r-PA真核表达载体的构建与鉴定

用SV40和CaMV 35S两种启动子分别启动瑞替普酶(reteplase，r-PA)和标记基因bar基因，构建能在海带中表达外源基因的重组表达载体。通过PCR方法扩增CaMV35S启动子、bar基因和r-PA基因，将扩增的3个片段分别克隆到pGEM-T Easy Vector上。将CaMV片段亚克隆到pCAT3-control载体上得到重组质粒pCAT／CaMV；再将bar基因切下插入到CAT／CaMV上得到重组质粒pCAT／C-B，最后将rPA基因片段切下后插入到pCAT／C-B上获得重组质粒pSVrPA／C-B。PCR、酶切及测序结果均表明已成功扩增出CaMV 35S、r-PA和bar基因片段，并已顺次正确插入到真核表达载体PCAT3-control上，最终成功构建了能在海带中表达r-PA的真核表达载体，用基因枪法转入海带中表达，FAPA法测定得到有体外纤溶活性的阳性海带，为后续研究工作打下坚实的基础。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)在转基因烟草中的表达

实验室构建了携带有人组织型纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，t-PA）植物表达载体并转化人根瘤农杆菌GV3101。该农杆菌以叶盘法转化烟草，建立表达t-PA的转基因烟草体系。通过对转化植株进行Southern blotting，RT-PCR，Western blotting和纤维蛋白琼脂糖平板（fibrin-agarose plate assay，FAPA）法检测，结果显示，在转基因烟草中成功地表达出有活性的人t-PA。     

人源性防御素HD-5的原核表达及抗真菌作用的初步研究

【摘要】目的 构建pQE-30Xa/HD-5原核表达载体,纯化重组蛋白并进行抗真菌活性的初步鉴定。方法 以pcDNA3.1(+)/HD-5为模板,聚合酶链反应（PCR）扩增编码HD-5成熟肽的基因。构建pQE-30Xa/HD-5重组表达载体,并对重组质粒进行酶切、基因序列分析。将鉴定正确的质粒转化入大肠杆菌M15后进行异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定。通过镍柱亲和层析纯化蛋白并进行蛋白复性,蛋白免疫印迹（Western blot）鉴定纯化产物。以KB纸片法初步验证纯化获得的重组蛋白对白色假丝酵母菌的抑菌活性。结果 成功克隆了HD-5基因并构建了重组质粒pQE-30Xa/HD-5。重组质粒在大肠杆菌M15中诱导表达出HD-5融合蛋白;Western blot分析结果显示纯化后的融合蛋白与目的蛋白相符;KB纸片法证实纯化后的融合蛋白对白色假丝酵母菌具有一定的抑菌活性。结论 成功构建HD-5原核表达载体,经诱导表达后纯化获得具有良好抑菌活性的HD-5融合蛋白。     

pTAT-XIAP融合蛋白的原核表达及纯化

目的将X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)插入质粒pTAT-HA,构建pTAT-XIAP原核表达载体,以获得高产量、高纯度的pTAT-XIAP融合蛋白。方法将pTAT-XIAP融合蛋白表达载体转入大肠杆菌BL21plysS,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,产物经镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)亲和层析纯化,并用Western blot方法鉴定。结果 pTAT-XIAP融合蛋白在大肠杆菌中获得表达,纯化后蛋白呈单一条带,表达产物经Western blot分析证实目的蛋白表达。结论构建重组融合表达载体,在大肠杆菌中成功表达并纯化pTAT-XIAP融合蛋白。     

组织型纤溶酶原激活剂突变体Reteplase(r-PA)基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过PCR的方法从人t-PA基因上扩增到r-PA基因的编码序列，并克隆到pMD18-T载体中，DNA测序与文献报道完全一致，该基因被克隆到多用途表达载体pET28a中，重组表达载体r-PA/pET28a转化E.coliBL21(DE3)，培养表达，SDS-PAGE分析可见M，约39000的蛋白条带，约占细胞内总蛋白的30%以上，体外溶圈法测定活性表明该重组蛋白具有较好的纤溶活性。     

