K562细胞定向表达cDNA文库的快速构建

采用一步法快速从培养的Ｋ５６２细胞中抽提、纯化ｍＲＮＡ，逆转录成ｃＤＮＡ分子后，通过在ｃＤＮＡ分子两端加ＥｃｏＲＩ适配子、Ｔ４多核苷酸激酶作用下磷酸化、ＮｏｔＩ内切酶消化、过ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ柱等步骤，与λＥｘＣｅｌｌ／ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ／ＣＩＰ载体连接，然后用包装蛋白在体外包装连接产物，感染Ｅ·ＣｏｌｉＮＭ５２２以构建ｃＤＮＡ文库。经检测：该文库含有１．０×１０６个重组子，ｃＤＮＡ分子长度在０．４～８．５ｋ６范围，扩增后的滴度达１．２×１０１０ｐｆｕ／ｍｌ，完全达到筛选低表达基因的要求，为从Ｋ５６２细胞中克隆新的锌指蛋白ｃＤＮＡ基因奠定了基础。并对构建ｃＤ－ＮＡ文库的关至和应用进行了讨论     

苦参碱诱导 K562 细胞分化相关 cDNA 的克隆

目的 克隆苦参碱诱导人白血病Ｋ５６２细胞分化的相关基因,以求了解白血病分化及苦参碱的作用机制。 以人白血病细胞Ｋ５６２为研究对象,在苦参碱诱导其分化的基础上,利用ｍＲＮＡ差异显示技术对Ｋ５６２细胞在苦参碱诱导前及诱导后４８小时的基因表达情况进行分析。结果 在苦参碱诱导前后Ｋ５６２细胞之间存在明显的基因表达差异。一些基因在诱导后表达增强,而一些基因经苦参碱作用后表达减弱甚至完全抑制。经克隆和筛选获得     

人早幼粒细胞cDNA文库的构建及其鉴定

目的：构建人早幼粒细胞HL60的cDNA文库,阐明文库内相关基因在急性早幼粒细胞白血病（APL）发生发展中的相关机制。方法：采用Trizol法提取HL60细胞总RNA,离心柱法分离纯化样本中的mRNA,逆转录PCR法合成cDNA第一链,酶促法直接合成cDNA第二链,胶回收目的长度的cDNA片段后将其与pPR3-N载体连接,通过同源重组方法在酵母Y187菌株中构建人早幼粒细胞cDNA文库。将培养的菌液涂布于LB平板进行库容量鉴定,PCR法鉴定插入片段大小及分布。结果：提取到的HL60细胞RNA条带清晰无降解且弥散度低,以纯化后的细胞mRNA为模板成功合成cDNA,经胶回收cDNA片段后顺利将其与pPR3-N载体连接。将重组载体转化至酵母菌株Y187,通过同源重组方法在菌株中成功构建人早幼粒细胞cDNA文库。在原始电转化菌稀释100倍后取10 μL涂板,共长约250个克隆子,库容量为2.5×10⁶ CFU·mL^-1,转化后原始菌液共计5 mL,总库容量为1.25×10⁷ CFU。文库的插入片段电泳检测,平均插入片段大于1200 bp,阳性率为100%。结论：成功构建人早幼粒细胞的cDNA文库,为白血病的发病机制及治疗机制的研究奠定了基础。     

人肝癌细胞cDNA文库的构建及鉴定

0　引言2 0世纪 90年代起 ,原发性肝癌已上升为我国第二位癌症杀手 ,加紧对其复发、转移机制及相关抗原的基础研究工作十分必要 [1] .我室多年来制备了数株肝癌特异性单克隆抗体 ,其中一株抗体与放射性核素的交联物治疗肝癌已处在临床验证阶段 .找到这几株单抗的相应抗原基因对肝癌的基础研究应很有意义 .利用抗体寻找抗原基因的最有效方法是构建c DNA文库 [2 ] ,继而进行筛选、克隆等 .我们选取与几株单抗的免疫荧光及 Western免疫印迹反应均呈阳性结果的肝癌细胞株 HHCC作为建库材料来源 ,以λgt11DNA为载体 ,构建了人肝癌细胞 c DN…     

从K562细胞中克隆新的锌指蛋白cDNA基因的初步研究

采用５加端ＰＣＲ从Ｋ５６２ｒＤＮＡ文库中扩增出含锌指结构域的ＣＤＮＡ基因片段，重组至ＰＧＥＭ７ＺＤＮＡ载体中，通过ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交初步从Ｋ５６２ＣＤＮＡ文库中筛选出９个含锌指基因片段的重组克隆。经ＤＮＡ序更分析和基因库检索，发现有２个克隆的序列与已知基因差异显著，有可能为新的锌指基因片段。     

cDNA表达点阵研究苦参碱诱导K562细胞凋亡基因表达的改变

1　材料和方法1.1　材料　 Atlas Human Apotosis Array kit (Clontech产品 )由美国加州希望城国家医学中心 Dr. L i惠赠 ,[α- 32 P]d ATP购自北京亚辉公司 ,苦参碱购自陕西天奇植物化学有限公司 ,K5 6 2细胞购自本校免疫学教研室 .1.2　方法　将生长状态良好细胞分为实验组和对照组 ,实验组用 0 .2 g· L- 1 苦参碱溶液处理 ,对照组细胞不做任何处理 ,3d换液 1次 .分别收集对照组及苦参碱作用 7d实验组细胞 ,提取总 RNA,紫外分光光度仪检测纯度、RNA甲醛变性凝胶电泳检测完整性后 ,冻存于 - 70℃备用 .按说明书富集两组总 RNA中…     

