细胞因子对人视网膜色素上皮细胞syndecan-1表达的影响

目的 检测细胞因子对人视网膜色素上皮（RPE）细胞syndecan-1表达的影响，并探讨其作用的信号转导途径。 方法 体外培养人RPE细胞，采用逆转录聚合酶链反应和免疫荧光法检测正常细胞syndecan-1 mRNA、蛋白的表达；免疫荧光法定性、定量观察不同刺激因子作用下syndecan-1的表达变化，包括：7、35 ng/ml肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激24 h，1、6 μg/ml脂多糖（LPS）刺激11 h, 7 ng/ml TNF-α刺激不同时间（0～24 h，每2 h为1个时间点，共13个时间点)，30%单核/巨噬细胞株（THP-1细胞）上清液刺激3、14、43 h；细胞外信号调节激酶(ERK)1/2通路特异性阻断剂PD098059预处理2 h后对30% THP-1细胞上清液作用的调节；30% THP-1细胞上清液刺激细胞3 h后0.25%胰酶作用5 min，噻唑蓝法检测细胞贴壁情况。 结果 在正常RPE细胞中可检测到syndecan-1 mRNA和蛋白的表达；未受刺激的RPE细胞细胞膜、细胞浆及核仁呈强的黄绿色荧光，细胞核呈浅绿色荧光；随TNF-α、LPS浓度及时间增加，荧光强度呈减弱趋势(P<0.01); 30% THP-1细胞上清液刺激后细胞荧光强度明显减弱(P<0.001)。50 μmol/L PD098059预处理2 h后可部分阻断30% THP-1细胞上清液的下调作用。与对照组相比，THP-1细胞上清液作用3 h后贴壁细胞数下降（P<0.05）。 结论 TNF-α和LPS可下调体外培养的人RPE细胞syndecan-1的表达；30% THP-1细胞上清液可下调RPE细胞syndecan-1的表达、促使细胞脱壁，且该作用至少通过了ERK 1/2信号转导通路。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 113-116)     

促红细胞生成素对人视网膜色素上皮细胞光化学损伤的保护作用

目的 观察重组人促红细胞生成素（EPO）在人视网膜色素上皮(RPE)细胞光化学损伤中的保护作用并探讨其作用机制。 方法 取成人RPE（ARPE）19细胞株传代培养的2～5代细胞建立光损伤模型，光照12 h后再培养24 h终止培养，采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）法和流式细胞双染色法检测不同浓度的EPO干预治疗前后RPE细胞活性的变化及细胞凋亡的变化，并添加酪氨酸激酶/信号转导和转录活化因子Jak/STAT的阻断剂（AG490）探讨人重组EPO对人RPE细胞光化学损伤的保护性作用及其保护性机制。 结果 EPO可明显增强 RPE细胞的细胞活性，各组中以40 IU/ml EPO组细胞活性的增强结果最明显；明显减少光化学损伤诱导的人RPE细胞的凋亡，以40 IU/ml EPO组结果最明显。在加入AG490（Jak2激酶抑制剂）组，EPO对细胞活性的增强作用和抑制凋亡作用均被阻止。 结论 EPO对人RPE细胞的光化学损伤有保护治疗作用，其保护作用机制主要通过EPO与其受体结合后保护作用机制起作用。     

米诺环素对压力作用下体外培养视网膜神经细胞凋亡的抑制

目的 观察米诺环素对压力系统作用下大鼠视网膜神经细胞(RNs)的活性及凋亡的影响，探讨其对受损RNs保护的可能机制。 方法 制备大鼠RNs体外加压培养模型，通过细胞形态学观察、四唑盐（MTT）比色法测定细胞活力、吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色法检测细胞凋亡率等方法观察不同浓度的米诺环素对上述损伤细胞的保护作用，并用免疫细胞化学法观察iNOS和caspase 3表达的改变。 结果 加压培养后RNs与对照组相比形态改变较明显，细胞活力降低，5393%的细胞发生凋亡。20000 μmol/L的米诺环素治疗组则细胞形态改善，活力显著增高，1729%的细胞发生凋亡；免疫细胞化学法显示细胞内iNOS和caspase-3表达较加压损伤组减少。 结论 一定剂量的米诺环素在体外可有效抑制压力引起的大鼠RNs损伤及凋亡；抑制iNOS和caspase-3的表达可能是其潜在作用机制。     

应用二维电泳法对视网膜色素上皮细胞光损伤后蛋白质组学的初步研究

目的 应用二维电泳法观察光损伤后视网膜色素上皮细胞蛋白质组的表达。 方法 运用冷白光以（2200±300）Lx光照人视网膜色素上皮细胞(ARPE 19)6 h，建立光损伤模型；提取细胞可溶性蛋白并通过二维电泳分离和凝胶图像分析，寻找光损伤细胞的蛋白质谱变化。 结果 软件分析显示全细胞可溶性蛋白在图谱上出现（390±10）个清晰斑点,11个蛋白斑点有明显表达差异。光损伤细胞内8种蛋白表达上调,1种下调，2种蛋白表达缺失。 讨论 二维电泳实验能够找出光损伤RPE细胞与正常细胞的蛋白表达差异，为进一步研究在此改变中发挥重要作用的蛋白质奠定基础。     

缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子干扰性RNA对人血管内皮细胞血管内皮生长因子表达的抑制

目的 探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）小片段干扰性RNA（siRNA）对人血管内皮细胞VEGF表达的影响。 方法 构建HIF-1α siRNA重组质粒。将体外培养的人血管内皮细胞（HUVEC-12）分成常氧（20%）组和低氧（1%）组。低氧组中，采用脂质体Lipofectamine ^TM 2000（LF2000）分别转染空载体质粒（空载体组）、HIF-1α siRNA（HIF-1α组）、VEGF-₁₆₅ siRNA（VEGF组）和HIF-1α siRNA+VEGF₁₆₅ siRNA（共转染组）。低氧组中未转染的细胞为对照组。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）鉴定基因转染效率；RT-PCR和免疫细胞化学法检测各组细胞中VEGF基因和蛋白表达的变化。 结果 成功构建HIF-1α siRNA重组质粒。人血管内皮细胞转染24 h后，HIF-1α siRNA和VEGF-₁₆₅ siRNA重组质粒有表达。常氧组细胞中仅见微弱的VEGF mRNA和蛋白表达，而低氧组表达明显上调；HIF-1α组、VEGF组和共转染组表达较对照组减弱，其中共转染组抑制效果最明显。 结论 HIF-1α和VEGF₁₆₅ siRNA能有效抑制人血管内皮细胞VEGF的表达。     

45岁以上中心性浆液性脉络膜视网膜病变与渗出型老年性黄斑变性眼底血管造影对比分析

目的 观察45岁以上的中心性浆液性脉络膜视网膜病变（CSC）与渗出型老年性黄斑变性（AMD）患者眼底血管造影图像特征的异同。 方法 回顾分析45岁以上CSC患者32例39只眼和渗出型AMD患者20例22只眼的眼底彩色像、荧光素眼底血管造影（FFA）和吲哚青绿血管造影（ICGA）检查资料。 结果 39只CSC眼中，FFA显示典型CSC 11只眼，占282％；扩散性视网膜色素上皮病变（DRPE）28只眼，占718％。ICGA显示39只眼早期脉络膜充盈迟缓及随后的脉络膜血管扩张，占100％；中期均有多灶性脉络膜血管通透性增强，占100％，16只眼中后期呈现渗漏点强荧光，占41.0％；后期5只眼见脉络膜大血管负影，占12.8％。22只未伴明显出血的渗出型AMD眼中，ICGA显示焦点状脉络新生血管（CNV） 13只眼，占59.1％；斑状CNV 8只眼，占36.4％；结合型CNV 1只眼，占4.5％。造影早期5只眼黄斑区及周围脉络膜血管代偿性扩张，占22.7％；中期均未见脉络膜血管通透性增强，后期均未见脉络膜大血管负影。 结论 45岁以上的CSC与渗出型AMD不同的ICGA特征为局灶性或多灶性的RPE渗漏点强荧光；多灶性脉络膜血管通透性增强；造影后期脉络膜血管负影；造影期间无焦点状或斑状CNV性强荧光。     

地塞米松对低温冷冻后人视网膜色素上皮细胞游离Ca2+浓度的影响

目的：观察地塞米松对低温冷冻后视网膜色素上皮(retina pigment epithelium，RPE)细胞内Ca²⁺浓度的影响。 方法：在一70°C条件下，冷冻RPE细胞30秒，分别加入40、60、100、150、200μg/ml的地塞米松后，应用Fura^-2/AM荧光负荷技术，测定RPE细胞Ca²⁺浓度。 结果：地塞米松在40μg/ml~60μg/ml浓度范围可使冷冻后RPE细胞内Ca²⁺增高18.6%～29.8%，在150μg/ml~200μg/ml可降低细胞内Ca²⁺浓度28.4%～35.2%。 结论；地塞米松对冷冻后RPE细胞内Ca²⁺的影响表现为双重作用，即低浓度的促进作用和高浓度的抑制作用，提示临床用药应在冷冻瞬间冲击治疗。 （中华眼底病杂志，1997，13：86-88）     