HMGN2重组表达质粒的构建及其抗乙型病毒性肝炎的病毒活性

目的：构建HMGN2重组表达载体并观察高迁移率蛋白HMGN2分子的抗乙型病毒性肝炎的病毒作用。方法用基因克隆的方法,构建pET -32 a-c （＋）-HMGN2重组表达质粒;用亲和层析的方法,纯化His-HMGN2融合蛋白, Tricine-SDS-PAGE电泳、Western blotting对纯化得到的HMGN2分子进行分子鉴定。以HBV DNA转染的细胞株HepG2.2.15细胞为模型,用ELISA检测HBV表面抗原（HBsAg）及e抗原（HBeAg）,用实时荧光定量PCR法检测HBV DNA的含量。结果成功构建了pET-32a-c（＋）-HMG17重组表达质粒,其表达的融合蛋白可显著抑制HBeAg和HBsAg的表达,降低HBV DNA拷贝数。结论 HMGN2在体外细胞培养中有直接抗HBV的活性。     

人胰岛素样生长因子1前体基因的重组、表达及纯化

目的 构建含有人胰岛素样生长因子1（hIGF-1）前体编码基因的重组载体,在E.coli BL21中表达,并探讨其抗原性和应用价值。方法 用PCR法,从现有重组质粒pBakPAK 8／hIGF-1中,扩增编码hIGF-1前体的基因片段,经双酶切、纯化、连接后得到pET29a（＋）／hIGF-1重组体,再将其转化大肠杆菌BL21-CodonPlus并诱导表达。表达产物经镍柱亲和层析纯化后,用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果 重组持粒pET29a（＋）／hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析证实构建成功。在大肠杆菌BL21-CodonPlus中经IPTG诱导表达,有一相对分子质量15000的重组蛋白hIGF-1前体,该蛋白经镍柱亲和层析获得了良好的纯化效果,具有特异的抗原活性。结论 成功地克隆并表达相对分子质量为15000的hIGF-1前体编码基因,为进一步制备抗hIGF-1抗体和后续hIGF-1生物学功能研究打下了良好基础。     

RGD修饰多肽EDSM-Y的克隆、表达、纯化和初步活性研究

固相合成多肽EDSM-Y在体内外具有良好的抗血管生成和抗肿瘤的活性,该研究希望通过基因工程重组手段获得目的蛋白EDSM-Y,为进一步研究开发奠定基础。PCR扩增得到目的基因,连接入原核表达载体;以IPTG诱导实现外源基因表达,SDS-PAGE和Western Blot验证;摸索发酵表达纯化条件,分离目的蛋白;细胞增殖实验检测EDSM-Y的活性。成功构建了pET-23a(+)-EDSM-Y重组表达载体,但目的蛋白表达量较低。后将EDSM-Y克隆入pET-32a(+)重组表达载体进行融合表达,改变表达载体后目的蛋白表达量显著增加。目的蛋白经过先后两次亲和层析,纯度分别可到达60%和85%,活性实验表明EDSM-Y对血管内皮细胞具有增殖抑制作用。通过基因工程重组能获得具有抑制细胞增殖活性的抗肿瘤多肽EDSM-Y。     

重组人白介素21的原核表达与体外活性研究的优化

为了构建重组人白介素21(rhIL-21)原核稳定表达和体外活性检测系统,采用Overlap-PCR法合成目的基因;经双酶切整合至pET28,化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)构建pET-28a-rhIL-21 BL21(DE3)原核表达系统;胞内表达的包涵体经镍亲和层析色谱柱纯化后,尿素缓冲液梯度透析复性,最终溶于PBS缓冲液;双抗体夹心法ELISA、Western blotting检测复性蛋白的生物活性;细胞增殖抑制试验(MTT法)研究rhIL-21对Jurkat细胞株和HuT102细胞株的作用。实验成功建立了rhIL-21表达纯化与活性评价体系,为进一步研究IL-21的促免疫性疾病发展和抗肿瘤活性奠定了基础。     

