猪巨细胞病毒TaqMan荧光定量PCR检测的建立

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。方法 根据GenBank已登录的猪巨细胞病毒(Porcine Cytomegalovirus,PCMV)DNA序列设计合成特异性引物对和TaqMan荧光探针,经优化反应条件,建立了猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法(fluorescent quantitative real-time PCR, FQ-PCR),进行了FQ-PCR检测方法的敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PCMV 感染临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了比对;对FQ-PCR检测结果为PCMV 阳性猪的不同内脏器官进行病毒含量比较检测。结果 成功建立了PCMV 的FQ-PCR方法,标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.998;检测灵敏度可达1 拷贝/μL,是常规PCR的100倍;特异性高,对pGEM-T/PCMV重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对6个对照病原的扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEM-T/PCMV重组质粒分别重复扩增6次,重复结果良好;对15份临床疑似PCMV感染的组织病料进行应用检测表明,其中有9份样品为阳性,与常规PCR方法检测的阳性符合率为100%。猪的内脏器管中PCMV含量最高为扁桃体,最低的为小肠。结论 成功建立了PCMV FQ-PCR方法,可用于临床上PCMV感染猪的确诊和隐性感染猪的早期检测,对PCMV的快速诊断、综合防控及净化等具有重要意义。     

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌

目的利用新一代TaqMan MGB探针技术,建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于布鲁氏菌的快速检测。方法针对布鲁氏菌基因组中16SrRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套基于TaqMan MGB探针技术的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性,对2008-2010年期间采集的773份动物样本中的布鲁氏菌进行检测,并与普通PCR方法进行比较分析。结果建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对布鲁氏菌的检测具有高度的特异性,对小肠结肠耶尔森菌、假结核耶尔森菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、泰泽氏菌均无交叉反应。生成的标准曲线的相关系数为0.999,斜率为-3.301,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR效率为100.872%。TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能够准确地从布鲁氏菌阳性样本中检测到布鲁氏菌DNA,最低能够检测到的布鲁氏菌数量为9.3拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高100倍。对773份动物样本进行检测,结果TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能检出53份布鲁氏菌阳性样本,而常规PCR只检出37份阳性。结果显示,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法比常规PCR方法更敏感,能够直接从动物样本中检出布鲁氏菌DNA,检测时间仅为2h。结论本研究首次建立了直接用于检测动物样本中布鲁氏菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,该技术适用于传染性病原体的快速检测与鉴定。     

TaqMan探针实时荧光PCR方法检测粪便中微小隐孢子虫卵囊

以微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)特异性DnaJ-like蛋白基因的保守序列为模板,设计和合成特异性引物和荧光标记探针,通过检测微小隐孢子虫卵囊DNA和加标模拟样品进行敏感性分析,建立标准曲线,并对其特异性和干扰性进行评价。结果显示,该方法只对微小隐孢子虫卵囊进行特异性扩增,其他常见的肠道原虫和肠道病原菌均不能扩增;微小隐孢子虫纯卵囊基因组DNA检测的灵敏度为26个/ml;对加标粪样可检测至2 600个/ml卵囊。提示本研究建立的实时荧光PCR检测微小隐孢子虫卵囊方法具有快速、特异性和敏感性高等优点。     

TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测土拉弗朗西斯菌

目的 建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(FQ-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌。方法 针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制作定量标准曲线,并以合成fopA基因为模板,PF、PR 为引物,研究其灵敏度、特异性和准确性。结果 构建了含fopA基因的重组质粒,以不同浓度的重组质粒制作标准曲线,在103~107拷贝数之间有较好的线性关系。灵敏度试验表明,该方法可检测到30.6个拷贝数的重组质粒,比普通PCR灵敏度高;特异性试验表明,能选择性检测土拉弗朗西斯菌,而与其他病原菌无交叉反应,与普通菌落PCR结果一致;重复性试验表明,拷贝数为3.06×106样品5次平行试验,标准差为0.201,变异系数为0.88%。结论 本研究建立了TaqMan探针FQ-PCR快速检测技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于快速、实时、定量检测土拉弗朗西斯菌,为快速检测生物战剂级微生物建立了一种人工合成特异基因TaqMan探针实时荧光定量PCR新方法。     

