表达定位，本研究用提取的小鼠脑总RNA，采用RT—PCR方法，得到β—1，4—GalT—I的DNA片断，将其克隆到pGEM—T载体；采用体外转录的方法合成地高辛标记的正、反义β—1，4—GalT—IRNA探针；运用点杂交的方法分析标记探针的灵敏度；最后应用该探针，通过原位杂交的方法，分析β—1，4—GalT—ImRNA在小鼠坐骨神经的表达。结果：构建了β—1，4—GalT—I／pGEM—T质粒，获得了高效价的地高辛标记的正、反义β—1，4—GalT—IRNA探针，应用该探针发现β—1，4—GalT—I在小鼠坐骨神经髓鞘中有表达。以上结果表明，制备的地高辛标记的正、反义β—1，4—GalT—-RNA原位杂交探针可特异地检测β—1，4—GalT—ImRNA在组织中的表达。本研究为进一步分析β—1，4—GalT—I在坐骨神经及其它神经组织发育和损伤过程中的表达奠定基础。     

地高辛精标记大鼠代谢型谷氨酸受体第5亚型RNA探针的制备研究

为制备用地高辛精标记的大鼠代谢型谷氨酸受体第 5亚型 c RNA探针 ,本实验用分子生物学技术重组质粒 p GEMm Glu R5 ,经限制性内切酶酶切分析 ,证实其确有 m Glu R5基因片段插入且方向正确。将此质粒再经限制性内切酶消化得到线性DNA片段 ,用 T7RNA聚合酶体外转录合成带有地高辛精标记的高比活性的单链 RNA探针 ;经斑点杂交实验证实该探针具有较高的敏感性和可靠性 ,可用于代谢型谷氨酸受体第 5亚型有关的研究     

地高辛标记的小鼠β-1,4-半乳糖基转移酶RNA探针的制备和应用

为了制备小鼠 β-1,4-半乳糖基转移酶 ( β-1,4-galactosyltransferase ,β-1,4-Gal T- )地高辛标记的 RNA探针以探讨β-1,4-Gal T- m RNA在坐骨神经组织的表达定位 ,本研究用提取的小鼠脑总 RNA,采用 RT-PCR方法 ,得到β-1,4-Gal T- 的 DNA片断 ,将其克隆到 p GEM-T载体 ;采用体外转录的方法合成地高辛标记的正、反义β-1,4-Gal T- RNA探针 ;运用点杂交的方法分析标记探针的灵敏度 ;最后应用该探针 ,通过原位杂交的方法 ,分析 β-1,4-Gal T- m RNA在小鼠坐骨神经的表达。结果 :构建了β-1,4-Gal T- /p GEM-T质粒 ,获得了高效价的地高辛标记的正、反义β-1,4-Gal T- RNA探针 ,应用该探针发现 β-1,4-Gal T- 在小鼠坐骨神经髓鞘中有表达。以上结果表明 ,制备的地高辛标记的正、反义 β-1,4-Gal T- RNA原位杂交探针可特异地检测β-1,4-Gal T- m RNA在组织中的表达。本研究为进一步分析β-1,4-Gal T- 在坐骨神经及其它神经组织发育和损伤过程中的表达奠定基础。     

应用地高辛标记的cRNA探针原位杂交检测胰岛素mRNA

成年雄性Ｗｉｔａｒ大鼠，用地高辛标记的ｃＲＮＡ探针在胰腺切片上进行原位杂交，以检测胰岛Ｂ细胞胰岛素基因表达产物ｍＲＮＡ；同时并用免疫组织化学法显示相邻切片胰岛素免疫反应阳性细胞，进行比较，胰腺经４％多聚甲醋灌注固定，经Ｂｏｕｉｎ液再固定２０ｈ，常石蜡包埋和切片，经胰岛素ｃＲＮＡ探针杂交的胰腺切片中胰岛Ｂ细胞和核仁呈阳性反应，阳性信号为蓝色颗粒，胰岛其他细胞及胰腺泡细胞为阴性，方法照切片中均无阳性信     

中药“神经再生素”促神经生长过程中基因差异性表达的初步研究

为了探索中药“神经再生素”促神经生长过程中基因水平的变化。本实验采用 dd-PCR方法 ,从体外培养背根神经节细胞加药组和不加药组中获得两者的差异表达片段 ,并经反杂交筛选、克隆测序、DNA序列检索分析、Northern验证。结果表明 ,差异显示共获得 8个差异条带 ,一个为下调基因 ,其余为上调基因 ,其中 2个 c DNA序列与 RRAJ5 16 1基因 (增殖相关基因 )、AF196 3 15基因 (锌指样蛋白 DDP2 ) 10 0 %同源 ,2个 c DNA序列与 AK0 0 175 7基因、STA5 SRR基因 (t RNA合成酶 )部分同源。结论是中药“神经再生素”在促神经生长过程中 ,对神经元基因的选择性表达起着重要的调控作用。     

神经生长因子在大鼠心内神经节的表达

目的 观察成年和中老年大鼠心内神经节神经生长因子(NGF)阳性神经元的存在及其变化。方法 免疫组织化学法。结果 成年及巾老年大鼠心内神经节均存在NGF阳性神经元,但中老年大鼠心内神经节NGF阳性神经元明显减少,表达明显降低。结论 心房后壁心内神经节存在NGF阳性神经元,并随年龄增加表达减少,提示NGF表达的减少可能与心脏功能的退化相关。     

