版纳微型猪近交系GHR基因克隆及生物信息学分析

目的 获得版纳微型猪近交系（BMI）生长激素受体基因（GHR）序列,通过生物信息学分析预测GHR功能并进行GHR mRNA多组织表达谱分析。方法 以版纳微型猪近交系的肝脏组织为材料提取RNA,RT-PCR方法扩增GHR基因编码区序列,将序列连接至pMD18-T载体进行克隆、测序和生物信息学分析;半定量PCR检测GHR mRNA在BMI不同组织中表达量的差异。结果 克隆出了BMI GHR 编码区序列,提交GenBank获得登录号KC999114。该基因CDS长1917 bp,编码638个氨基酸。生物信息学分析表明,与长白猪的GHR序列相比BMI存在4处氨基酸替换,分别为p. E381D、p. A409S、p. L556V和p. A580G,均发生在胞内域。GHR基因多组织表达谱分析显示：GHR mRNA几乎在各组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在小肠、心、肝、神经纤维、脾、卵巢中表达量较高,在肺、胃、大脑、胰和肾中的表达量较低。结论 成功克隆了版纳微型猪近交系GHR全长编码区序列,进行了生物信息学功能分析和组织表达谱分析,为进一步阐明版纳微型猪近交系生长矮小机理奠定了基础。     

版纳微型猪近交系AQP3克隆、序列分析及组织表达

目的 克隆版纳微型猪近交系aquaporin 3(AQP3)基因,并利用生物信息学方法分析其序列特征,研究其在猪各组织中的表达情况.方法 从版纳微型猪近交系脾脏中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增猪AQP3编码区序列,将纯化的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH 5α,筛选阳性克隆进行测序.并采用半定量RT-PCR方法分析版纳微型猪近交系不同组织中AQP3基因的表达情况.结果 成功克隆出AQP3基因编码区全长873 bp的序列,GenBank登录号为HQ888860,其编码290个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,与牛的AQP3基因同源性最大,达99％.多组织半定量RT-PCR研究表明AQP3 mRNA在BMI猪的脾脏、肾脏、肺、小肠中均有表达,其中脾脏中表达最高.结论 成功克隆出了版纳微型猪近交系AQP3基因全长编码区,并对其编码的蛋白质功能进行了预测,为进一步的功能研究奠定了基础.     

肥厚性心肌病模型及版纳微型猪近交系的应用

本文综述了肥厚性心肌病发病机制和肥厚性心肌病动物模型的应用情况。介绍了版纳微型猪近交系独特的近交背景和在解剖学上与人类接近的特点,并探讨了将版纳微型猪近交系应用于人类肥厚性心肌病动物模型研究的前景。     

版纳微型猪近交系SRY基因编码区序列克隆及生物信息学分析

目的获得版纳微型猪近交系(BMI)SRY基因编码区序列并进行分子系统进化研究。方法以看家基因GAPDH为内参,对BMI猪的SRY基因编码区序列进行PCR扩增、克隆和序列分析,并应用Lasergene、Bi-oEdit、ClustalX、MEGA等生物信息学软件同鲸鱼、海豚、鹿、绵羊、牛、海豹、马、海象、熊猫、人、驴、熊、猫、虎和美洲豹等15个物种相应SRY编码区核苷酸序列和氨基酸序列进行了比对分析,在此基础上采用NJ和ME法对其编码区氨基酸序列构建了分子系统进化树。结果 BMI猪SRY基因编码区序列长711 bp,编码236个氨基酸,GenBank登录号为GU991615。BMI猪与鲸鱼、海豚、鹿、绵羊、牛、海豹、马、海象、熊猫、人、驴、熊、猫、虎和美洲豹的SRY基因编码区核苷酸序列相似性分别为83.7%、82.8%、78.4%、78.0%、76.9%、73.3%、73.1%、73.0%、72.9%、72.7%、72.7%、72.2%、71.6%、71.3%、70.8%,相应的氨基酸序列相似性分别为72.8%、54.5%、67.3%、64.5%、61.5%、61.9%、59.5%、61.4%、62.0%、59...     

