乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠模型的生物学特性及病理学研究

目的 研究乳腺癌MMTV-PyMT转基因小鼠的生物学特性及病理学改变.方法 MMTV-PyMT小鼠饲养于SPF级环境中,观察小鼠的繁育情况.观察小鼠乳腺癌的数目、体积及生存率,研究MMTV-PyMT小鼠乳腺癌的生物学特性.通过组织病理学切片,观察MMTV-PyMT小鼠乳腺癌的病理学变化、肺转移情况、细胞增殖和血管形成情...     

Dkk3系统性表达转基因小鼠的建立

目的建立系统性表达Dkk3转基因模型小鼠,为研究Dkk3生理功能及对骨生长发育的作用提供工具动物。方法通过ISH来观察Dkk3于C57BL/6J小鼠全身组织中的表达。把Dkk3基因插入系统性表达CMV启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立C57BL/6J Dkk3转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR检测Dkk3在骨髓中的表达,Western Blot检测Dkk3在肺脏、脑及肝脏中的表达,BrdU标记染色观察转基因小鼠骨生长情况。结果在生理状态下,Dkk3基因广泛表达,在骨、心脏及脑等组织高表达。建立的2个转基因小鼠品系中,转入的Dkk3基因在骨髓、脑、肝脏及肺组织中均有明显表达。BrdU整合率实验显示转基因小鼠长骨骺区细胞增殖明显低于同龄对照小鼠。结论建立了系统性表达Dkk3转基因小鼠,转入的Dkk3基因明显抑制小鼠长骨骨骺区细胞增殖,为Dkk3对骨生长发育的作用研究提供了有价值的工具动物。     

MMTV-PyMT转基因小鼠自发成瘤乳腺癌细胞的分离培养及鉴定

目的：分离培养小鼠乳腺肿瘤病毒介导多瘤病毒中间T抗原（MMTV-PyMT）转基因小鼠自发成瘤的乳腺癌细胞,初步研究其生长特性、分子表型、体内成瘤和转移能力。方法：取MMTV-PyMT小鼠自发成瘤的乳腺癌组织（n=3）,采用酶解贴壁培养法进行原代细胞分离并传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态特征;采用CCK-8检测细胞的增殖能力;通过Western印迹检测细胞的雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2(HER2)表达以鉴定细胞分子亚型。将分离培养的细胞接种于C57BL/6雌性小鼠（n=4）乳腺脂肪垫,观察细胞成瘤能力和生长特性;取肿瘤组织和内脏器官,制备组织切片后采用苏木精-伊红（HE）染色,观察组织形态学特点;采用免疫组织化学（IHC）染色检测ER、PR、HER2及Ki-67蛋白表达,分析分子分型。结果：成功分离得到MMTV-PyMT转基因小鼠自发成瘤的乳腺癌细胞（MMTV-PyMT细胞）并可稳定生长和传代,细胞倍增时间为56.0 h;MMTV-PyMT细胞可在C57BL/6雌性小鼠乳腺脂肪垫成瘤并生长,但未见远处内脏转移。该细胞在细胞学和组织学中的分子分型皆为HER...     

广泛表达人载脂蛋白E3转基因小鼠的建立

目的 建立人载脂蛋白E3(apolipoprotein E3,ApoE3)转基因小鼠,研究该基因在多种组织中表达水平的变化对动物的影响,探索该基因的功能.方法 RT-PCR法克隆人ApoE3基因,把该基因插入CMV启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立转ApoE3基因C57BIJ6J小鼠.并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Westem blot检测基因表达水平.通过生化指标分析初步鉴定ApoE3基因的功能.结果建立了2个系的高表达人ApoE3转基因小鼠.结论 成功建立了CMV启动子启动的高表达人ApoE3基因转基因小鼠,为进一步探索该基因的功能奠定了基础.     

Cramp转基因小鼠的构建及鉴定

目的建立系统性表达Cramp转基因模型小鼠,为研究Cramp在衰老中的作用提供模型动物。方法把Cramp cDNA插入系统性表达CMV启动子下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立Cramp转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,用RT-PCR和Western blotting方法筛选高表达品系。结果成功构建Cramp cDNA转基因载体,建立了Cramp转基因小鼠,通过RT-PCR和Western blotting方法筛选出3个高表达品系。结论建立了系统表达Cramp转基因小鼠,转入的Cramp基因在骨髓、脾脏、肝脏等组织高表达,为研究Cramp基因在衰老中的作用及机制提供了动物模型。     

