黑素瘤抑制蛋白在转基因小鼠胚胎乳腺组织中的表达

目的：检测黑素瘤抑制蛋白（ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ）在小鼠胚胎乳腺组织中的表达。方法：剖腹分离出１０．５－１６．５ｄ的ＭＩＡ－ＣＤ／ＲＡＰ启动子－半乳糖苷酶（２．２１ｌａｃＺ）转基因小鼠胚胎,利用Ｘ－ｇａｌ全胚胎染色观察转基因的组织和细胞染色,并以免疫组织化学染色检测内源性ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ蛋白在胚胎乳腺组织叫的表达。结果：ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ在孕期１１．５ｄ的小鼠胚胎乳腺上皮细胞中开始表达,至１３     

急性肝衰竭大鼠肝组织中钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白的表达及乌司他丁对其的影响

目的：探讨钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白在急性肝衰竭模型中的表达情况及乌司他丁对其表达的影响。方法：通过腹腔注射D-氨基半乳糖（D-Gal）及脂多糖（LPS）建立大鼠急性肝衰竭模型。大鼠随机分为对照组、模型组及乌司他丁干预组。采用免疫组织化学方法检测钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白表达情况。结果：D-Gal/LPS联合注射成功诱导大鼠急性肝衰竭模型,与对照组相比,模型组钙蛋白酶及钙蛋白酶抑制蛋白表达增加（P〈0.05）,但经乌司他丁干预后,钙蛋白酶表达较模型组明显减少（P〈0.05）,而钙蛋白酶抑制蛋白的表达无明显变化（P〉0.05）。结论：乌司他丁可能通过抑制钙蛋白酶活性,同时保持钙蛋白酶抑制蛋白活性,从而减轻肝脏炎症损伤。     

黑素瘤抑制蛋白启动子在小鼠体内的表达活性

目的;观察黑素瘤抑制蛋白（ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ）启动子在小鼠体内的表达活性。方法：利用ＰＣＲ技术扩增２．２ｋｂ的ＭＩＡ／ＣＤ－ＲＡＰ启动子,分子克隆技术构建ＭＩＡ启动子－半乳糖苷酶（２．２１ａｃＺ）载体,显微注射法将纯化的２．２ｌａｃＺ ＤＮＡ注入来自Ｂ６ＳＪＬ杂交小鼠受精卵的原以制备转基因小鼠。提取幼鼠尾ＤＮＡ,用ｌａｃＺ特异性引物筛选阳性转基因小鼠。结果：８只首建小鼠以体基因组整合有２．２ｌａ     

Cramp转基因小鼠的构建及鉴定

目的建立系统性表达Cramp转基因模型小鼠,为研究Cramp在衰老中的作用提供模型动物。方法把Cramp cDNA插入系统性表达CMV启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立Cramp转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,用RT-PCR和Western blotting方法筛选高表达品系。结果成功构建Cramp cDNA转基因载体,建立了Cramp转基因小鼠,通过RT-PCR和Western blotting方法筛选出3个高表达品系。结论建立了系统表达Cramp转基因小鼠,转入的Cramp基因在骨髓、脾脏、肝脏等组织高表达,为研究Cramp基因在衰老中的作用及机制提供了动物模型。     

钙蛋白酶抑制蛋白基因座多态性与散发性帕金森病晚期发作的关联性分析

目的 探讨中国汉族人群中钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因座单核苷酸多态性与散发性帕金森病(PD)的晚期发作之间的关联性.方法 取370名PD晚发患者和390名无神经系统疾病健康对照,取外周血提取DNA,使用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)对CAST基因的24个标签单核苷酸多态性(SNPs)进行基因分型,用x2-检验、logistic回归模型以及以贝叶斯算法(Bayesian algorithm)为基础的PHASE软件进行统计学分析.结果 在共显性基因模式中,未发现任何SNP与PD显著相关(P＞0.05);用年龄和性别校准后,进一步进行Logistic回归分析显示,在显性基因模式和隐性基因模式中均未发现任何CAST的基因多态性与PD有相关性(P＞0.05).连锁不平衡分析发现4个强连锁不平衡区域,未发现任何单倍型与PD发病密切相关(P＞0.05).结论 在中国汉族人群中,CAST与散发性PD的晚期发作无显著关联性.     