神经生长因子对周围神经损伤后再生和修复的实验研究

手术切除５ｍｍ兔的尺神经，在两断端间连接肌桥并套装硅胶管，形成一个封闭腔，向腔内注入神经生长因子。间隔不同时间取尺神经桥接区、桥接区近段、远段、尺神经的脊髓投射节段和相应脊神经节，用光镜和电镜观察神经溃变和再生情况并作图像分析；用酶标示踪和电生理方法检测神经通路的重建状况。结果显示，周围神经离断后，肌束桥接并用硅胶管套装后注入外源性神经生长因子，可明显地促进离断神经的再生和修复。     

神经生长因子对痴呆模型鼠海马突触素的影响

切断SD老年鼠(24月龄)左侧穹窿海马伞.造成隔海马胆碱能系统损害的痴呆模型. 用免疫组化和图像分析技术分析神经生长因子对痴呆鼠海马突触素的影响.实验证明损伤一个月后.损伤对照组损伤侧海马CAI区多形层、辐射层、腔隙分子层和齿状回分子层突触素含量分别是减少了28.17% 、32.15%、17.36%和35.22%:NGF治疗组、损伤侧海马CAI区多形层、辐射层、腔隙分子层和齿状回分子层突触素含量只减少了6.17%、5.52%、13.50%和3.81%.提示神经生长因子能够促使痴呆鼠海马内突触素含量的增多.     

神经生长因子促进老年痴呆鼠学习记忆恢复和海马突触重建

切断老年鼠（２４月龄）左侧穹窿海马伞（ＦＦ），造成隔－海马胆碱能系统损伤的痴呆模型。用Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫和体视学分析ＮＧＦ对模型鼠学习记忆和突触的影响。实验１个月后显示：（１）定位航行试验中，损伤组大鼠寻找平台的潜伏期，稳定后的平均值为４０ｓｅｃ，而ＮＧＦ治疗组为２２ｓｅｃ，相互间具有显著性差异（Ｐ＜０．０５）；（２）空间搜索试验中，损伤组在原平台象限跨越相应平台位置次数为１．９次，ＮＧＦ治疗组为５．９次，两者间有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；（３）损伤组损伤侧齿状回分子层突触数密度和面密度分别下降２９％和１９．０３％，平均面积增大１１．４％。ＮＧＦ治疗组，突触数密度和面密度与损伤组相比，有显著升高（Ｐ＜０．０５），而平均面积显著下降（Ｐ＜０．０５），都接近于正常组；（４）损伤组损伤侧齿状回分子层突触前终末内线粒体的体密度和数密度分别下降３０．７％和５６．５％，体积增大３７．０９％。ＮＧＦ治疗组的体密度、数密度和体积与正常组相比，差异无显著性（Ｐ＞０．０５）。提示ＮＧＦ能够改善老年痴呆模型鼠学习记忆能力和促进海马突触重建。     

脑缺血再灌注后脑梗塞周围区生长相关蛋白-GAP43表达的变化及外源性神经生长因子的影响

目的研究大鼠脑缺血再灌注后生长相关蛋白-43(GAP-43)表达的变化规律及外源性神经生长因子(NGF)的影响.方法成年健康雌性Wistar大鼠72只,随机分为假手术组、自然恢复组、人工脑脊液组和NGF治疗组.采用线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)动物模型,应用免疫组织化学方法观察脑缺血再灌注后GAP-43的表达.结果(1)脑缺血再灌注6 h后,缺血周围区GAP-43表达逐渐增高,第7天达高峰,以后逐渐降低,第21天仍有表达.(2)应用外源性NGF后,GAP-43表达较对照组有所增高,但无显著性差异(P＞0.05).结论提示中枢神经系统损伤后,神经元具有再生和修复的可塑性,外源性NGF对GAP-43的调节有待于进-步研究.     

大鼠坐骨神经移植段对受损的视网膜节细胞影响的形态学研究

选用成年大鼠,切断视神经后,将自体周围神经段(2mm/每段)植入眼球玻璃体内,存活2周,取视网膜沿视轴纵切开,Nissl染色,光镜观察,并用计算机图像分析仪(IBAS 2000)测量面积。结果发现,植入周围神经段的各组视网膜节细胞未见溃变现象,测量的视网膜节细胞胞体平均面积比正常动物者明显增加,每组均可见一些超过正常视网膜节细胞面积的巨大细胞,胞体呈椭圆形,其长轴与节细胞排列方向一致;当增加周围神经移植段数量或缩短两个周围神经移植段植入点的距离时,视网膜节细胞的平均面积和巨大节细胞构成比即随之增大。仅切断视神经的对照组动物视网膜神经节则出现溃变。     

实验性铅中毒对大鼠海马神经生长因子基因表达的影响

目的观察实验性铅中毒对大鼠海马神经生长因子(NGF)基因表达的影响,探讨铅致学习记忆损害的分子毒理学机制。方法逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和原位杂交法。结果正常大鼠海马组织可表达NGF mRNA,铅染毒后海马NGF mRNA含量显著下降。海马组织中神经生长因子mRNA表达量与铅染毒时间呈负相关。结论铅可使海马组织神经生长因子基因表达下降。