版纳微型猪近交系TNF-α基因mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的 快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要基因TNF-α的表达情况,构建TNF-α基因及内参GAPDH基因荧光定量PCR质粒标准品.方法 利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪建立动物模型,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物.进行RT-PCR扩增.纯化目的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR,生成标准曲线.结果 建立的TNF-α基因和GAPDH内参基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法灵敏度分别可达10<''3>和10<''5>拷贝,线性范围分别为10<''3>～10<''9>和10<''5>～10<''9>拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在的线性关系R<''2>分别为0.993和0.999,扩增效率E分别为111.073%和95.948%.结论 成功的构建了版纳微型猪近交系TNF-α基因质粒标准品和标准曲线,并用内参基因GAPDH进行校正,此方法可为探讨TNF-α基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础.     

猪内源性逆转录病毒基因在版纳微型猪近交系骨髓间充质干细胞永生细胞系的整合和表达研究

目的 检测猪内源性逆转录病毒（PERV）在猪细胞长期传代过程中的基因整合和表达。方法 通过提取已建立的版纳微型猪近交系（BMI）骨髓问充质干细胞（MSCs）永生细胞系的DNA及细胞总RNA,用PCR、RT—PCR方法检测PERV前病毒gag、pol和env基因的整合和表达,并对PERV的亚型进行鉴定。结果 从原代BMI—MSCs至连续传代到150、180代的BMI—MSCs细胞基因组中都检测到了PERV前病毒DNA的整合及其mRNA的表达．PERV亚型为PERV—A、B型。结论 PERV在BMI近交过程中及猪细胞体外长期传代过程中均未消扔,PFRV基因已经整合入其天然宿主的基因组内并能稳定表达。     

版纳微型猪的生物学特性

版纳微型猪原产于云南省西双版纳州,属华南型猪种。为了发掘和利用本省小型猪资源,1987年5月从西双版纳州属3个县的原始产区引进了8头公猪和42头母猪到州种猪场饲养和选育。3年来对微型猪的繁殖性能、生长发育、生理生化、遗传特征、适应性和采食量等10个方面近150个性状参数进行了测定和分析,结果表明6月龄公猪的体重、体高和体长分别为13.10±0.40kg、32.34±0.36cm和54.59±0.79cm,母猪分别为17.21±0.42kg、34.40±0.24cm和58.52±0.60cm;成年公猪体重为36.12±1.09kg,母猪为43.29±1.04kg。微型猪性成熟早,4～6月龄即可配种繁殖,经产母猪平均每窝产活仔7.84±0.39头。同时,还测定了不同年龄阶段用作实验的离体部位、器官和腺体的重量,为微型猪的实验应用提供基本参数。3年来选育结果表明,微型猪的体型矮小和生长缓慢特点能稳定遗传,与体型有关的性状遗传力达到中等或中等以上,性状间也存在中等的遗传相关(r_A(xy)为0.35～0.64),13个胸椎和5个腰椎的个体频率分别为32.14％和21.43％。     

中国版纳近交系小型猪心脏异种抗表位α1,3—Gal的分布

目的：研究中国版纳小型猪心脏的异种抗原α1,3-Gal的分布和半宣分析，为小型猪心脏的转基因和异种移植提供资料。方法：通过亲和免疫组织化学法和图像分析对10头版纳小型猪心脏进行α1,3-Gal的分布和半定量研究。结果：α1,3-Gal分布，心肌细胞未发现α1,3-Gal分布。半定量分析发现α1,3-Gal表达量心房内膜最多，心肌间质最少。结论：异种抗原α1,3-Gal在心脏中的表达存在较大差异，提示可以通过转基因猪来克服超急性异种排斥反应。     

重组版纳微型猪近交系复合骨修复犬桡骨缺损的早期观察

目的:评价重组版纳微型猪近交系复合骨早期修复大型动物节段性骨缺损的能力.方法:制定版纳微型猪近交系骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)块型重组合异种骨(micro-porcine massive reconstituted bonexenograft,mpMRBX)及牛块型重组合异种骨(bovinemassive reconstituted bone xenograft,bMRBX),采用27只犬桡骨中段20mm骨-骨膜缺损修复模型.动物随机分为mpMRBX组、bMRBX对照组、空白对照组,于术后1周、2周、4周行骨缺损部X线摄片,术前及处死前采集静脉血行免疫学检查,局部取材行HE染色,取材组织RNA抽提,RT-PCR检…     

