巢式PCR方法在快速检测新生儿败血症病原菌中的应用

目的探讨巢式聚合酶链反应(PCR)方法在快速检测新生儿败血症病原菌中的应用价值。方法以细菌16S rRNA基因为扩增靶序列,设计一对所有细菌通用引物和一对革兰阴性菌特有引物,用巢式PCR方法扩增已知病原菌,检测其特异性。用巢式PCR方法和培养法同时检测新生儿败血症血液,对2种方法的检测结果进行比较分析。结果已知实验菌株经通用引物扩增后均获得920 bp产物,革兰阴性菌经革兰阴性菌特有引物扩增后获得353 bp产物,而革兰阳性菌、人类基因组DNA、巨细胞病毒和白色假丝酵母菌无相对应产物。2种方法检测病原菌革兰分型吻合度一致,但巢式PCR方法阳性率高。结论巢式PCR方法检测新生儿败血症病原菌,具有快速、敏感度高等优点,并能对病原菌进行革兰分型,具有一定的实用价值。     

半套式PCR检测军团菌方法的建立及应用

目的：建立检测军团菌的分子生物学方法。方法：采用常规PCR对军团菌属16SrRNA编码区域和嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强子（mip）基因编码区域进行扩增，同时采用半套式PCR对常规PCR的扩增结果进行确证。结果：采用常规PCR对军团菌属16SrRNA编码区域进行扩增，5种军团菌（包括3种嗜肺军团菌）扩增产物均可见654bp的特异性扩增带，非军团菌菌株PCR结果为阴性，采用半套式PCR对常规PCR扩增产物进行验证,扩增产物均可见430bp扩增带，同时采用常规PCR对嗜肺军团菌mip基因 编码区域进行扩增，3种嗜肺军团菌扩增产物均可见649bp扩增带，非嗜肺 军团菌菌株均为阴性，采用半套式PCR对常规PCR扩增产物进行验证，3种嗜肺军团菌扩增产物均可见399bp扩增带。敏感性为10CFU／ml。并且应用此方法成功检测环境水样中分离的疑似军团菌菌株。结论：半套式PCR经济、简便、快速、敏感、特异，为军团菌的早期检测、环境监测、控制爆发流行提供了有效手段。     

应用通用引物PCR检测诊断细菌和真菌性中枢神经系统感染的价值

目的了解细菌和真菌性中枢神经系统（CNS）感染病原谱,并探讨通用引物聚合酶链反应（PCR)检测技术的病原学诊断价值。方法收集某院2009年1月—2015年3月疑似或确诊CNS细菌或真菌性感染患者资料,分析其脑脊液培养病原菌种类,采用细菌16S rRNA和真菌28S rRNA通用引物对患者脑脊液DNA进行PCR扩增和序列测定,并与同期脑脊液培养及鉴定结果进行比较。结果共收集确诊或疑似CNS细菌或真菌感染者400例,其中脑脊液培养阳性132例。共分离病原菌150株,其中革兰阳性菌48株,革兰阴性菌90株,真菌12株;居前3位的细菌为鲍曼不动杆菌（32株）、凝固酶阴性葡萄球菌（16株）和肺炎克雷伯菌（13株）;最常见真菌为新生隐球菌（8株）。选取88份感染患者脑脊液标本和20例非感染患者脑脊液进行PCR扩增,PCR扩增法灵敏度（35.23％,31/88）高于培养法（28.41%,25/88）（χ2＝4.17,P＜0.05）。PCR扩增和培养法阴性预测值分别为25.97%、24.10%,两种方法的特异度、阳性预测值均为100.00%。PCR扩增测序与培养结果符合率为84.00%（21/25）;PCR检测平均报告时间（48 h）较培养结果报告时间（细菌平均约72 h,真菌平均约96 h）更快速。结论CNS 感染病原分布广泛,以革兰阴性菌为主;通用引物PCR检测具有快速、灵敏、准确等特点,具有良好的临床推广和应用价值。     