重组人甲状旁腺激素相关蛋白1-141的表达和生物活性测定

目的：建立表达及纯化重组人甲状旁腺激素相关蛋白1-141（rhPTHrP1-141）的方法。方法：将已构建好的表达载体pQE-30Xa／hPTHrP1-141重组质粒转化大肠杆菌M15[PREP4]，IPTG诱导表达，Western Blot鉴定表达产物。金属螯合亲和层析去除杂蛋白后，超滤离心进一步纯化目的蛋白。使用UMR106细胞测定所制备的rhPTHrP1-141对cAMP生成的刺激作用。结果：SDS-PAGE可见与预期大小相符的蛋白条带，Western Blot证实该条带即为rhPTHrP1-141。目的蛋白经纯化后，能刺激UMR106细胞内cAMP浓度升高，有剂量依赖关系。结论：成功建立了rhPTHrP1-141的制备及纯化方法，PTHrP1-141的表达量可达到60mg／L培养基。表达产物经体外实验证实具有生物活性。     

原癌基因Pokemon的克隆原核表达及纯化

目的克隆小鼠Pokemon(POKeryhroidmyeloidontogenicfactor)基因并进行原核表达及重组蛋白的纯化。方法应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆人pGEM-T-easy载体,经鉴定后,以限制性核酸内切酶分别消化重组质粒及原核表达载体pET-30a(+),体外定向连接,进行PCR、内切酶酶切及DNA序列分析,阳性重组表达质粒进一步转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达,经Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,Westernblotting检测其特异性。结果限制性核酸酶切及序列分析表明重组表达质粒包含Pokemon基因编码区,阅读框架无移位;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示有预期相对分子质量为36000的重组蛋白表达,经亲和层析纯化后,融合蛋白的纯度达到90%以上;Westernblotting印迹表明纯化的融合蛋白具有特异的免疫反应特性。结论采用基因克隆技术成功构建了Pokemon原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,为后期抗体的制备及进一步研究该基因与肿瘤发生的关系奠定了基础。     

瑞替普酶治疗急性心肌梗死的疗效及安全性观察

目的比较瑞替普酶与尿激酶在治疗急性心肌梗死中的疗效及安全性。方法将130例AMI患者随机分为两组;r-PA组64例,r-PA36mg分两次静脉注射,每次18mg,间隔30min;UK组66例,以UK150万U 30min静脉滴注完。比较两组的再通率、再通时间及出血等不良反应的发生率。结果两组的再通率84.68%和53.03%,在溶栓后30min、60min、120min再通率r-PA组分别为34.37%、65.25%、84.68%,UK组分别为12.12%、27.27%、53.03%均有统计学差异(P<0.05);两组在出血等不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05)。结论与UK相比,r-PA静脉溶栓治疗AMI能更早地开通梗死相关血管,是一种安全有效的溶栓药物。     

瑞通立与尿激酶在急性心肌梗死溶栓中的比较

目的:比较瑞通立(reteplase,r-PA)和尿激酶(UK)对急性心肌梗死(AMI)治疗效果和不良反应。方法:回顾性分析我院184例接受溶栓治疗的AMI患者临床资料。分成两组,r-PA组101例,UK组83例。统计两组的血管开通率、血管开通时间和出血发生率。结果:r-PA组血管总开通率为73.3%,UK组总开通率为50.1%,两组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),且r-PA组发病时间<2h溶栓后血管开通率明显高于发病时间2～12h血管开通率(P<0.05)。r-PA组血管开通时间(0.92±0.48h)短于UK组(1.42±0.53)(P<0.05)。r-PA组和UK组出血发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:rt-PA治疗急性心肌梗死疗效优于UK,尤其在发病早期疗效更佳。     

人SMYD3基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

构建人SMYD3基因原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。通过PCR方法从重组质粒pcD-NA-SMYD3中扩增得到SMYD3基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体。将重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)中,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pGEX-SMYD3。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明人SMYD3基因在大肠杆菌中获得了良好的表达。实验成功地构建了SMYD3基因原核表达载体并在大肠杆菌中获得良好表达,为进一步研究SMYD3蛋白功能奠定了基础。     