IL-1β和TNF-α对培养的人视网膜色素上皮细胞波形蛋白表达的影响

目的　观察IL 1β和TNF α对培养的人视网膜色素上皮 (RPE)细胞波形蛋白表达的影响。 方法　采用免疫组织化学和彩色图像分析技术检测IL 1β和 /或TNF α( 2 0ng/mL)对RPE细胞波形蛋白表达的影响。 结果　波形蛋白表达的灰度值分别为 :IL 1β TNF α处理组 76 9± 8 1,IL 1β处理组 78 4± 8 1,TNF α处理组 90 2± 6 7。与对照组 110 2±10 7比较均有显著性差异 (P <0 0 1)。结论　IL 1β和 /或TNF α可上调波形蛋白的表达 ,在增生性玻璃体视网膜病变(PVR)中可能参与RPE细胞增殖过程中中间丝的改变。     

信号转导与转录激活因子3在脉络膜新生血管发生中的可能作用

目的　观察磷酸化信号转导与转录激活因子3（STAT3）在激光诱导的大鼠脉络膜新生血管（CNV）中的表达,探讨STAT3在CNV中可能的作用。方法　建立激光诱导的大鼠CNV模型,免疫荧光法观察CNV生成早期磷酸化STAT3的表达。建立细胞缺氧模型,细胞培养液中加入Janus激酶2（JAK2）特异性阻断剂AG490后培养1、3、6、12、24 h。流式细胞仪检测视网膜色素上皮（RPE）细胞的增生指数,反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和VEGF的mRNA表达,蛋白质免疫印迹法检测HIF-1α蛋白表达,酶联免疫吸附试验检测细胞培养液上清液中血管内皮生长因子（VEGF）的含量。结果　激光光凝后3 d,磷酸化STAT3高表达于大鼠CNV区域。阻断JAK2/STAT3信号转导通路后,缺氧条件下人RPE细胞随时间增生指数明显降低（t=1.472,3.566,2.391,6.420;P=0.054,0.038,0.042,0.016）。随缺氧时间增加,HIF-1α和VEGF mRNA表达逐渐增强。采用AG490阻断JAK2/STAT3信号转导通路后,缺氧条件下人RPE细胞HIF-1α mRNA和VEGF mRNA的表达、HIF-1α蛋白的活化均受明显抑制(t=0.07,0.02,0.01, P＜0.05);细胞培养上清液中VEGF含量显著降低（t=1.330,1.106,2.828,7.742,5.610,6.894,P=0.082,0.063,0.014,0.002,0.016,0.011）。结论　STAT3可能参与了CNV的发生,这一过程部分是通过JAK2/STAT3信号转导通路调控RPE细胞HIF-1α和VEGF表达而实现的。      

替德肝素抑制冷冻后视网膜色素上皮细胞分泌肝细胞生长因子的研究

目的探讨替德肝素(tedelparin)在抑制冷冻后的人视网膜色素上皮(humanretinapigmentepithelium,hRPE)细胞分泌肝细胞生长因子(humanhepatocytegrowthfactor,HGF)和生长中的作用。方法体外培养的RPE细胞在-80℃下进行冷冻,冷冻时间分为0、15和60s,随后继续体外培养(体外实验组)和注入正常兔眼玻璃体(体内实验组)并在第6天时取出一些兔眼的玻璃体液加入到正常RPE细胞培养液中孵育48h;每实验组再分为两个亚组替德肝素治疗(终浓度25μl/ml)组和未治疗组,在3d、6d时收集细胞培养上清和玻璃体样本,ELISA法测定HGF含量,MTT法测定48h后RPE细胞的增殖状态。结果在体外实验组,比较未冷冻组,冷冻后的RPE细胞随着冷冻时间延长HGF分泌水平增加(F=2736,P<001),替德肝素干预组HGF分泌水平下降(F=17950,P<001)。在体内实验组(兔玻璃体)随着冷冻时间延长HGF浓度较对照组明显增高(F=624,P<001),当玻璃体液(冷冻15s和60s,第6天)加入到正常RPE细胞培养液48h后刺激细胞增殖(P<001),在替德肝素干预组,细胞增殖明显减弱(F=4490,P<005)。结论冷冻可刺激RPE细胞在体外和体内玻璃体环境中HGF的高分泌,且随着冷冻时间增加更为显著。替德肝素可降低冷冻后RPE细胞分泌HGF水平和抑制促生长环境中的RPE细胞生长,具有预防PVR的作用。     

Retinal Pigment Epithelial Cells Express Antimicrobial Peptide Lysozyme – A Novel Mechanism of Innate Immune Defense of the Blood-Retina Barrier

