5-氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖及成肌分化的影响

[目的]观察5-氮杂胞苷(5-Aza)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外增殖和成肌分化的影响.[方法]无菌条件下取SD大鼠骨髓组织,采用密度梯度离心法分离大鼠MSCs,传3代后的MSCs采用双标免疫组化法鉴定后,随机分为4组:浓度为5、10、15μmol/L的5-Aza组和空白对照组,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度5-Aza对MSCs生长增殖的影响;以含5、10、20μmol/L5-Aza的培养基诱导培养MSCs 24 h后,改用完全培养基继续培养,采用免疫组织染色法鉴定5-Aza诱导分化3、7、14d后细胞肌分化相关蛋白肌凝蛋白(myosin)和结蛋白(desmin)的表达情况.[结果]双标免疫组化染色结果显示:所培养细胞同时表达Brdu和CD44、CD54,表达率达96%,鉴定结果表明所培养细胞为MSCs;5、10μmol/L5-Aza对MSCs增殖无显著影响(P>0.05),15μmol/L5-Aza可显著抑制MSCs生长(P<0.05);不同浓度5-Aza诱导培养MSCs后第3天,部分细胞出现desmin阳性表达,诱导后14 d,部分细胞表达myosin,以10μmol/L5-Aza组作用为佳.[结论]高浓度5-Aza可抑制MSCs体外增殖;适宜浓度的5-Aza可诱导MSCs向成肌细胞定向分化.     

MSC体外诱导分化为心肌样细胞的鉴定及Nesprin蛋白表达研究

目的体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）向心肌细胞分化并进行相关鉴定,观察分化过程中细胞Nesprin蛋白表达的变化。方法大鼠MSC经Ficoll密度梯度离心法分离获得后贴壁传代培养,流式细胞术鉴定第2代MSC表面抗原表达。以10μmol／L5-氮杂胞苷（5-Aza）诱导第2代MSC向心肌细胞分化,观察细胞形态学改变;RT—PCR、免疫组织化学法和免疫荧光细胞化学染色鉴定心肌细胞相关蛋白Desmin、α—sarcomeric actin、cardiac Troponin Ⅰ（cTnⅠ）mRNA和蛋白表达;Western blotting检测MSC分化前后Nesprin蛋白表达。结果经5-Aza诱导分化后的MSC细胞及细胞核增大,形态渐趋一致,大部分呈长梭形;细胞Desmin、α-sarcomericactin、cTn ⅠmRNA和蛋白呈阳性表达。免疫荧光细胞化学染色显示Nesprin蛋白定位于核膜,Westernblo Ring分析发现诱导分化后细胞Nesprin蛋白表达明显增加（P〈0．05）。结论成功诱导大鼠MSC向心肌细胞分化;Nesprin蛋白在分化后细胞中的表达明显增加,提示Nesprin可能参与MSC向心肌细胞样变化的过程。     

人脐带间充质干细胞在体外向心肌样细胞的诱导分化

目的初步探讨人脐带间充质干细胞(HUMSCs)向心肌样细胞诱导分化的方法。方法取第8代人脐带间充质干细胞用10μmol/L 5-氮杂胞苷(5-Aza)进行诱导24h,对照组用含10%FBS的α-MEM培养液培养。每2d换1次培养液,并在不同诱导阶段进行细胞形态学观察。诱导第四周行免疫细胞化学法、RT-PCR检测。结果诱导第2周可见部分细胞体积逐渐增大,呈球状和杆状细胞。诱导第4周时经免疫细胞化学法可检测到分化后的细胞表达了cTn T、Cx43和desmin心肌标志物,RT-PCR检测到了心肌细胞标记NK2.5的表达。结论应用10μmol/L 5-Aza可以将人脐带间充质干细胞诱导分化成心肌细胞,进而可能为临床治疗难治性心脏疾病提供细胞来源。     