PML-RARα融合基因相关蛋白原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建PML-RAR o[融合基因相关重组表达质粒,在大肠埃希菌中表达可溶性蛋白并进行纯化.方法 利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)以PML-RAR α全长质粒为模板分别扩增出长度均为1 200 bp的PML和RAR o[序列,并将它们分别插入PET32a(+)质粒中,构建重组表达质粒,化学法转化大肠埃希菌DH5α进行克隆,菌落PCR筛选阳性转化子,双酶切和测序鉴定重组质粒的正确性.正确重组的表达质粒分别命名为PML-Flag-PET32a(+)和Flag-RARα-PET32a(+).将正确重组的表达质粒转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用表达蛋白的组氨酸“标签”(His-tag)进行Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化蛋白质.结果 PCR扩增获得目的基因,重组表达质粒经EcoRI/HindⅢ双酶切和测序鉴定证明构建正确.转化感受态BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,SDS-PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为目的蛋白.结论 成功构建重组表达质粒,并经诱导表达后可纯化出目的蛋白,为进一步的抗体制备等实验奠定了基础.     

液相色谱-串联质谱法研究重组水蛭素12肽与瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的一级结构

利用液质联用研究重组水蛭素12肽与瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的一级结构。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定水蛭素12肽与瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的相对分子质量；采用液质联用分别分析HV12p-rPA的胰蛋白酶(trypsin)和胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)酶解产物。MALDI-TOF-MS测得HV12p-rPA的相对分子质量为41 472 Da，与理论值相符；HV12p-rPA的胰蛋白酶(trypsin)酶解产物进行液质联用分析结果表明该融合蛋白中含有瑞替普酶序列；HV12p-rPA的胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)酶解产物进行液质联用分析，结果表明融合蛋白中含有水蛭素12肽，并检测出融合蛋白中的链接肽(DEGGGSY)，融合蛋白的N末端MASDF和C末端LDWIRDNMRP；采用液质联用进行肽图分析，识别出的多肽匹配度Xcorr均超过1.5，部分多肽的Xcorr超过3.0，表明本实验测定过程中多肽识别结果准确可靠；目标蛋白的氨基酸序列覆盖率超过85%。结果确定了HV12p-rPA融合蛋白的序列与理论值相符。     

pET28a-Streptag I-SbpA-Ag85B重组质粒的表达与鉴定

目的 应用分子克隆技术获得纳米级Ag85B蛋白并对其进行鉴定和免疫学特性检测.方法 利用S-layer/Streptag I这一具有自我组装能力的纳米模式嵌合结核杆菌分泌的Ag85B蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pET28a（＋）中,并在大肠杆菌中表达Ag85B蛋白,表达后的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting鉴定.结果 原核表达重组质粒pET28a-Streptag I-SbpA-Ag85B成功构建,并可在大肠杆菌中诱导表达,得到的Streptag I-Sbpa-Ag85B蛋白经SDS-PAGE和Western blotting鉴定正确,重组蛋白能被结核患者血清识别.结论 重组后的Ag85B蛋白具有较强的免疫反应性.所建立的原核表达体系为新型结核疫苗研制提供了一个新的思路.     

瑞替普酶用于急性心肌梗死治疗的有效性与安全性研究

目的比较瑞替普酶（Reteplase,r-PA）与尿激酶（UK）静脉溶栓治疗急性心肌梗死（AMI）的疗效和安全性。方法将本院收治的56例急性心肌梗死患者分为瑞替普酶组（Reteplase组）和尿激酶组（UK组）,分别予以瑞替普酶和尿激酶溶栓治疗,对两组冠状动脉再通率、并发症及不良反应发生率、急性期病死率等方面的数据进行统计分析。结果瑞替普酶组的血管再通率明显高于尿激酶组,同时明显降低了其急性期病死率（P〈0．05）。两组并发症及不良反应发生率差异无统计学意义（P〉0．05）。结论瑞替普酶用于静脉溶栓治疗是安全、有效的。