致病菌耐药因子分布及特征分析

目的 对临床菌株中的整合子分布及其携带耐药基因盒的结构特征进行分析。方法 应用多重PCR方法检测55株临床菌株中的3类整合酶基因intⅠ。并对intⅠ阳性菌株耐药基因盒进行测序及序列分析。结果 55株临床菌株均为第1类整合酶基因阳性（100％）。耐药基因盒特异PCR扩增发现，27株革兰阳性菌株和22株革兰阴性菌株均得到1913bp的扩增产物，携带基因盒为dhfr、orfF和aadA2；6株革兰阴性菌得到1664bp的产物．携带基因盒为aadA5和dfrl7。aadA2和aadA5均为编码对氨基糖苷类抗生素产生耐药的基因盒。dhfr和dfr17均为编码对磺胺类药物甲氧苄氨嘧啶产生耐药的基因盒；orfF为未知功能的开放阅读框。结论 临床致病革兰阳性菌和革兰阴性菌株均广泛存在着整合子结构．应加强对耐药基因在细菌种属间水平转移的监测工作。     

多重PCR特异检测布鲁氏菌方法的建立

目的建立一种快速检测布鲁氏菌的多重PCR方法,为临床快速检测、准确诊断布鲁氏菌提供依据。方法针对布鲁氏菌外膜蛋白31 kD、22 kD和2a基因,各设计一对引物,扩增片断大小分别为427 bp3、17 bp和830 bp。利用纯培养物和模拟标本,分析这3对引物的特异性和敏感性。结果3对引物均能特异扩增布鲁氏菌的DNA,31 kD、22 kD和2a,扩增纯培养物的敏感性分别为2.8×103、4.6×103和2.1×104cfu,将3对引物组合在一起建立了多重PCR方法,能从模拟的细胞和血液标本中扩增出特异的产物,对模拟的细胞感染标本的敏感性为1×105cfu,对模拟的血标本的敏感性为1.2×106cfu。结论针对外膜蛋白基因,建立了能特异地检测标本中布鲁氏菌的多重PCR检测方法。     

用两种聚合酶链反应方法检测流感病毒

目的：建立特异敏感的快速检测流感病毒的分子生物学方法。方法：用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果：以流感病毒的H基因为模板设计的3对引物能特异性地扩增出942bp,1117bp和751bp的核酸片段，它们分别和甲1，甲3和乙型流感病毒有稳定对应的关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0．1TCID50的样品。结论：多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法。     

浙江地区新生儿血培养病原菌分布及耐药性分析

目的 了解浙江地区新生儿血培养病原菌分布及其常见病原菌对抗生素的耐药情况。方法 对我院新生儿科5442例患儿入院时行血培养并以VTTEK全自动微生物分析仪进行菌株鉴定及药敏试验。结果 5442例新生儿血培养标本共检出病原菌301株，总阳性率为5．5％；其中革兰阳性菌267株，占88．7％，革兰阳性菌中以凝固酶阴性葡萄球菌为主，占革兰阳性菌的88．4％，占总分离率的78．4％。革兰阴性菌33株，占11．0％，革兰阴性菌以大肠埃希菌居多，占革兰阴性菌的36．4％，占总分离率的4．0％。药敏结果显示革兰阳性菌对青霉素G耐药率最高，其次为苯唑西林、头孢唑啉、氨苄西林／舒巴坦、红霉素。革兰阴性菌中大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌ESBLs的检出率分别为41．7％、87．5％；这些菌株时环丙沙星、丁胺卡那霉素、左旋氧氟沙星、哌拉西林／他唑巴坦、亚胺培南的耐药率较低。结论 本地区新生儿血培养病原菌以革兰阳性菌为主，凝固酶阴性葡萄球菌是主要病原菌，其次为大肠埃希菌。对常用抗生素的耐药现象比较严重。     

