黄体生成素在人类卵母细胞和种植前胚胎的表达

[目的]研究人类卵母细胞和种植前胚胎黄体生成素的表达.[方法]应用免疫荧光标记激光共聚焦显微镜方法对不成熟和成熟卵母细胞及种植前胚胎进行黄体生成素表达的观察.[结果]人类卵母细胞和种植前胚胎均存在黄体生成素的表达.不成熟和成熟卵母细胞及2～8细胞期种植前胚胎阶段主要分布在细胞膜;桑葚胚和囊胚阶段分布在细胞膜和细胞浆.多精受精组和正常受精组、新鲜胚胎组和冻融胚胎组黄体生成素的表达没有差异.[结论]人类卵母细胞和种植前胚胎存在黄体生成素的表达.黄体生成素可能以旁或/和自分泌方式影响人类卵母细胞和胚胎发育,并在种植过程胚胎与母体子宫内膜的对话中起直接作用.     

TLI筛选猪胚胎初次卵裂时间以预测早期胚胎发育

目的 研究猪孤雌激活胚胎初次卵裂时间对早期胚胎发育潜能的影响,以筛选最优胚胎.方法 将猪卵母细胞进行体外成熟培养,孤雌激活后,胚胎采用时差成像系统(TLI)筛选,分为早期卵裂组(<24 h)、中期卵裂组(24～30 h)和晚期卵裂组(30～48 h).各组分开培养至囊胚期,统计比较各组的桑椹胚率和囊胚率,并对囊胚中凋亡相关基因Bcl-2、Bax、P53和细胞周期蛋白Cyclin B1、Cdk1、Cdk2的表达水平进行检测.结果 早期卵裂组桑葚胚率、囊胚率高于中期卵裂组(P<0.05)和晚期卵裂组(P<0.01);凋亡相关基因Bax、P53表达在早期卵裂组中显著低于中期和晚期卵裂组(P<0.01),而抗凋亡基因Bcl-2表达则显著高于中期和晚期卵裂组(P<0.01);早期卵裂组细胞周期蛋白Cyclin B1、Cdk1和Cdk2的表达显著高于中期和晚期卵裂组(P<0.05).结论 猪孤雌激活胚胎初次卵裂时间较早的胚胎具有较高的发育潜能,利用TLI确定的初次卵裂时间可作为筛选优质胚胎的重要参数.     

激光法活检对小鼠体外受精胚胎后期发育的影响

目的探讨激光法活检技术对胚胎早期发育的影响。方法对促排卵获取的小鼠卵母细胞进行体外受精和培养,然后用激光法活检收集的4细胞和8细胞胚胎,最后观察活检后胚胎的发育情况。结果共获卵母细胞360枚,受精率和卵裂率分别为92.0%和94.3%。4-细胞胚胎活检组的囊胚形成率及孵出囊胚率分别为76.6%和65.6%,8-细胞胚胎活检组的囊胚形成率及孵出囊胚率为70.4%和59.3%,分别与未活检对照组相比,差异无显著性(P>0.05);4-细胞活检组和8-细胞活检组的囊胚形成率及孵出囊胚率间相比较,差异也无显著性(P>0.05)。结论激光法对小鼠4细胞或8细胞胚胎进行单卵裂球活检,不影响胚胎的后期发育,是一项有效的胚胎卵裂球活检方法。     

钙离子载体A23187联合嘌呤霉素对人体外成熟卵母细胞孤雌激活作用的研究

目的：探讨钙离子载体A23187或联合嘌呤霉素（puromyein）对人类体外成熟卵母细胞的孤雌激活作用。方法：收集体外培养成熟的人卵母细胞124枚,根据体外成熟培养的时间分为24、48、72h组。分别采用A23187、A23187联合嘌呤霉素进行孤雌激活,然后应用荧光原位杂交（FISH）技术对孤雌胚胎进行性染色体分析。结果：A23187或联合嘌呤霉素能激活体外成熟的卵母细胞．激活率分别为38．9％、71．8％;二者联合应用能有效地提高孤雌胚胎的发育潜能。随着体外成熟培养的时间延长．A23187联合嘌呤霉素对卵母细胞激活率呈下降趋势;其中24、48h组成熟的卵母细胞激活率和胚胎发育潜能显高于72h组。FISH对9个孤雌胚胎的性染色体分析示,7个孤雌胚胎为XX,2个为X。结论：钙离子载体A23187联合嘌呤霉素能有效地激活人体外成熟卵母细胞．形成的孤雌胚胎核型多数为双倍体。     