中国近交系版纳微型猪α1,3-半乳糖基转移酶基因剪接变异体的克隆及其在人类细胞中的表达

目的克隆中国近交系版纳微型猪(Chinese Banna Minipig Inbred Line,BMI)的α1,3-半乳糖基转移酶(α1,3-GT)基因并分离其剪接变异体,构建其真核表达载体并观察BMIα1,3-GT基因在人肺腺癌A549细胞中的表达和功能。方法提取BMI肝组织总RNA,RT-PCR扩增全长的α1,3-GTcDNA,并克隆到pMD18-T载体,挑选15个阳性克隆进行测序,获得GT1、GT2两种基因剪接变异体。将GT1、GT2克隆到pEGFP-N1上构建其真核表达载体,分别命名为pN-GT1、pN-GT2。将pN-GT1、pN-GT2分别转染人肺腺癌A549细胞,RT-PCR检测转染细胞中α1,3-GT mRNA的表达,倒置荧光显微镜和流式细胞术观察转染细胞上α-半乳糖基(α-Gal)的表达,流式细胞术检测人血清中IgM抗体和补体C3与转染细胞上α-Gal的结合。结果在BMI中发现了碱基长度为1116bp和1080bp的两个α1,3-GT基因剪接变异体,后者缺失了外显子5。pN-GT1或pN-GT2转染的A549细胞中,均检测到了α1,3-GT mRNA和α-Gal的表达,转染细胞膜上也检测到IgM和C3的沉积,且两种转染细胞中α-Gal的表达及IgM和C3的沉积没有差异(P>0.05)。结论成功克隆了BMI的α1,3-GT基因,并发现两种α1,3-GT基因剪接变异体。两种基因剪接变异体转染的细胞中,均检测到α1,3-GT mRNA的表达且α1,3-GT能催化合成具有生物学效应的α-Gal,这为BMI用于异种移植中涉及α1,3-GT基因操作的研究提供了基因背景资料。     

Expressed sequence tags analysis of a liver tissue cDNA library from a highly inbred minipig line

Background Porcine liver performing efficient physiological functions in the human body is prerequisite for successful liver xenotransplantation. However, the protein differences between pig and human remain largely unexplored. Therefore we investigated the liver expression profile of a highly inbred minipig line. Methods A cDNA library was constructed from liver tissue of an inbred Banna minipig. Two hundred randomly selected clones were sequenced then analysed by BLAST programme. Results Alignments of the sequences showed 44% encoded previously known porcine genes. Among the 56% unknown genes, sequences of 72 clones had high similarities with known genes of other species and the similarities to human were mostly above 0.80. The other 40 clones showing no similarity to genes in National Centre for Biotechnology Information are newly discovered, expressed sequence tags specific to liver of inbred Banna minipig. Twenty-two of the 200 clones had full length encoding regions, 38 complete 5＇ terminal sequences and 140 complete 3＇ terminal sequences. Conclusion These newly discovered expression sequences may be an important resource for research involving physiological characteristics and medical usage of inbred pigs and contribute to matching studies in xenotransplantation.     

华支睾吸虫LAP2基因的生物信息学分析及克隆表达、组织定位

目的利用生物信息学方法分析华支睾吸虫LAP2全长基因的结构和功能,并将该基因克隆至原核表达载体进行表达、纯化,为进一步研究LAP2功能奠定基础。方法利用生物信息学相关软件,分析华支睾吸虫LAP2基因及其蛋白的结构、生物学和免疫学功能特征。针对LAP2的EST序列的编码区设计引物,从华支睾吸虫囊蚴cDNA质粒中扩增目的基因,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,经PCR、双酶切及DNA测序鉴定的阳性克隆诱导目的蛋白表达、亲和层析纯化、免疫印迹鉴定及组化定位。结果华支睾吸虫LAP2基因全长为1761bp,其编码序列长度为1662bp,编码553个氨基酸,理论分子量是59696.5Da,与人的该基因氨基酸序列相似性为26.7%,一致性仅为15.4%。该基因在大肠杆菌中可被高效表达,纯化的重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别,免疫组化结果表明该重组蛋白定位于华支睾吸虫成虫的肠支及表膜。结论华支睾吸虫LAP2在大肠杆菌中呈高效的可溶性表达,具有良好的抗原活性,可能为华支睾吸虫成虫分泌排泄抗原的组份之一。     