BIGH3R555w突变转基因小鼠模型的建立

目的建立BIGH3R555w突变转基因角膜营养不良小鼠模型。方法构建以磷酸甘油酸激酶（phosphoglyceratekinase,PGK）为启动子的BIGH3（M）-IRES-EGFP重组质粒载体,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒注射入C57小鼠受精卵中,胚胎移植入假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT—PCR及Western印迹法检测BIGH3基因表达。结果8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎84枚,出生35只子代鼠,经PCR检测得到4只转基因阳性小鼠。RT—PCR和Westem印迹法检测结果显示,BIGH3R555w在转基因小鼠角膜表达量明显增多。结论通过显微注射法使外源基因B1GH3555w突变体在小鼠基因组中整合,成功建立了BIGH3突变转基因小鼠模型,该模型可为今后进一步研究角膜营养不良疾病的发病机制提供依据。     

心脏特异表达NOL3转基因小鼠的建立

目的 建立心脏特异表达NOL3转基因小鼠,用于研究该基因在心肌病发病中的作用.方法 Western blot检测小鼠NOL3表达谱.构建αMHC-NOL3表达载体,显微注射法建立NOL3转基因小鼠.PCR 鉴定转基因鼠的基因型,心脏超声检测转基因及野生型小鼠心脏功能及几何构型.结果 NOL3在1月龄野生型鼠心脏、脑、骨骼肌中的高表达,在心脏中的表达不随年龄而改变.通过转基因小鼠的筛选,得到了3个NOL3转基因品系,其中1个品系心脏NOL3蛋白表达量与野生型鼠相比明显增加.单转NOL3基因的小鼠心脏功能及几何构型与野生型小鼠相比无显著变化.结论 成功建立了心脏特异表达NOL3转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具.     

人载脂蛋白C3基因转基因小鼠的建立及血脂变化分析

目的制备系统性表达人载脂蛋白C3(APOC3)基因的转基因小鼠,建立高血脂小鼠模型。方法将人APOC3基因插入系统性表达启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立人APOC3转基因C57BL/6J小鼠。并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Western blot检测基因表达水平,血生化分析检测不同月龄转基因小鼠与同龄野生型小鼠的血脂指标,脂肪染色观察肝脏脂肪水平。结果建立了高表达人APOC3基因的转基因小鼠品系;转入的人APOC3基因在血液、肝脏、小肠、肌肉、心脏、肾脏、脾脏中均有明显表达;不同月龄转基因小鼠的血浆甘油三酯水平明显高于同龄野生型小鼠;转基因小鼠的肝脏脂肪含量高于野生型小鼠。结论系统性表达人APOC3基因的转基因小鼠表现高脂血症表型,可以作为高血脂以及高血脂相关的心血管病的工具动物。     

TNNT3(R69H)突变转基因小鼠模型的建立

目的 建立TNNT3(R69H)突变转基因小鼠模型.方法 构建pEGFP-TNNT3(R69H)转基因构件,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒pEGFP-TNNT3(R69H)注射入BDF1小鼠受精卵中,胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠.用PCR和Southern blot方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT-PCR及Western blot的方法检测TNNT3基因表达.结果 8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎82枚,出生40只子代鼠,经PCR和Southern方法检测得到5只转基因阳性小鼠.对其子代小鼠进行RT-PCR、Western blot检测结果显示,TNNT3在转基因小鼠心脏和骨骼肌中表达量明显增多.结论 通过显微注射法使外源基因pEGFP-TNNT3(R69H)在小鼠基因组中整合,成功建立了TNNT3(R69H)突变转基因小鼠模型.     

WNK4转基因小鼠的建立

目的制备WNK4转基因小鼠模型。方法通过显微注射法把线状WNK4基因注射入FVB小鼠受精卵雄原核中，然后将受精卵细胞移植于受体假孕母鼠输卵管内，发育产生子代小鼠。结果产生出112只F0代小鼠。鼠尾基因组DNA经PCR法检测1只阳性，并进行测序。结论通过显微注射法，外源基因WNK4在FVB小鼠基因组中得到整合，将对研究WNK4基因功能和与高血压疾病发病机制的作用和关系提供了有效的动物模型。     