人卵母细胞孤雌激活获得囊胚国内首报

孤雌激活是对卵母细胞在第二次减数分裂中期（MII）进行刺激，使之保持二倍体状态下发生有丝分裂获得早期胚胎发育。人卵母细胞孤雌激活后获得的囊胚，可为人类干细胞建系提供崭新的来源，由此产生的胚胎干细胞称为孤雌胚胎干细胞。此研究已在许多哺乳动物物种中进行，如小鼠、牛、猴已获得囊胚，并在小鼠和猴成功进行了干细胞建系，目前成为国科学家的关注与研究热点。     

不同时期和不同来源鼠胚玻璃化冷冻效果的比较

目的：比较不同时期、不同来源的鼠胚玻璃化冷冻的存活率以及发育为囊胚的成功率。方法：采用体外受精和体内受精的方式得到小鼠的2、4、8细胞期胚胎,对其进行玻璃化冷冻、解冻,观察胚胎的存活与囊胚形成,以未冷冻的胚胎作为对照组。结果：由体外受精和体内受精获得的2细胞期胚胎在冷冻复苏后的存活率分别为70.67%、72.06%,囊胚形成率分别为65.33%、67.62%;4细胞期胚胎冷冻复苏后的存活率分别为88%、89.71%,囊胚形成率分别为81.33%、83.82%;8细胞期胚胎冷冻复苏后的存活率分别为93.33%、94.12%,囊胚形成率分别为92%、94.12%。和对照组相比,2细胞和4细胞期胚胎冷冻复苏后囊胚形成率差异有统计学意义（P＜0.05）,而8细胞期的胚胎差异无统计学意义（P>0.05）。不同时期胚胎冷冻复苏后囊胚形成率间差异有统计学意义（P＜0.05）,受精方式对处于同一时期的胚胎在冷冻复苏后存活率和囊胚形成率均无明显影响。 结论：玻璃化冷冻可以作为小鼠胚胎保存的有效方法,相对2、4细胞期胚胎,冷冻效果最好的是8细胞期胚胎。     

人卵母细胞孤雌激活获得囊胚国内首报

孤雌激活是对卵母细胞在第二次减数分裂中期(MII)进行刺激,使之保持二倍体状态下发生有丝分裂获得早期胚胎发育.人卵母细胞孤雌激活后获得的囊胚,可为人类干细胞建系提供崭新的来源,由此产生的胚胎干细胞称为孤雌胚胎干细胞.此研究已在许多哺乳动物物种中进行,如小鼠、牛、猴已获得囊胚,并在小鼠和猴成功进行了干细胞建系,目前成为多国科学家的关注与研究热点.     

小鼠体外受精、胚胎培养及胚胎快速冷冻的研究

目的　为扩大胚胎来源并获取特定胚龄胚胎 ,建立小鼠冷冻胚胎库。方法　运用超数排卵、体外受精与胚胎培养及胚胎冷冻技术系统研究了小鼠受精卵的体内发育与运行规律。卵母细胞的体外成熟与受精、单细胞胚胎培养及胚胎快速冷冻。结果　 (1)注射hCG后 12～ 2 0h受精卵发育至原核期 ,4 2～ 4 8h为 2 细胞期 ,4 8～ 6 0h为 4 细胞期 ,6 0～ 6 8h为 8 细胞期 ,以上各期受精卵均处于输卵管中 ;75～ 78h为桑椹胚 ,78～ 80h为致密桑椹胚 ,90～ 92h为早期囊胚 ,92～ 96h为囊胚 ,以上各期均处于子宫角中。 (2 )培养液中添加促性腺激素 (FSH与hCG) ,能显著提高卵母细胞的体外受精率 ,添加FCS和激素组的体外受精率又显著高于单独添加激素组 ,FCS还能显著提高胚胎发育。 (3)在培养液中添加EDTA ,能有效克服小鼠胚胎的 2 细胞阻断 ,其 2 细胞胚的发育率达 10 0 % ,8 细胞胚发育率达 5 5 %以上 ;牛、羊上皮细胞培养液上清也能有效克服 2 细胞阻断。添加乳酸钠和丙酮酸钠可使 2细胞与 8细胞期胚的发育率显著提高。 (4)以D PBS +甘油 +蔗糖为冷冻液 ,以D PBS +蔗糖为稀释液 ,对小鼠胚胎进行快速冷冻 ,桑椹胚的存活率为 6 9 3% ,早期囊胚的存活率为 6 0 4 %。结论　研究为将生物技术应用于小鼠 ,扩大卵子和胚胎来源     