TaqMan?MGB探针实时荧光定量PCR用于中华按蚊kdr基因突变检测的研究

目的 目的 建立一种用于中华按蚊杀虫剂抗性相关kdr基因突变检测的实时荧光定量PCR方法。方法 方法 根据中华按蚊kdr基因序列及其L1014位点常见的突变类型设计一对引物和三条TaqMan?MGB探针, 对TaqMan?MGB探针实时荧光定量PCR反应体系和条件进行了优化, 选择经测序鉴定后的6种中华按蚊kdr基因常见类型对该方法进行验证, 并用该方法对50个实验室和113个现场中华按蚊样本进行检测。结果 结果 实时荧光定量PCR方法能对中华按蚊kdr基因6种不同的基因型进行检测, 单管法可判断kdr基因L1014是否发生突变, 双管法可对具体突变类型进一步鉴别。经检测, 50个实验室样本均为野生型纯合体, 而113个现场样本中, 仅12个样本为野生型纯合体, 其余101个样本均发生了L1014F或L1014C 突变, 突变频率为87.61%。结论 结论 TaqMan?MGB探针实时荧光定量PCR可用于中华按蚊kdr基因L1014位点突变的检测。     

裂谷热病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的RealtimePCR（实时荧光定量PCR）方法,用于裂谷热病毒（RVFV）的检测。方法根据裂符热病毒N蛋白基因的保守序列设计并合成一对引物及特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释重组质粒为标准品,进行Real-timePCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、准确性、特异性及敏感性检测。结果建立的Real-timePCR方法检测裂谷热病毒所绘制标准曲线的相关系数大于0．99,灵敏度为1．0×10^1拷贝,高于常规PCR方法（1．0×10^3拷贝）;除裂谷热病毒外的其他7种对照烈性病病原体基因检测均呈阴性;批内重复和批问重复的变异系数均小于1％。结论建立的裂谷热病毒Real-timePCR检测方法敏感性和特异性较高,可用于裂谷执病毒感染懊涑诊眯斤殛流行病学谰杏．     

基于TaqMan探针的猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒实时荧光定量PCR方法的建立

目的 建立一种能检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒（PRRSV）的TaqMan探针荧光定量PCR方法。方法 根据PRRSV的ORF7基因保守区的核苷酸序列设计引物和TaqMan探针,通过探针浓度的优化,建立检测PRRSV的TaqMan探针荧光定量PCR方法。用该方法对30份临床疑似病料进行检测, 并与常规RT-PCR方法和病毒分离方法进行比较。结果 TaqMan荧光PCR检测PRRSV的最佳探针浓度为0.4μmol,检测灵敏度可达3.51拷贝/μl。检测的30份样品与病毒分离结果的符合率为100%,与普通PCR的检测结果（25/30）比较,本方法对临床样品的检出率（28/30）更高。结论 建立的方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样品的检测。     

细粒棘球绦虫TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的 为建立高效、特异的细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)检测方法。方法 本研究设计了一组基于Eg线粒体基因的特异性引物和TaqMan探针,通过反应体系及条件的优化,建立了Eg荧光定量PCR检测方法。结果 该方法线性关系好,灵敏度高,在10⁹~10²拷贝/μL相关系数达0.998,灵敏度达10²拷贝/L;在特异性试验中,与其他病原虫株无交叉反应,特异性较好;重复性试验变异系数均低于3%。应用该方法对50份临床样品进行检测,发现6份为Eg感染阳性。结论 由此可见,建立的荧光定量PCR方法可快速、灵敏、特异地检测细粒棘球绦虫,具有一定的实际应用价值。     

不同方法抽提血清HBV DNA得率的比较

目的：比较不同的HBV DNA抽提方法对PCR产物量的影响,方法：将HBV DNA阳性血清及投入了HBV DNA质粒的HBV DNA阴性血清,分别采用7种不同方法抽提核酸,抽提物作PCR后,产物行琼脂糖凝胶电泳,并对阳性扩增条带进行密度定量,结果：血清直接煮沸法,经典的蛋白酶裂解加酚／氯仿抽提法,蛋白酶裂解加酚／氯仿抽提法省缺乙醇沉淀和柱抽提法的HBV DNA抽提得率分别为75．2％,13．8％,21．9％,用碱变性裂解和蛋白酶裂解后煮沸所得上清液,以及血清直接作为模板,行PCR后不能得到阳性扩增条带。结论：核酸抽提方法选择不当能直接影响基因检测的灵敏度,导致基因定量准确性下降,血清直接煮沸法抽提HBV DNA得率高,操作简便,省时和经济,值得推荐。     