MSC体外诱导分化为心肌样细胞的鉴定及Nesprin蛋白表达研究

目的 体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)向心肌细胞分化并进行相关鉴定,观察分化过程中细胞Nesprin蛋白表达的变化.方法 大鼠MSC经Ficoll密度梯度离心法分离获得后贴壁传代培养,流式细胞术鉴定第2代MSC表面抗原表达.以10μmoL/L 5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导第2代MSC向心肌细胞分化,观察细胞形态学改变;RT-PCR、免疫组织化学法和免疫荧光细胞化学染色鉴定心肌细胞相关蛋白Desmin、α-sarcomeric actin、cardiac Troponin I(cTn I)mRNA和蛋白表达;Western blotting检测MSC分化前后Nesprin蛋白表达.结果 经5-Aza诱导分化后的MSC细胞及细胞核增大,形态渐趋一致,大部分呈长梭形;细胞Desmin、α-sarcomeric actin、cTn I mRNA和蛋白呈阳性表达.免疫荧光细胞化学染色显示Nesprin蛋白定位于核膜,Western blotting分析发现诱导分化后细胞Nesprin蛋白表达明显增加(P<0.05).结论 成功诱导大鼠MSC向心肌细胞分化;Nesprin蛋白在分化后细胞中的表达明显增加,提示Nesprin可能参与MSC向心肌细胞样变化的过程.     

5-氮杂胞苷对骨髓间充质干细胞向肌细胞增殖及分化的影响

目的：探讨在不同浓度5-氮杂胞苷（5-Aza）诱导间充质干细胞(MSCs)分化为成肌细胞过程中，其对干细胞增殖及分化的影响。方法：分离纯化鉴定4周龄Wistar大鼠骨髓MSCs，以不同浓度5-Aza作用，用四唑盐（MTT）法测定细胞生长活力，观察细胞形态变化，通过RT-PCR及电泳测定诱导后大鼠的MSCs中骨骼肌肌动蛋白的表达。结果：0和1 μmol·L^-1 5-Aza对细胞增殖无明显影响；随着5-Aza浓度的增高，MSCs的增殖逐渐减弱；20~30 μmol·L^-1 5-Aza对细胞有毒性作用，影响其增殖。3和6 μmol·L^-1 5-Aza，MSCs有骨骼肌肌动蛋白的表达；9和12 μmol·L^-1 5-Aza，MSCs有骨骼肌肌动蛋白的表达，该浓度作用9 d后有部分细胞体明显增粗，12 d有肌管样细胞出现。结论：5-Aza影响干细胞分化，调控基因的表达及调控MSCs向肌细胞定向分化为肌管样细胞的过程。     

含组织激肽释放酶1表达载体诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

目的 探讨组织激肽释放酶1(KLK1)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化的影响.方法 选取2015年3-7月购买的大鼠BMSCs,将大鼠BMSC细胞分为3组即正常组、组织激肽释放酶1组、5-Aza组.采用RT-PCR分别对诱导培养后的大鼠BMSCs进行心肌细胞特异性蛋白Actin、c-TnI和Desmin的检测,并用Western blot免疫印迹分析c-TnT蛋白表达量.结果 RT-PCR检测显示,5-Aza诱导的BMSCs(1.964±0.805)在心肌特异性蛋白Actin RNA、c-TnI RNA和Desmin RNA的表达均高于空白组(1.000±0.000)(P<0.05),KLK1诱导组(2.633±0.582)以上蛋白的RNA表达量又显著高于5-Aza诱导组(P<0.05).Western blot结果显示,5-Aza诱导组c-TnT蛋白的表达(0.799±0.101)高于空白组(0.112±0.001)(P<0.001),KLK1诱导组(1.294±0.134)显著高于5-Aza组.差异有统计学意义(P<0.001).结论 5-Aza能有效使BMSCs向心肌样细胞诱导分化,KLK1也能诱导BMSCs向心肌样细胞分化.KLK1较5-Aza诱导的BMSCs在心肌细胞特异性蛋白RNA表达,心肌特异性蛋白T表达其心肌特异性更为突出.     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:比较5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)于不同浓度、不同孵育时间对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSC)向心肌样细胞分化的影响;观察诱导后不同时间点心肌标志物的表达情况.方法:体外分离培养Wistar大鼠MSC,传代纯化后进行诱导实验.浓度分组(C1-C4):分别以3、5、10、20μmol/L5-aza处理24h,之后更换新鲜培养基继续培养.时间分组(T1-T5):以10μmol/L分别孵育6h、12h、24h、48h、72h,之后更换新鲜培养基继续培养.各组均于首次加药4周后行免疫细胞化学染色检测.RT-PCR检测10μmol/L5-aza处理后2、4、8周细胞GATA4mRNA、cTnTmRNA的表达情况.结果:经5-aza诱导处理后4周,C1-C4组Desmin及α-Sarcomeric Actin染色阳性率各组比较均无统计学差异(P＞0.05);而T1-T5各组其阳性率比较存在统计学差异(P＜0.01).RT-PCR显示,诱导后2周,GATA4mRNA开始表达,持续至8周;cTnTmRNA在诱导后2周无表达、4周时弱表达,8周时更为显著.结论:成年人鼠MSC在适当浓度5-aza处理后可以向心肌样细胞分化,在3μmol/L～20μmol/L范围内,5-aza浓度的变化对MSC的分化率影响较小;在48h内,适当延长5-aza的孵育时间可能增加MSC向心肌样细胞的转化率.     

骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞及其内向整流钾电流特征

[目的]体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞并探讨其内向整流钾电流(Ik1)特征.[方法]采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法鉴定诱导细胞,并采用全细胞膜片钳技术检测Ik1表达.[结果]诱导后细胞体积较诱导前增大,呈长梭形.14 d后细胞之间出现连接,排列方向渐趋一致.免疫细胞化学染色显示Desmin、αt-sarcomeric actin和心肌特异性cTnI呈阳性反应,RT-PCR结果表明诱导细胞有心肌β肌球蛋白重链表达.诱导细胞Ik1表达呈明显的不均一性,部分细胞Ik1与正常心室肌细胞相似,但Ik1电流密度总体上低于正常心室肌细胞.[结论]5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化;诱导细胞Ik1表达不均一性提示可能有致心律失常潜能.     

5-氮胞苷诱导骨髓问充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:比较5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)于不同浓度、不同孵育时间对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSC)向心肌样细胞分化的影响;观察诱导后不同时间点心肌标志物的表达情况.方法:体外分离培养Wistar大鼠MSC,传代纯化后进行诱导实验.浓度分组(C1-C4):分别以3、5、10、20μmol/L5-aza处理24h,之后更换新鲜培养基继续培养.时间分组(T1-T5):以10μmol/L分别孵育6h、12h、24h、48h、72h,之后更换新鲜培养基继续培养.各组均于首次加药4周后行免疫细胞化学染色检测.RT-PCR检测10μmol/L5-aza处理后2、4、8周细胞GATA4mRNA、cTnTmRNA的表达情况.结果:经5-aza诱导处理后4周,C1-C4组Desmin及α-Sarcomeric Actin染色阳性率各组比较均无统计学差异(P＞0.05);而T1-T5各组其阳性率比较存在统计学差异(P＜0.01).RT-PCR显示,诱导后2周,GATA4mRNA开始表达,持续至8周;cTnTmRNA在诱导后2周无表达、4周时弱表达,8周时更为显著.结论:成年人鼠MSC在适当浓度5-aza处理后可以向心肌样细胞分化,在3μmol/L～20μmol/L范围内,5-aza浓度的变化对MSC的分化率影响较小;在48h内,适当延长5-aza的孵育时间可能增加MSC向心肌样细胞的转化率.     

骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞及其内向整流钾电流特征

【目的】体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞并探讨其内向整流钾电流(IK1)特征。【方法】采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs，在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导．用免疫细胞化学染色和RT—PCR方法鉴定诱导细胞，并采用全细胞膜片钳技术检测IK1表达。【结果】诱导后细胞体积较诱导前增大，呈长梭形。14d后细胞之间出现连接，排列方向渐趋一致。免疫细胞化学染色显示Desmin、α-sarcomeric actin和心肌特异性cTnⅠ呈阳性反应，RT-PCR结果表明诱导细胞有心肌β肌球蛋白重链表达。诱导细胞IK1表达呈明显的不均一性，部分细胞IK1与正常心室肌细胞相似，但IK1电流密度总体上低于正常心室肌细胞。【结论】5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化；诱导细胞IK1表达不均一性提示可能有致心律失常潜能。