人乳腺癌细胞cDNA文库的构建及鉴定

目的 :应用前期制备的一株乳腺癌单克隆抗体 (M4G3) ,筛选出高表达其相关抗原的乳腺癌细胞系T47D ,并利用此细胞系构建了以λgt11为载体的cDNA文库 ,为完成此乳腺癌特异抗原基因的克隆与表达奠定基础。方法 :在4株乳腺癌细胞中应用M4G3单抗进行免疫组化和WesternBlot检测 ,以其中一株T47D细胞为材料构建以λgt11为载体的cDNA文库 ,并进行文库质量鉴定。结果 :文库含有9 97×105个重组子 ,重组效率达到96 7 % ,插入的cDNA片段平均长度为1 0kb。结论 :与M4G3单抗结合的乳腺癌抗原分子量约为48000dalton。构建的T47D细胞cDNA文库完整 ,具有较好的质量 ,为进一步筛选奠定了基础。     

K562细胞的诱导分化与表型

Ｋ＿５６２细胞的诱导分化与表型临床生化教研室泰建平综述蒋纪恺，王霞文审校中图分类号Ｒ７３３．７目前对于白血病的治疗主要是用化疗、骨髓移植等，但疗效都不能令人满意。因此，探讨新的治疗途径显得十分必要而迫切。自从ＬｅｏＳａｃｈｓ于１９７８年报告恶性肿瘤细...     

氨茶碱对K562细胞增殖与凋亡的影响

目的 为探讨磷酸二酯酶抑制剂在慢性粒细胞白血病细胞系增殖与凋亡中的作用,研究了非选择性磷酸二酯酶抑制剂氨茶碱对K562细胞系的影响.方法 采用MTT检测观察细胞增殖变化,膜联蛋白V染色观察细胞凋亡率.结果 MTT显示氨茶碱对K562细胞系增殖呈浓度依赖性抑制作用,膜联蛋白V染色显示氨茶碱诱导细胞凋亡率增加.结论 氨茶碱可诱导K562细胞凋亡.     

HMy2细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的 :构建人骨髓瘤细胞株HMy2cDNA表达文库 .方法 :提取HMy2细胞总RNA ,分离mRNA ,反转录合成双链cDNA ,消平cDNA末端 ,连接EcoRⅠ适配子 ,磷酸化EcoRⅠ适配子 5′端 ,Sephacryl S4 0 0柱除去小于 4 0 0bpcDNA片段 ,与去磷酸化的噬菌体λgt11连接 ,体外包装后建成cDNA文库 .取出一部分倍比稀释感染E .coliY10 90 ,测定文库大小、重组率 ,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小 .结果 :构建成含 1.5× 10 6重组子的人骨髓瘤细胞cDNA文库 ,重组子平均插入外源片段长约 1.4kb .结论 :所建文库合格 ,适合用于筛选目的cDNA克隆 .     

manumycin对人髓系白血病细胞株K562细胞的增殖抑制作用

探讨manumycin对人髓系白血病细胞株K562细胞的增殖抑制作用,为其治疗白血病提供理论依据。方法：实验设阴性对照组（K562加含10%胎牛血清的IMDM培养液）和manumycin组（终浓度分别为2、4、8及16 μmol/L）,分别作用24、48和72 h,镜下观察manumycin作用后K562细胞的生长情况;MTT法检测K562细胞的生长抑制率;24 h 后,用Western blotting方法检测对照组及4、 16 μmol/Lmanumycin组K562细胞中survivin蛋白的表达。结果：镜下观察显示,对照组细胞生长状态良好,密度均一,大小一致,轮廓清晰,折光性强。与对照组比较,8 μmol/L manumycin组细胞明显变小,密度稀疏,大小不均一,细胞轮廓欠清晰,折光性差;16 μmol/L  manumycin组细胞密度明显减少,大小不等,轮廓不清,有细胞碎片。MTT结果显示,随着manumycin浓度增加和作用时间延长,生长抑制率逐渐增加,与对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）,且存在时间-剂量-效应关系。Western blotting结果显示,与对照组比较,16 μmol/L manumycin作用K562细胞24 h以后细胞内survivin蛋白含量下降。结论：manumycin通过下调K562细胞survivin蛋白的表达,促进细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的生长,从而达到治疗白血病的目的。     