荧光定量PCR法检测HBV感染者精液HBV DNA及其临床意义

乙型肝炎病毒 (HBV )感染的病原诊断及抗病毒疗效判断主要依赖于血清特异性抗原抗体和HBVDNA的检测 ,HBVDNA是复制活动最直接和可靠的指标 ,而血清检查结果常不能反映其精液的感染状况。为了解乙型肝炎患者精液感染情况及传染性 ,采用荧光定量PCR(FQ PCR)技术对 5 7例乙型肝炎患者精液HBVDNA作定量检测 ,现将结果报告如下。材料与方法一、标本来源及处理2 0 0 1年 6月～ 10月我院感染科门诊男性HBV感染者5 7例 ,年龄 2 0～ 4 0岁 ,平均 2 9.3岁。血清HBsAg均阳性。将精液置 37℃温箱内温化 30min。行精液常规分析 ,标本置 - 2…     

病毒性肝炎血清HBV DNA和HCV RNA同时检测的探索

本文对ＨＢＶ ＤＮＡ和ＨＣＶ ＲＮＡ用ＰＣＲ方法一次性同时检测技术进行了探索，经过９２例患者血清的检测的结果显示，与同份血清单一ＰＣＲ方法所检测的ＨＢＶ和ＨＣＶ感染阳性总鹰率为９８．１６％，说明此种多重套式ＰＣＲ方法对临床诊断ＨＢＶ和ＨＣＶ感染具有实用价值。     

建立PCR—ELISA定量检测HBV DNA的技术

目的 建立一种敏感特异和精确的乙型肝炎病毒基因ＰＣＲ及其产物酶联杂交定量分析技术。方法 制备了一种与野生扩增片段等长的ＰＣＲ内参照;设计了一对ＨＢＶ基因组Ｓ区基因扩增引物,上游引物的５′－端用生物素修饰,可同时扩增长为３１９ｂｐ的野生和内参照片段。两套捕获探针可分别与竞争ＰＣＲ产物中的野生片段和突变片段杂交,在同一反应管内,加入已知量内参照及待测ＨＢＶ ＤＮＡ标本。进行ＰＣＲ扩增,然后用酶联杂交法进行产物分析。根据Ｃｌｅｍｅｎｔｉ等介绍的公式计算待测标本中的ＨＢＶＤＮＡ标本。进行ＰＣＲ扩增,然后用酶联杂交法进行产物分析。根据Ｃｌｅｍｅｎｔｉ等介绍的公式计算待测标本中的ＨＢＶＤＮＡ含量。结果 灵敏度达到１０＾－３ｆｍｏｌ／Ｌ。在该法中,由于有ＰＣＲ过程中的特异引物及酶联杂交过程的特异探针两个环节的限制,因此具有很     

HBeAg和HBeAb同时阳性患者血清HBV DNA定量检测

目的观察患者血清HBeAg和HBeAb同时阳性(简称e系统双阳)时HBVDNA含量变化,以探讨两者的相关性.方法采用微粒子酶免分析法检测HBV-M,采用定量PCR法检测血清HBVDNA.结果e系统双阳者标本HBVDNA含量为104.6±1.31拷贝/mI;HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性(大三阳)者为106.5±1.89拷贝/ml,两者比较有显著性差异(P＜0.01).结论HBeAg(+)者S/N值与HBVDNA含量呈正比,e系统双阳者HBVDNA含量明显降低,但HBV并未停止复制,只是复制水平较低,传染性较小而已.     