高体重指数(BMI)和糖化血红蛋白(HbA1c)促进结直肠息肉多发

 目的 探讨体重指数（body mass index，BMI）和糖化血红蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）与结直肠息肉多发的相关性。方法 选取结直肠息肉患者597例，按结直肠息肉数目（number of colorectal polyps，NCP）分为结直肠息肉单发（single colorectal polyp，SCP）组（n=216）和结直肠息肉多发（multiple colorectal polyps，MCP）组（n=381）。在SCP和MCP组内，按息肉发生的部位分为直肠、左半结肠和右半结肠亚组；按结肠镜下息肉大小分为结直肠大息肉（息肉直径≥10 mm）和结直肠小息肉（息肉直径<10 mm）亚组；根据结直肠息肉的病理类型分为腺瘤性息肉（adenomatous polyp，AP）和非腺瘤性息肉（non-adenomatous polyp，NAP）亚组。比较同水平组间的BMI和HbA1c的差异，采用单因素方差分析和二元Logistic回归分析评价BMI和HbA1c与结直肠息肉多发的相关性。结果 MCP组的年龄、BMI和HbA1c均显著高于SCP组[（64.1±9.7）岁vs.（61.2±12.0）岁，P=0.001；（24.3±3.2）kg/m² vs.（23.4±3.0）kg/m²，P=0.002；5.9%±0.8% vs.5.6%±0.7%，P=0.004]，MCP组内小息肉亚组的BMI和HbA1c均显著高于SCP组内小息肉亚组[（24.5±3.2）kg/m² vs.（23.5±2.9）kg/m²，P=0.015；6.0%±0.8% vs.5.6%±0.8%，P=0.032]。二元Logistic回归分析提示，BMI和HbA1c可能是结直肠息肉多发和结直肠小息肉多发的危险因素。结论 高BMI和HbA1c可能促进多发性结直肠息肉的发生；BMI和HbA1c或可作为结直肠息肉患者随访肠镜检查的辅助参考指标。     

UCA1a(CUDR) 基因真核表达载体的构建及其在膀胱癌UM-UC-2 细胞中的表达

目的：构建 UCA1a(CUDR) 基因真核表达载体 pcDNA-UCA1a(CUDR),观察其在膀胱癌 UM-UC-2 细胞中的表达,为研究 UCA1a(CUDR) 基因与膀胱癌的关系提供实验依据。方法：以膀胱癌 BLZ-211 细胞的 5′-RACE-Ready cDNA 为模板,采用 PCR 法克隆 UCA1a(CUDR) 全基因,经EcoRⅠ和 BamHⅠ双酶切后与真核表达载体 pcDNA3.1(＋) 连接,构建 pcDNA-UCA1a(CUDR) 重组质粒。双酶切及测序鉴定后,稳定转染至体外培养的人膀胱癌 UM-UC-2 细胞系,利用 RT-PCR法检测转染 pcDNA-UCA1a(CUDR) 的 UM-UC-2 细胞和转染空质粒 pcDNA3.1(＋) 的 UM-UC-2 细胞中 UCA1a(CUDR) 基因的表达。结果：克隆的目的基因片段约为 2 200 bp,与预期结果相符,表明成功扩增 UCA1a(CUDR) 基因;经双酶切及测序鉴定,成功构建真核表达载体pcDNA-UCA1a(CUDR)。半定量 RT-PCR 法检测,与转染空质粒的细胞比较,转染表达载体 pcDNA-UCA1a(CUDR) 的UM-UC-2 细胞中 UCA1a(CUDR) 基因表达量升高。结论：成功构建pcDNA-UCA1a(CUDR)真核表达载体,且UCA1a(CUDR) 基因在转染表达载体的 UM-UC-2 细胞中高表达。     