重组人粒细胞集落刺激因子对K562细胞凋亡和其细胞毒药物敏感？…

目的 探讨重线人粒细胞集落刺激因子（ｒｈｕ Ｇ－ＣＳＦ）对Ｋ５６２细胞凋亡和其细胞毒药物敏感性的影响。方法 采用流式细胞术和ＭＴＴ法分别测定细胞凋亡和细胞毒药物敏感性。结果 在低血清培养条件下,ｒｈｕ Ｇ－ＣＳＦ对Ｋ５６２细胞的凋亡有抑制作用,其凋亡百分率与ｒｈｕ Ｇ－ＣＳＦ浓度呈负线性样;ｒｈｕ Ｇ－ＣＳＦ可增加Ｋ５６２细胞对Ａｒａ－Ｃ的敏感性,而降低其对ＤＮＲ的敏感性,在Ａｒａ－Ｃ和ＤＮＲ联合     

川楝素提取物诱导 K562 细胞凋亡的实验研究

目的 探讨川楝素提取物对人白血病 K562 细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用及其机制。方法 采用 MTT 法检测川楝素提取物对 K562 细胞增殖的影响;Wright′s染色观察细胞的形态学改变;流式细胞技术检测细胞周期与凋亡率的变化;Annexin V/PI 双标记法检测细胞的早期凋亡变化;DNA 琼脂糖凝胶电泳观察 DNA 片段化;比色法检测 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 相对活性的改变;RT-PCR 检测凋亡相关基因 p21、bcr/abl、H-ras mRNA 表达水平的改变。结果 川楝素提取物显著抑制 K562 细胞的增殖,并呈剂量-时间依赖性,作用 72 h 的 IC50值为 20 nmol/L;处理组细胞可见典型的凋亡形态学改变;细胞周期和 Annexin V/PI 双标记检测表明川楝素提取物可诱导 K562 细胞凋亡,并呈剂量-时间依赖性;处理组细胞 DNA 琼脂糖凝胶电泳出现明显的 DNA ladder;处理组细胞 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 的活性均显著增加;p21、H-ras mRNA 表达上调,bcr/abl mRNA 表达下调。结论 川楝素提取物对 K562 细胞具有增殖抑制和诱导凋亡的作用,其机制与 Caspase 信号途径的活化有关。     

人参皂甙单体Rg3对人红白血病细胞株K562细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨人参皂甙单体Rg3对人红白血病细胞株K562细胞增殖及凋亡的影响.方法 将人红白血病细胞株K562细胞传代培养至对数生长期,分组加入不同浓度的人参皂甙单体Rg3,并设置空白对照组.用MTT比色法观察Rg3对体外培养的K562细胞生长的抑制作用;在光学显微镜下观察不同浓度人参皂甙单体Rg3对K562细胞的凋亡作用及计数凋亡率(AR);硝基四氮唑(nitroblue tetrazolium,NBT)还原能力测定试验检测分化指标;DNA琼脂糖凝胶电泳呈现典型的DNA梯形条带图谱.结果 MTT比色法测定显示,人参皂甙单体Rg3作用于K562细胞后可以抑制其增殖并诱导其凋亡,且呈剂量依赖性.结论 人参皂甙单体Rg3能抑制体外培养的K562细胞增殖并诱导其凋亡.     

p16基因在K562/A02细胞株表达情况的研究

目的:研究p16基因在K562/A02细胞株的表达情况及其与耐药的关系。方法:用PCR法对慢性髓系白血病细胞株K562及其耐药细胞株K562/A02进行p16基因缺失检测。结果:K562及K562/A02细胞株经PCR扩增后,均未扩出相应条带。结论:K562/A02细胞株与K562细胞株一样,均表现为p16基因缺失。     

三尖杉酯碱诱导慢性髓系白血病K-562细胞凋亡的实验研究

目的阐明三尖杉酯碱（HT）作用于K562细胞的机制。方法应用细胞形态、DNA凝胶电泳和流式细胞仪等检测,观察HT对K562细胞株的作用方式,进一步用RT-PCR方法研究bcr/abl基因在转录水平的改变。结果0.01～100.00μg/ml浓度HT可诱导K562细胞凋亡,并呈时间和剂量依赖性。随着药物作用时间的延长,bcr/abl基因的转录下调。结论低浓度HT就可通过抑制bcr/abl基因的表达,诱导K562细胞凋亡。     

人胎肝cDNA文库构建及鉴定

从人胎肝组织提取总ＲＮＡ并纯化出ｍＲＮＡ，经反转录合成第一、二链ｃＤＮＡ，去除小于２００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段后，连接ＥｃｏＲＩ人工接头，与去磷酸化的λｇｔ１１噬菌体长、短臂连接，体外包装后感染Ｅ．ｃｏｌｉＹ１０９０，成功构建含４．２×１０８重组子的人胎肝ｃＤＮＡ表达文库，重组子平均外源插入片段约１．５ｋｂ，适合用于筛选低丰度ｍＲＮＡ的ｃＤＮＡ克隆。