中东呼吸综合征冠状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,用于中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的检测。方法根据中东呼吸综合征冠状病毒S蛋白基因的保守序列设计并合成一对引物及一条特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释重组质粒为标准品,进行Real-time PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、准确性、特异性及敏感性检测。结果建立的Real-time PCR方法检测中东呼吸综合征冠状病毒所绘制标准曲线的相关系数0.99,灵敏度为1.00×101拷贝,高于常规PCR方法(1.00×102拷贝);用该方法检测中东呼吸综合征冠状病毒基因为阳性,其他6种对照呼吸道病原体及冠状病毒基因检测均呈阴性;批内、批间重复试验的变异系数均1%。结论建立的中东呼吸综合征冠状病毒Real-time PCR检测方法灵敏、特异、重复性好,可用于中东呼吸综合征冠状病毒感染的快速诊断和流行病学调查。     

竞争PCR及其产物酶联杂交定量检测HBV DNA

（本文编辑：何亚玲校对：谢娜）我们用与野生模板等长和等效扩增的突变模板作为内参照,通过竞争ＰＣＲ对ＨＢＶ基因进行扩增,并引入微反应板酶联杂交技术对扩增产物定量分析。１．资料与方法：（１）ＨＢＶＤＮＡ标准品：质粒ｐＡＤＲ－１ＤＮＡ经ＢａｍＨ　Ｉ酶切线性化后精确定量。（２）ＰＣＲ２．１－ＷＳ３１９和ＰＣＲ２．１－ＭＳ３１９质粒：均由长征医院感染科实验室（简称本室）构建。（３）ＨＢＶＤＮＡ阳性血清抽提物（１０份）本室冻存。（４）竞争ＰＣＲ：在０．２ｍｌ薄壁ＰＣＲ反应管内,每管加入２５μＩＰＣＲｍｉｎ、…     

实时荧光定量PCR在登革热病毒快速检测中的应用

目的应用实时荧光定量PCR快速检测登革热病毒感染。方法采集疑似登革热患者血清,采用实时荧光定量PCR检测登革热病毒,同时采用ELISA检测血清登革热IgM抗体。结果患者发病第7d血清登革热IgM血清抗体A值为0.236和0.237(临界值0.250),高度疑似阳性,第13d血清IgM抗体阳性。患者发病第2d,通用型核酸检测显示血清登革热病毒核酸含量较多,经过治疗,于第7d病毒拷贝下降。发病第2d,核酸检测确定感染病毒为登革热Ⅲ型;发病第13d血清登革Ⅲ型病毒核酸检测阴性。结论实时荧光定量PCR法具有准确性好、灵敏度高等优点,可用于登革热病毒感染的快速检测。     

肝组织HBV DNA定量检查的临床意义

目的 由于对HBV感染的研究不断深入,抗病毒治疗亟待寻找判定效果的可靠方法,HBV DNA检测,特别是血液和肝组织定量检测显得极其重要。方法 不加选择在HBV感染者作肝活检时留取小粒肝组织,同时采血作HBVDNA定量检查。结果 急慢性HBV感染病例均示肝组织内HBV DNA检查明显高于血内检出率,同时肝组织HBV含量明显高于血液内含量。结论 肝组织检测HBV DNA可以明显提高HBV感染诊断率,血内HBV DNA阴转时不能说明肝组织内亦已阴转,血内HBV DNA阴转不宜随即停止治疗。     

实时荧光PCR技术用于RHc检测的研究

目的:探讨实时荧光PCR方法用于中国人群RHc基因检测的可行性。方法:收集144例大连地区RhD阳性健康献血者血样,使用血清学分型方法检测样本RhCcEe血型表型。使用检测RHCE基因第2外显子178C>A和307C>T多态性位点的TaqMan探针实时荧光PCR方法对血液标本进行RHc基因分型,并将基因分型结果与血清学分型结果相比较。结果:经血清学检测,144例样本中有60例为CCee、48例为CcEe、17例为ccEE、11例为Ccee、7例为ccEe、1例为ccee;经TaqMan探针实时荧光PCR方法检测,发现RHc基因阳性为84例、阴性为60例,基因分型结果与血清学分型结果一致,该方法的灵敏度、特异度和准确度均为100%。结论:TaqMan探针实时荧光PCR方法适用于检测中国人群RHc基因,可用于临床实验室对Rhc血型进行基因检测。