同源导入近交系绿色荧光裸小鼠Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU的建立

目的建立一个能稳定表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecence protein,EGFP)的裸小鼠近交新品系,供包括人脑胶质瘤在内的所有人类肿瘤移植实验用。方法将雌性C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)转基因小鼠和雄性Foxn1nu裸小鼠,按同源导入方法进行杂交和回交,用荧光手电筒和匹配的眼镜、多功能活体成像仪、荧光显微镜对是否表达EGFP进行鉴别,传至F10后进行遗传学检测。结果所建品系命名为Foxn1nu.B6-CAGEGFP/SU(Soochow University),14个遗传生化位点中13个表型与BALB/c(Foxn1nu)吻合,唯Pep3(肽酶-3)的电泳为b型,而标准的BALB/c近交系为a型;外周血淋巴细胞占全部有核细胞15%,T淋巴细胞仅占0.3%,与亲本的Foxn1nu一致。结论成功地建立了一个既与亲本C57BL/6-Tg N(CAG-EGFP)-样稳定表达EGFP,又与Foxn1nu裸小鼠(BALB/c背景)一样具有T细胞缺乏的荧光裸小鼠新品系-Foxn1nu.B6-CAG-EGFP|SU,Pep3为b型是有别于Foxn1nu裸小鼠的生化遗传标记位点。     

人sCD40L转基因小鼠模型的构建

目的研究阻断CD40-CD40L共刺激信号通路对移植皮肤免疫排斥反应的影响。方法通过RT-PCR技术克隆了呈可溶性表达的CD40L分子胞外区(sCD40L),利用K14启动子构建了sCD40L皮肤特异性表达载体,并利用该载体制备了转基因小鼠。结果所克隆的CD40L胞外区片段其大小及序列符合预期;以哺乳动物表达载体PCI为骨架,通过DNA重组,获得了含K14启动子和sCD40L编码区的皮肤特异性表达载体K14-sCD40L;通过显微注射和胚胎移植,PCR筛选检测:49只G0代小鼠有1只小鼠扩增出特异性条带,阴性对照无条带。结论成功建立sCD40L转基因阳性小鼠。     

DXB／c近交系小鼠的建立及遗传学检测

将ＤＢＡ／２雌鼠与Ｃ５７ＢＬ／６雄鼠杂交后，利用其Ｆ２代中结进行兄妹交配，建立了ＤＸＢ／ｃ近交系小鼠。目前已近交２８代，历时１３年，经皮肤移植试验、下颌骨形态分析、混合淋巴细胞培养、毛色基因及生化标志基因检测，表明ＤＸＢ／ｃ系小鼠的基因已经纯合，符合一个近交系小鼠的标准，毛色基因及生化标志基因测试结果同时表明ＤＸＢ／ｃ系小鼠的遗传背景组合了两亲代品系的遗传基因。     

钙蛋白酶抑制蛋白转基因小鼠的构建和鉴定

目的 将人的钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin,CAST）外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建高表达CAST的转基因小鼠模型。方法 利用Gateway技术构建pRP.EX3d-EF1A-CAST-IRES-eGFP载体,回收片段后通过显微注射法将目的基因片段注入到C57BL/6J小鼠受精卵中,将其胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内获得子代小鼠。采用PCR方法鉴定出阳性的转基因小鼠,确定首建鼠,通过与C57BL/6J小鼠回交后互交数代建系。利用RT-PCR和Western blotting方法检测CAST基因和蛋白在各组织中的表达情况。结果 将90枚注射受精卵移植到3只假孕鼠中,3只均怀孕,移植成功率100%,产下23只子鼠,经PCR鉴定得到2只转基因阳性首建鼠,阳性率为9%。子代小鼠进行RT-PCR检查显示,CAST基因在转基因小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌中均有表达;Western blotting检查显示,CAST蛋白表达在转基因小鼠中显著高于同窝阴性小鼠。结论 通过显微注射法成功构建CAST高表达的转基因小鼠,为进一步研究CAST奠定了良好的模型基础。     

枸杞多糖对自发乳腺癌MMTV-PyMT小鼠肿瘤生长和转移的作用

目的 以MMTV-PyMT小鼠为乳腺癌模型探讨枸杞多糖对乳腺癌生长和转移的作用。方法 扩群鉴定转基因自发乳腺癌MMTV-PyMT小鼠,将阳性雌性小鼠随机分为LBP组和对照组,每组8只,小鼠8周龄时给药,LBP组给予LBP（50 mg/kg,腹腔注射）治疗,对照组给予生理盐水,每2 d给药一次测量肿瘤体积一次,4周后脱臼处死,肺Bouin’s溶液固定后观察肺表面转移结节数目,肿瘤组织固定包埋后免疫组化法检测肿瘤细胞增殖及血管密度。结果 MMTV-PyMT阳性小鼠成瘤率100%,与对照组相比,LBP组的肿瘤重量（4.208±0.4463 g）明显地比对照组（6.477±0.3724 g）轻,肿瘤体积也明显比对照组小;LBP组肺表面结节数目（12±1.155个）明显比对照组（20±2.745个）少,免疫组化染色结果显示LBP组肿瘤组织中细胞增殖数目及微血管密度明显比对照组少。结论 枸杞多糖可通过抑制MMTV-PyMT小鼠乳腺癌的生长和转移,并抑制肿瘤细胞增殖和血管新生,MMTV-PyMT小鼠可作为乳腺癌肺转移模型运用于抗肿瘤药物研究。     