Dicer 1转基因小鼠模型的建立

目的 建立Dicer1转基因小鼠模型.方法 构建pcDNA3.I-Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导人BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR受体母鼠输卵管内.出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer1基冈表达.结果 显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR检测获得6只阳性鼠,Southern榆测6只均为阳性.对Southern检测阳性转基因小鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达.对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常.结论 成功建立Dicer1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER1基因功能及miRNA的表达及功能等奠定基础.     

异种肝移植模型-转入CD59蛋白基因小鼠的建立

目的 通过显微注射法产生用于异种移植研究的表达人CD59蛋白的转基因小鼠模型。方法 实验中利用OMT作为目的基因hCD59 cDNA的启动子．CMV作为报告基因GFP的启动子．构建重组质粒pGOC。通过显微注射法，把CMV-GFP-OMT-CD59基因片断注射入昆明白小鼠受精卵。结果 产生出86只F0代转基因小鼠。鼠尾基因组DNA经PCR法检测，12只阳性．进一步用Southern blot法检测1只阳性。结论 通过显微注射法，外源基因hCD59 cDNA在小鼠基因组中得到整合，产生出了阳性转人CD59蛋白基因小鼠。可用于进一步异种移植研究。     

Afp-cre-lacZ转基因小鼠的构建

目的 研究甲胎蛋白(Afp)阳性细胞的增殖分化在组织生长修复,肿瘤发生过程中的作用,建立Afp-CreERT转基因小鼠细胞示踪系统.方法 采用DNA雄原核显微注射方法获得Afp-CreERT转基因小鼠,筛选出合适的品系后,使之与Rosa26-lacZ工具小鼠杂交,获得Cre/lacZ双阳性的Afp-cre-lacZ转基因小鼠.结果 显微注射后,共出生小鼠56只,经PCR鉴定Cre阳性小鼠共4只,阳性小鼠传代后各为一系.筛选内源性Afp表达与Cre表达相对符合的品系作为Afp-CreERT转基因小鼠品系建系.Afp-CreERT转基因小鼠与Rosa26-lacZ工具小鼠杂交,经PCR鉴定后获得Cre/lacZ双阳性的Afp-cre-lacZ转基因小鼠.经实时PCR,X-gal染色,免疫荧光染色鉴定后得到Afp-cre-lacZ转基因小鼠细胞示踪系统,同时证实该系统能够正确示踪Afp表达阳性的细胞,同时也能够应用于肝损伤小鼠模型中.结论 成功构建了Afp-cre-lacZ转基因小鼠细胞示踪系统,为研究这类细胞的谱系发生提供了工具.     

抗菌肽转基因小鼠模型的建立

目的:制备抗菌肽转基因小鼠模型.方法:显微注射pcDNA3.1-PCMG到FVB小鼠受精卵雄原核中,注射存活胚胎移植到假孕母鼠输卵管内发育产生子代小鼠.结果:在生出的119只小鼠中经PCR和Southern blot检测到7只阳性.结论:通过显微注射法使外源基因pcDNA3.1-PCMG在FVB小鼠基因组中得到整合,为抗菌肽抗菌谱的研究,抗病毒、抗肿瘤机制的研究提供有价值的抗病动物模型.     

myc和ras癌基因共整合转基因小鼠的建立

MMTV－H3－c－myc和MMTV－v－Ha－ras癌基因DNA混合显微注射到小鼠受精卵中，并移植到假孕母鼠输卵管内，获得出生后断奶健康小鼠95R（♀55，♂40）。经过斑点杂交显示myc正反应小鼠17只（♀12，♂5），ras正反应小鼠12只（♀7，♂5）。在全部25只癌基因正反应小鼠中，有4只为myc＋ras双重正反应，均为雌性。继续进行Soutnern印迹分析，确认myc正反应小鼠为“建成者”转基因小鼠。许多转基因小鼠发生各种肿瘤。     

高表达人源Her2乳腺癌小鼠模型的建立及鉴定

目的 构建并鉴定高表达人源Her2乳腺癌转基因小鼠模型.方法 构建pMD18T-MMTV-huHER2-EGFP转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pMD18T-MMTV-huHER2-EGFP注射入C57BL/6J小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠.采用PCR鉴定子代小鼠尾部组织基因组DNA,用蛋白质免疫印迹法检测乳腺组织Her2蛋白的表达,通过组织病理学切片观察转基因小鼠乳腺组织的病理学变化.结果 经PCR方法检测得到转基因阳性小鼠.蛋白质免疫印迹结果显示,与野生型小鼠相比,F2代阳性小鼠的乳腺组织中Her2蛋白高表达.病理组织切片表明25周龄阳性小鼠的乳腺组织已经出现明显的癌变倾向.结论 高表达人源Her2乳腺癌小鼠模型成功建立并能稳定遗传,可自发形成乳腺癌,其生物学特性和病理学改变与人乳腺癌相近,可作为研究乳腺癌发生发展的动物模型.     