重复促排卵对小鼠卵母细胞发育潜能的影响

目的 研究重复促排卵治疗对成熟卵母细胞的发育潜能的影响,其与卵母细胞生长分化因子-9(GDF-9)表达是否存在关联.方法 实验组昆明小鼠接受孕马血清和人绒毛膜促性腺激素重复3次促排卵,对照组接受3次生理盐水注射,其后两组同时接受促排卵得到成熟卵世细胞并分别进行GDF-9免疫组化染色和体外受精胚胎培养,比较两组卵母细胞GDF-9表达量和受精后卵裂率、囊胚形成率.结果 实验组得到成熟卵母细胞253个,平均每只鼠11.5个;对照组共得到521个,平均每只鼠32.6个(p<0.05);实验组GDF-9染色平均光度(0.60±1.32)×104,积分光度(2.54×2.10)×104;对照组平均光度(4.81±2.65)×104,积分光度(10.20±2.33)×104(P<0.05,P<0.01);实验组成熟卵母细胞受精后卵裂率85.6%,对照组卵裂率88.8%,无统计学差异;实验组囊胚形成率20.8%,明显低于对照组囊胚形成率35.2%(P<0.01).结论 昆明小鼠经重复促排卵后排卵数目减少,GDF-9表达下降,囊胚形成率下降,重复促排卵影响卵母细胞的发育潜能,可能与GDF-9表达改变有关.     

应用小鼠早期胚胎活性因子诱导小鼠成纤维细胞再程序化为多能干细胞的实验研究

目的:研究并建立应用早期胚胎活性因子诱导成体细胞再程序化的实验体系。方法:通过体外受精方法大量收集小鼠3.5 d囊胚,从小鼠囊胚中提取早期胚胎蛋白,加入到小鼠成纤维细胞培养体系中,诱导其再程序化为多能干细胞。对得到的多能干细胞采用PCR鉴定Oct3/4基因表达;在诱导多能干细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞后,采用油红O及茜素红染色确定其多向分化潜能。结果:诱导再程序化后获得的多能干细胞能够长期传代培养,表达干细胞特异性基因Oct3/4,采用油红O及茜素红染色确定其具有向脂肪和成骨诱导分化潜能。结论:本研究成功应用小鼠囊胚活性因子诱导小鼠成纤维细胞再程序化生成小鼠多能干细胞。     

利用废弃胚胎行人原核移植方法的初步建立

 【目的】 探索利用废弃胚胎进行人原核移植的方案?【方法】 收集废弃多原核受精卵117个?用显微操作-电融合的方法构建原核移植重构胚胎?分别比较钙离子浓度0.05 mmol/L(n=39)和0.1 mmol/L(n=58)的两种电融合液以及电压分别为1 800 V/cm(n=58)和2 000 V/cm(n=20)的两种电场条件对重构合子融合率和发育的影响?【结果】 操作成功率70.1%,融合成功率59.8%,得到43个卵裂胚胎,其中23个(53.5%)6细胞以上胚胎?共14个重构胚发育至8细胞或以上,得到3个囊胚?将电压由2 000 V/cm下降到1 800 V/cm,重构胚胎融合率?卵裂率和囊胚率的差异没有统计学意义(P > 0.05),但6-细胞率明显上升(22.2% vs. 60.9%, P < 0.05)?和钙离子浓度为0.05 mmol/L的融合液比较,0.1 mmol/L的融合液融合率明显上升(39.3% vs. 69.0%,P < 0.05),卵裂率?6-细胞率和囊胚率皆无统计学差异(P > 0.05)?【结论】 通过显微操作-电融合的方法,用废弃胚胎重构人核-质异质的胚胎模型,是可行的?经济的?     

昆明小鼠卵子的体外受精及其新培养系统的建立

本研究首次将CZB培养液应用于昆明小鼠早期胚胎的培养，建立了一个可行的胚胎体外培养的新方法，采用昆明种成熟雄鼠附睾尾部精子与常规超排法得到的卵子在TYH培养液中进行体外受精后，将卵子分别移入WM和CZB培养液中进行发育培养。WM中的胚胎发生阻滞而未能继续发育；CZB培养液中的胚胎有79%发育至4细胞期，81%的胚胎发育至桑椹胚阶段，突破了胚胎培养中存在的“2细胞阻滞”现象。而于胚胎培养的不同阶段向培养液中添加葡萄糖也未表现出明显的作用。表明在昆明小鼠胚胎培养的早期阶段，葡萄糖并非一种重要的营养物质。     