PurposeFor this study we aimed to understand if retinal pigment epithelial (RPE) cells express antimicrobial peptide lysozyme as a mechanism to protect the neuroretina from blood-borne pathogens.MethodsThe expression of lysozyme in human and mouse RPE cells was examined by RT-PCR or immune (cyto)histochemistry in cell cultures or retinal sections. RPE cultures were treated with different concentrations of Pam3CSK4, lipopolysaccharides (LPS), staphylococcus aureus-derived peptidoglycan (PGN-SA), Poly(I:C), and Poly(dA:dT). The mRNA expression of lysozyme was examined by qPCR and protein expression by ELISA. Poly(I:C) was injected into the subretinal space of C57BL/6J mice and eyes were collected 24 hours later and processed for the evaluation of lysozyme expression by confocal microscopy. Bactericidal activity was measured in ARPE19 cells following LYZ gene deletion using Crispr/Cas9 technology.ResultsThe mRNA and protein of lysozyme were detected in mouse and human RPE cells under normal conditions, although the expression levels were lower than mouse microglia BV2 or human monocytes THP-1 cells, respectively. Immunohistochemistry showed punctate lysozyme expression inside RPE cells. Lysozyme was detected by ELISA in normal RPE lysates, and in live bacteria-treated RPE supernatants. Treatment of RPE cells with Pam3CSK4, LPS, PGN-SA, and Poly(I:C) enhanced lysozyme expression. CRISPR/Cas9 deletion of lysozyme impaired bactericidal activity of ARPE19 cells and reduced their response to LPS and Poly(I:C) stimulation.ConclusionsRPE cells constitutively express antimicrobial peptide lysozyme and the expression is modulated by pathogenic challenges. RPE cells may protect the neuroretina from blood-borne pathogens by producing antimicrobial peptides, such as lysozyme.     

增生性玻璃体视网膜病变中组织型转谷氨酰胺酶的表达

目的:检测增生性玻璃体视网膜病变(PVR)视网膜前膜和视网膜色素上皮(RPE)细胞中组织型转谷氨酰胺酶(tTG)的表达情况,探讨tTG是否参与PVR的发病过程.方法:PVR患者21例,收集视网膜前膜,C级8例,D级13例,行tTG免疫组织化学染色.另对培养3-5代的人RPE细胞分别用含有1 00mL/L PVR玻璃体液、正常玻璃体液和PBS的DMEM培养液进行孵育24h后行tTG免疫细胞化学染色.光镜下观察,比较C级和D级膜的表达阳性率,显微图像分析测量3组RPE细胞染色的平均灰度值.结果:在PVR视网膜前膜中tTG呈阳性表达(81%),C级和D级膜表达阳性率无差异 (C级88%,D级77%,P＞0.05).培养的人RPE细胞表达tTG,在PVR患者的玻璃体液作用下,tTG表达的平均灰度值为137.0±2.6,与正常玻璃体液组(143.5±2.9)及PBS对照组(143.6±3.0)相比,表达水平升高(P＜0.05).结论:PVR视网膜前膜和培养的人RPE细胞tTG表达阳性,在PVR患者的玻璃体液作用下,RPE细胞的tTG表达水平升高,这表明tTG参与了PVR的发病过程,在PVR视网膜前膜的形成过程中可能有重要作用.     

猪视网膜色素上皮细胞间连接与通讯功能的关系

目的：探讨体外培养的猪视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞间连接与通讯功能的关系。 方法：用5，6-碳氧荧光素醋酸盐进行细胞染色，光淬灭某些细胞中的荧光分子，激光扫描共聚焦显微镜观察不同连接状态的RPE细胞内的荧光恢复速率，评价缝隙连接的通讯功能。 结果：光漂白后的ＲＰＥ细胞中的荧光强度得以恢复，与之紧密相连的细胞则有荧光下降，分别与1, 2, 3个细胞相连的每分钟荧光恢复速率依次是1.997±0.665，4.378±0.811，8.736±2.084。 结论：体外培养的猪RPE细胞缝隙连接通讯功能的强弱与细胞的连接状况有关。 (中华眼底病杂志,1998,14:41-42)     

Macrophage modulation of retinal pigment epithelial cell migration and proliferation

Macrophages are fully differentiated cells that do not synthesize an extracellular matrix and do not contract; they do, however, produce substances that modify the behavior and functions of other cells, particularly those involved in the inflammatory and immune responses. Since macrophages are a ubiquitous component of periretinal membranes, we sought to determine whether they modulate proliferation and/or migration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, functions that may be essential for the development of proliferative vitreoretinopathy (PVR). Using an in vitro assay, we found that macrophage supernatant contains factors that stimulate proliferation and migration of cultured human RPE cells. Since interleukin-1 (IL-1) is a product of activated macrophages that modulates a number of cellular functions, we also examined its effect on RPE proliferation and migration. We found that IL-1 increased migration but did not affect proliferation, and thus could not duplicate the effect of macrophage supernatant. Injection of activated macrophages into the vitreous of rabbits which had a retinal hole stimulated RPE cell proliferation in the area of the retinal hole, where the RPE cells were exposed. These findings suggest the ability of macrophages to modulate functions of RPE cells that are thought to be critical for the development of PVR. Macrophages may thus be an important part of the vitreous environment that favors the development of PVR.