甘丙肽过表达转基因小鼠的制作和鉴定

目的 建立甘丙肽（galanin,GAL）过表达转基因小鼠,为后续研究甘丙肽基因功能提供动物模型. 方法 重组质粒PDGFβ-GAL经XbaⅠ、HindⅢ双酶切后,将连接有启动子的甘丙肽基因片段回收纯化,用显微注射法将甘丙肽基因注入400枚受精卵的雄原核中,选取发育正常的受精卵移植到假孕母鼠的输卵管壶腹部,待其产仔.用PCR方法鉴定子代小鼠基因型,蛋白印迹分析（Western blot）鉴定子代小鼠体内GAL蛋白表达情况. 结果 获得子代小鼠50只,有8只小鼠在基因组上整合有GAL基因,整合率为16％：Western blot显示转入的基因片段PDGF β-GAL在脑组织中的表达水平比肝组织高.结论 通过显微注射法成功建立了GAL过表达转基因小鼠模型.     

人sCD40L转基因小鼠模型的构建

目的研究阻断CD40-CD40L共刺激信号通路对移植皮肤免疫排斥反应的影响。方法通过RT-PCR技术克隆了呈可溶性表达的CD40L分子胞外区(sCD40L),利用K14启动子构建了sCD40L皮肤特异性表达载体,并利用该载体制备了转基因小鼠。结果所克隆的CD40L胞外区片段其大小及序列符合预期;以哺乳动物表达载体PCI为骨架,通过DNA重组,获得了含K14启动子和sCD40L编码区的皮肤特异性表达载体K14-sCD40L;通过显微注射和胚胎移植,PCR筛选检测:49只G0代小鼠有1只小鼠扩增出特异性条带,阴性对照无条带。结论成功建立sCD40L转基因阳性小鼠。     

MTA1转基因小鼠的构建及鉴定

目的将人的MTA1外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建稳定高表达MTA1的小鼠模型。方法通过RT-PCR方法克隆人的MTA1编码序列,将MTA1插入真核表达载体pcDNA3.1构建pcDNA3.1-MTA1载体,回收片段后利用显微注射技术将目的基因片段注入到受精卵的雄原核中,使用MTA1特异性的引物经PCR鉴定出基因型阳性的转基因小鼠,再利用Western-blot及免疫组化方法检测MTA1在转基因小鼠全身级织表达情况。结果成功构建了MTA1转基因注射片段。在320枚显微注射受精卵中挑选出300枚存活卵移植到10只ICR小鼠假孕受体的输卵管中,10只ICR小鼠均怀孕,移植成功率为100%,共生出子代鼠80只,经PCR检测其中共有9只整合了MTA1基因,整合率为11.25%。经PCR鉴定MTA1整合阳性的F1代小鼠,再经Western-blot和免疫组化分析检测MTA1表达水平在脑、肺、肝、肠等组织中表达明显增高,肾、骨骼肌表达无差异。结论成功构建了脑、肝、肺、结肠高表达MTA1的转基因小鼠,为进一步MTA1研究奠定了良好的研究模型。     

探讨建立抗癌新药“维泰醇”小鼠模型

目的为研制筛选抗癌新药维泰醇建立适宜的动物模型。方法将有生物学活性的癌细胞接种于不同种小鼠，逐日观察、记录致瘤情况和死亡时间。结果L1210细胞腹腔接种于DBA-2、BDF-1、CDF-1、C57BL/6J和昆明鼠（KM）小鼠共86只，接种量（1×10^4-1×10^6）个/只；其中DBA-2、BDF-1和CDF-1小鼠的致瘤率为100.0%，C57BL/6J和昆明鼠（KM）的致瘤率为0。B16细胞腋窝皮下接种BDF-1小鼠20只，接种量〉1×10^6个/只，致瘤率为95.0%。MGC-803细胞腋窝皮下接种于BALB/C裸鼠，接种量（5×10^6）个/只，致瘤率为100.0%。HL（对照细胞）和Z-HL16C细胞腋窝皮下接种BALB/C裸鼠6只，接种量（5×10^6）个/0.2ml.部位，致瘤率为100.0%。结论用L1210、B16、MGC-803和Z-HL16C细胞成功制备了相应的荷瘤小鼠模型，为下一步体内药效研究打下了良好基础。     