甘丙肽过表达转基因小鼠的制作和鉴定

目的 建立甘丙肽（galanin,GAL）过表达转基因小鼠,为后续研究甘丙肽基因功能提供动物模型. 方法 重组质粒PDGFβ-GAL经XbaⅠ、HindⅢ双酶切后,将连接有启动子的甘丙肽基因片段回收纯化,用显微注射法将甘丙肽基因注入400枚受精卵的雄原核中,选取发育正常的受精卵移植到假孕母鼠的输卵管壶腹部,待其产仔.用PCR方法鉴定子代小鼠基因型,蛋白印迹分析（Western blot）鉴定子代小鼠体内GAL蛋白表达情况. 结果 获得子代小鼠50只,有8只小鼠在基因组上整合有GAL基因,整合率为16％：Western blot显示转入的基因片段PDGF β-GAL在脑组织中的表达水平比肝组织高.结论 通过显微注射法成功建立了GAL过表达转基因小鼠模型.     

小鼠耳蜗组织NT3基因的克隆及其原核表达鉴定

目的：克隆小鼠耳蜗组织中重要神经营养因子NT3的基因,并对其进行原核表达鉴定,为进一步研究该基因对内耳听觉功能的影响以及对耳聋的基因治疗提供基础。方法：根据所设计的引物用RT－PCR方法扩增目的基因,克隆人pUC19载体,行酶切鉴定和测序;然后进一步克隆人原核表达载体pDH,温度诱导表达,SDS－PAGE检测表达产物。结果：RT－PCR得到长度为777bp的基因片段,克隆后酶切鉴定正确,测序结果经BLAST对比,与GenBank中小鼠NT－3序列完全一致。成功构建了原核表达载体,经温度诱导表达出NT3蛋白。结论：从耳蜗组织中能获得正确的NT3基因克隆以及稳定的原核表达,为后续实验提供了保证。     

具有人免疫系统和异体人黑色素瘤生长的人源化小鼠 模型的构建和鉴定

目的：构建同时具有人免疫系统和人肿瘤生长的人源化小鼠模型,为人肿瘤免疫研究和临床肿瘤免疫药物药效评估提供依据。方法：通过给予重度免疫缺陷NOD/SCID IL2rg-/-小鼠亚致死剂量辐照,联合小鼠肾被膜下移植人胚胎胸腺组织和静脉输注CD34⁺胎肝细胞,构建具有人免疫系统重建的人源化小鼠。构建人源化小鼠模型后3周开始,每3周采集外周血监测人免疫细胞重建情况,包括CD45⁺、CD33⁺、CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺、CD56⁺细胞比例。构建人源化小鼠模型后,第15周给予小鼠皮下接种人A375黑色素瘤细胞,每5 d测量肿瘤体积。接种6周后处死小鼠,流式细胞术检测人源化小鼠外周血、骨髓、淋巴结、脾脏及肿瘤组织中人免疫细胞的组成和表型。免疫组织化学法检测人源化小鼠肿瘤组织中人免疫细胞的组成和表型。结果：在人源化15周时,人源化小鼠模型外周血中人T细胞比例为（33.53±8.57）%、B细胞比例为（43.33±10.05）%。在A375细胞接种后前3周,人黑色素瘤生长较慢,其后加速生长,6周时肿瘤体积达（1 564±334.3） mm³。免疫组织化学和流式细胞术检测,人黑色素瘤内有大量以CD8⁺ T细胞为主的人T细胞浸润;肿瘤组织中CD8⁺/CD4⁺比值明显高于外周血、骨髓、淋巴结和脾脏（P<0.01）。PD-1分子在肿瘤浸润人CD4⁺ T和CD8⁺ T细胞中的表达水平明显高于其在外周血和免疫器官中的水平。结论：成功建立了具有人类免疫系统和异体人黑色素瘤生长的人源化小鼠模型,并在其外周血、淋巴器官以及人肿瘤组织中均检测到包括人T细胞和人B细胞在内的高水平人CD45⁺免疫细胞。