小鼠ACE2基因的克隆和体外表达以及序列分析与组织分布

目的:深入研究血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)在心血管疾病发病机理中的作用及在高血压基因治疗中的应用,克隆和体外表达小鼠ACE2基因,并进行核苷酸和氨基酸序列分析和组织分布特征研究.方法:采用RT-PCR方法,从小鼠肾组织中扩增出ACE2基因的全长cDNA序列,TA克隆到pGEM-T easy载体,亚克隆到pcDNA3.1 载体,构建重组真核表达质粒pmACE2,测序鉴定.采用脂质体法将pmACE2转染Cos7细胞,分别用RT-PCR和SDS-PAGE检测ACE2的转录和表达.CLUSTALX 1.8生物软件分析小鼠和大鼠及人ACE2蛋白的多序列比较.采用RT-PCR技术研究小鼠ACE2组织分布的特异性.结果:①RT-PCR扩增片段约2.6 kb,重组真核表达质粒pmACE2测序结果表明,克隆片段存在A701G、T1102C和T1330C 3处变异,其序列与以往报道不一致,cDNA全长为2 397 bp,而与NCBI Refseq数据库(XM-136130)中cDNA全长1 902 bp不符;②SDS-PAGE显示pmACE2表达产物的相对分子量约80 kD;③氨基酸序列分析表明,小鼠ACE2主要由N末端的信号肽序列(第1-18位残氨)、含有锌结合位点保守序列HHEMGHIQ(第373-380位残氨)的催化结构域和跨膜结构域(第738-765位残氨)组成;④小鼠ACE2与人有84%的相似性,与大鼠有90%的相似性,三者同源;⑤ACE2在肺、心和肾组织中大量表达,在睾丸和肝组织中也有表达.结论:成功克隆并体外表达了小鼠ACE2基因,不同物种ACE2组织分布的特异性不尽相同.     

恶性淋巴瘤mdr1和MRP mRNA及 P-gp表达水平与化疗疗效的相关研究

目的探讨恶性淋巴瘤mdr1、MRP mRNA和P-gp表达水平与化疗疗效的相关性.方法应用半定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术和流式细胞术(FCM)方法,以8例人正常淋巴结为正常对照,对46例淋巴瘤患者[23例初治(HD1例,NHL22例)及23例复发(HD5例,NHL18例)]的mdr1 mRNA、MRP mRNA和P-gp表达水平与化疗疗效间的关系进行了前瞻性研究.结果复发患者mdr1基因和P-gp表达水平及阳性率均高于初治患者(P<0.001),而MRP基因表达水平及阳性率在复发与初治患者间差异无显著意义(P>0.05).mdr1基因及P-gp表达阳性患者的化疗有效(CR+PR)率(33.33%和26.67%)明显低于mdr1基因及P-gp表达阴性患者(85.71%和83.87%,P<0.001),而MRP基因表达阳性患者与阴性患者的化疗有效率差异无显著意义(P>0.05).相关分析显示,mdr1基因和P-gp表达水平之间有明显相关性(r=0.296 3,P<0.05),而mdr1和MRP之间、MRP与P-gp之间均无明显相关性(r=0.072 3,P>0.05;r=0.081 8,P>0.05).结论 mdr1基因及P-gp表达是恶性淋巴瘤患者多药耐药的主要机制,而MRP基因不是产生耐药的主要机制.mdr1基因及P-gp表达水平的高低与恶性淋巴瘤化疗疗效密切相关,而MRP基因的表达与化疗疗效未见相关.     

母血中游离CRH、PLAC1、Selectin-P的mRNA表达水平与子痫前期的相关性研究

目的：比较孕妇血浆中胎盘来源的外周血促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、胎盘特异蛋白-1（PLAC1）、选择素P（Selectin—P）基因的mRNA表达水平在子痫前期患者和正常孕妇之间的区别。方法：选择30例子痫前期病例（病例组）及40例正常孕妇（对照组）采集外周血提取RNA,分析上述3个基因的游离mRNA表达水平,并在两组间采用t检验比较。结果：CRH、PLAC-和Selectin．P在病例组及对照组的孕妇外周血中均有表达,病例组孕妇外周血中CRH、PLAC1、Selectin—P的表达水平明显高于对照组（P〈0．05）。结论：孕母血浆中的胎盘来源的游离CRH、PLAC1、Selectin-P表达水平对于妊娠期高血压疾病,子痫前期的发病具有预测价值。