CLCN3/MMTV-PyMT转基因小鼠杂交群体的建立及鉴定

目的 建立并鉴定CLCN3/MMTV-PyMT双转基因小鼠杂交群体,构建氯通道ClC-3过表达的自发乳腺肿瘤转基因小鼠模型.方法 将CLCN3转基因小鼠和MMTV-PyMT转基因小鼠分别进行繁殖,选取阳性子代鼠进行配对,培育杂交后代,然后通过PCR鉴定基因型、通过组织免疫荧光方法、Western blot检测转基因小鼠蛋白表达情况.结果 成功繁育CLCN3转基因小鼠和MMTV-PyMT转基因小鼠,经PCR鉴定成功构建CLCN3/MMTV-PyMT双转基因鼠杂交群体,并成功保种和扩群,经组织免疫荧光和Western-blot分析双转基因小鼠的ClC-3蛋白的表达高于MMTV-PyMT转基因小鼠.结论 成功构建ClC-3过表达的自发乳腺肿瘤转基因小鼠模型,为进一步研究ClC-3在肿瘤生长和转移中的功能提供了良好的动物模型.     

家族性肌萎缩侧索硬化症转基因鼠的繁殖和鉴定

目的 建立家族性肌萎缩侧索硬化症（FALS）转基因模型鼠的繁育方法,并对其子代鼠进行基因鉴定。方法 （1）以6只B6SJLSOD1G93～＋半合子雄鼠与6只B6SJLFIJ＋／＋雌鼠（1：1）交配;（2）由鼠尾血提取基因组DNA,PCR扩增hmSOD1基因的片段,电泳后观察结果;（3）对PCR产物进行纯化测序,并通过BLAST验证。结果 6对种鼠交配产鼠仔53只,存活率为98％（52／53）;G93AhmSODl阳性鼠约占44．2％（23／52）;PCR扩增产物分别为内对照（IL-2）：324bp;Tg（hmSOD1）：236bp;测序证实PCR产物的基因序列和hmSODl基因片段中的序列一致．并存在G93A突变。结论 B6SJL-Tg（SOD1-G93A）1Gur／J雄鼠与B6SJLFI／J雌鼠配种能成功繁育出Tg（hmSOD1）阳性的ALS半合子子代鼠：本实验的PCR法能准确鉴定hmSOD1基因阳性鼠,并证实该转人的基因按近似孟德尔方式遗传,为ALS实验研究奠定了基础。     

Establishment of hamster- and human-PRNP transgenic mice

Objective To create transgenic mice expressing hamster‐ and human‐PRNP as a model for understanding the physiological function and pathology of prion protein (PrP),as well as the mechanism of cross‐species transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs).Methods Hamster and human‐PRNP transgenic mice were established by conventional methods.The copy number of integrated PRNP in various mouse lines was mapped by real‐time PCR.PRNP mRNA and protein levels were determined by semi‐quantitative R...     

人多聚免疫球蛋白受体转基因鼠的建立

目的构建携带有多聚免疫球蛋白受体(pIgR)的转基因鼠,使其能以近乎自然的状态感染EBV,观察EBV在鼻咽部病变过程中的作用。方法采用角质上皮特异性启动子ED-L2调控的pIgR基因,用显微注射方法将其导入受精卵中,使该基因能在F0代转基因鼠鼻咽部特异性表达。结果PCR检测F0代pIgR基因阳性率达37.5%(6/16),Southern杂交F0代pIgR基因阳性率为12.5%(2/16)。结论表达多聚免疫球蛋白受体的转基因动物有望成为研究EBV病毒致病机制的一种新的动物模型。     

提高制备转基因小鼠效率的研究

目的提高制备转基因动物的效率.方法着重对注射DNA的制备,高质量受精卵的获得,显微注射及胚胎移植各步骤中的主要影响因素进行了优化.结果移植后出生的小鼠经PCR及Sonthern-Blot检测,从最初的146只仔鼠中检测到2只阳性鼠,提高到由34只仔鼠中检测到10只阳性鼠,阳性鼠概率由1.4%基本稳定增加到30%.结论通过技术改良后,转基因效率得到明显提高,为从事转基因动物方面的研究建立了稳定的技术平台.