不同来源小鼠胚胎培养在辅助生殖实验室质量控制中的应用

目的:利用小鼠胚胎体外培养技术对新建人类辅助生殖实验室进行质量控制,以保证培养体系的可靠性,并比较两种小鼠胚胎培养方法在实验室质量控制中的作用。方法:采用小鼠配子体外授精法和2-细胞胚胎收集法对胚胎进行培养,观察胚胎发育情况。结果:小鼠配子体外授精法的受精率为80.98%,受精卵的卵裂率、优质胚胎率及囊胚形成率分别为90.60%、68.15%、85.93%与收集的体内2-细胞卵胚胎的88.98%、70.33%、83.89%比较无显著性差异,P>0.05。结论:两种不同来源鼠胚培养方法均可作为实验室培养体系检测的评价指标。对于新建的胚胎培养实验室,小鼠配子体外授精法可对IVF的全过程进行检测,更能反映培养体系对胚胎的影响,同时还可熟练IVF的操作技能。     

体外受精患者精子 miRNA-21，miRNA-34c，miRNA-140，miRNA-375 与胚胎质量的相关性研究

目的：通过检测不同胚胎质量的体外受精(in vitro fertilization，IVF)患者精子miRNA-21，miRNA-34c， miRNA-140，miRNA-375的表达情况，探讨精子来源的miRNAs与胚胎质量的相关性。方法：选择2012年9月至12月在 中南大学湘雅医院生殖医学中心行IVF治疗原发不育的男性患者44例，收集 IVF取卵当日剩余新鲜精液标本，采用实 时荧光定量PCR测定精子miRNAs(miRNA-21，miRNA-34c，miRNA-140，miRNA-375)的表达水平。观察胚胎情况后分 组，第3天胚胎评分的平均值<8分为实验组，≥8分为对照组。比较实验组和对照组患者一般情况及实验室资料，分 析精子miRNAs表达水平与胚胎质量的相关性。结果：实验组精子miRNA-21，miRNA-34c，miRNA-140，miRNA-375 表达水平低于对照组(P<0.01)。实验组与对照组的获卵数、减数分裂II期(metaphase II，MII)卵子数、双原核(dual pronuclear，2PN)受精数、卵裂数、受精率差异无统计学意义(P>0.05)；实验组卵裂率低于对照组(P<0.05)。精子 miRNA-21，miRNA-34c，miRNA-140，miRNA-375表达水平与第2，3天胚胎碎片率呈负相关，与第3天胚胎卵裂球数呈 正相关，与胚胎评分呈正相关。结论：精子miRNA-21，miRNA-34c，miRNA-140，miRNA-375的表达水平上升可能影 响卵裂期胚胎质量，对胚胎发育可能起一定的积极作用。     

Effects of Placental Isoferritin on the Mouse Embryo Development in vitro

To investigate the effect of placental isoferritin （PLF） on mouse embryo development in vitro, mice 2-cell embryos were co-cultured with human first trimester decidual cells at different concentrations of PLF in vitro. The following changes of the above system were observed under an invert microscope and the number of embryos were recorded and the embryos were classified. The results showed there was no significant difference in the percentage of embryos development to 4-cell 8-cell and morula （P〉0.05）. PLF at the doses of 10 and 100 U/mL significantly enhanced more embryos development to the blastocyst and hatching blastocyst （P〈0.05）. PLF at the dose of 1000 U/mL depressed more embryos development from 2-cell to hatching blastocyst, meanwhile such phenomena as cell degeneration and irregular cleavage were observed in part of embryos, but there was no significant difference in statistics （P〉0.05）. It was concluded that PLF at the concentration of 10-- 100 U/mL had no significant effects on the early development of mice embryos, however, PLF could promote the growth, differentiation, and hatching of preimplantion blastocysts.     

活血消异方对子宫内膜异位症模型小鼠体外受精胚胎发育的影响

目的 评估活血消异方子宫内膜异位症模型小鼠体外受精胚胎发育的影响。方法 通过体外受精的方法, 观察中药组、模型组和假手术组的小鼠的促排卵数、受精率、二细胞分裂率、四细胞分裂率、桑葚胚形成率及最终桑葚胚形成率, 观察对子宫内膜异位症模型小鼠体外受精胚胎发育的影响。探讨内异症对小鼠体外受精后胚胎发育的影响及活血消异方对胚胎发育的作用。结果 中药组、模型组和假手术组, 共三组。三组的平均促排卵数、体外受精率和二细胞分裂率差异有显著性意义(P<0.05), 平均促排卵数、体外受精率和二细胞分裂率由高到低均依次为假手术组、中药组和模型组;三组的四细胞分裂率差异有显著性意义(P<0.05), 桑葚胚形成率差异无显著性差异(P>0.05), 桑葚胚最终形成率差异有显著性差异(P<0.05)。结论 子宫内膜异位症可降低模型小鼠促排卵数、体外受精率及卵裂率, 影响胚胎发育质量,活血消异方可改善胚胎发育质量。     

C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎冷冻保种技术研究

目的 建立C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎的冷冻保种技术.方法 通过直接收集体内发育的2-细胞胚或者通过体外受精方法获得2-细胞胚,采用玻璃化冷冻法冷冻、复苏、移植,后代经PCR检测.结果 体内发育至2细胞期胚胎90枚,解冻后的平均复苏率是67.78％,移植产仔率是21.31％,后代的阳性率是23.08％;体外受精的2细胞期胚胎203枚,解冻复苏60枚,平均复苏率是63.33％,移植产仔率是15.78％,后代的阳性率是33.33％.结论 两种胚胎冷冻途径均获得了C57-ras癌症转基因动物模型阳性小鼠,建立了该模型动物的低温保存方法.     

在小鼠着床前胚胎中c-myc的表达

目的: 观察小鼠着床前胚胎细胞中c-myc基因的表达, 了解其对早期胚胎发育可能影响的作用. 方法: 采用原位杂交及免疫组织化学ABC法,分别检测小鼠着床前胚胎细胞中c-myc mRNA及c-myc蛋白. 结果: 在小鼠2细胞、4细胞、6细胞、8细胞和囊胚期胚细胞中均检测到原癌基因c-myc转录产物的表达,c-myc mRNA分布于胚细胞的胞质和胞核. 免疫组织化学方法也发现,2细胞至囊胚期胚胎细胞的 c-myc蛋白均呈免疫反应阳性, 阳性物质分布于胞质和胞核中, 胚胎透明带则呈阴性反应. 结论: 小鼠早期胚胎有c-myc基因表达,c-myc基因对小鼠着床前胚胎发育可能起重要调节作用.     

小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育

[目的]观察小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育.[方法]昆明小鼠超排后获取体内成熟卵母细胞及卵丘细胞.成熟卵子去核后用将卵丘细胞核与精子直接注入,观察其受精和胚胎发育情况.[结果]卵子去核存活率为75.9%(362/477),注核存活率为39.8%(143/359),D1存活率为38.4%(138/359).39.9%(57/143)重构卵子成功排出一个极体并形成两原核,其卵裂率为80.7%(46/57).大部分重构胚发育到2～3细胞停滞,其中2个分裂至4细胞,无囊胚形成.[结论]将小鼠卵丘细胞核、精子同时移植到小鼠的体内成熟卵浆中,可以诱导极体排出,形成2原核 1极体的重构胚胎.重构胚胎大部分发育到2～3细胞即发生停滞,最多到达4细胞期,发育潜能差.     

不同体外受精周期所获生殖泡期卵母细胞体外 成熟后结果比较

 【目的】 研究对比体外受精-单精子卵胞浆内注射(IVF-ICSI)周期所获生殖泡期(GV)不成熟卵母细胞以及体外成熟(IVM)周期所获GV期卵母细胞体外培养成熟后的胚胎发育情况&#65377;【方法】 163个IVF-ICSI周期中所获987个成熟卵为Ⅰ组,所获GV期卵进行体外培养后成熟的132个卵为Ⅱ组, 另有37个IVM周期中所获GV期卵体外培养后成熟的235个卵为Ⅲ组&#65377;对3组均进行ICSI,并对其受精率&#65380;卵裂率及胚胎发育进行比较&#65377;【结果】 Ⅰ组的受精率&#65380;卵裂率以及优质胚胎率均显著高于Ⅱ组及Ⅲ组(分别为84.9%,98.1%和61.6%;72.0%,90.5%和22.1%; 75.3%,94.4%和25.1%)&#65377;Ⅰ组的胚胎卵裂球数目及胚胎形态评分均显著优于Ⅱ组及Ⅲ组(P < 0.05);Ⅱ组与Ⅲ组相比差异无统计学意义&#65377; 【结论】 体内成熟卵形成的胚胎形态好于生殖泡期卵体外培养成熟者,IVF-ICSI周期的生殖泡期不成熟卵形成的胚胎形态学上与IVM周期的类似&#65377;