胎儿各器官和组织中VEGF转录丰度的研究

目的：利用RT-全套式PCR对胎儿各器官和组织中VEGF转录丰度进行研究。方法：检索人VEGFmRNA的序列，设计、合成上下游引物，提取总RNA，使用RT的方法合成cDNA，通过全套式PCR对VEGF特异性条带（374bp）进行鉴定。结果：经过agarose电泳检测，人胎儿期各器官和组织cDNA的PCR扩增产物中，均出现一条不同灰度：374bp的特异性条带。结论：VEGF在胎儿各器官和组织中转录丰度顺序为：大脑、心脏、肾脏、骨骼肌、肝脏、肺脏。     

呼吸科病房病原菌的分布及耐药性分析

目的：分析我院呼吸科病房呼吸系统疾病的病原菌分布、耐药率及其变化，为合理选用抗菌药物提供参考。方法分析2011年初---2012年末呼吸科病房痰标本送检培养的208株病原菌。结果病原菌分布在慢性阻塞性肺疾病（36．1％）、肺炎（23．2％）、支气管扩张（16．7％）等疾病。革兰阴性菌（71．6％），革兰阳性菌（17．8％），真菌（10．6％）；革兰阴性菌有铜绿假单胞菌、克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌等；革兰阳性菌以金黄色葡萄球菌为主；真菌为白色念珠菌、热带念珠菌。革兰阴性菌耐药率高，碳青霉烯类对其保持敏感性；未见耐万古霉素的球菌。结论临床上除积极控制耐药菌在病房的传播，同时要合理地运用抗菌药物。     

人副流感病毒HPIV多重RT—PCR快速检测方法的建立

目的建立快速检测人副流感病毒的多重PCR方法。方法通过查阅文献获取副流感病毒的PCR引物序列，并利用分子生物学软件对其进行评估，同时设计合成半巢式PCR引物。提取分离病毒的总RNA，以RNA抽提物为模板，一步法一次反转录扩增HPIV-1，2，3，4等4种型别的副流感病毒。以多重RT—PCR产物作为模板，用半巢式PCR进一步扩增确认。结果利用多重RT—PCR方法一次扩增出人副流感病毒的4个不同型别，条带大小分别是317、507、189和451bp，与目的片段大小一致；半巢式PCR扩增出相应的特异条带，条带大小分别是261、340、145和390bp，扩增结果与目的片段大小一致。结论人副流感病毒多重RT—PCR快速检测方法已初步建立。     

3种食源性致病菌的多重PCR检测方法研究

目的建立一种快速、经济、实用的多重PCR方法,期望能同时检测3种常见致病菌。方法根据沙门氏菌的侵袭蛋白A（invasion protein A,invA）、志贺氏菌的侵袭性质粒抗原H基因（invasion plasmid antigen,ipaH）、副溶血性弧菌的不耐热肠毒素基因（thermolabile hemolysin,tlh）分别设计了3对引物,预计PCR扩增的目的片段依次为284、450、606bp。对单个基因PCR和单管多重PCR扩增进行特异性、敏感性试验以及优化反应体系,建立快速检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌的单管多重PCR方法。结果含沙门氏菌：42cfu/g,志贺氏菌：36cfu/g,副溶血性弧菌：116cfu/g的肉陷样品经过增菌、DNA提取、扩增、电泳,在16～18h内应用多重PCR体系能够检出。通过对10株目的菌和15株非目的菌检测,提示该体系特异性高。结论初步建立能快速,灵敏,特异地检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌的多重PCR体系,可以作为食物中毒病原菌检测的有效方法。     

鉴别脑膜炎奈瑟菌A、B、C、Y、W135群的多重聚合酶链反应诊断方法

目的建立一种能鉴别脑膜炎奈瑟菌（Nm）A、B、C、Y、W1355个血清群的多重聚合酶链反应（PCR）方法.方法首先PCR扩增Nm crgA基因,确定Nm感染;再通过多重PCR扩增荚膜表达基因orf-2和siaD基因,根据特异条带区分不同群Nm.结果多重PCR检测61株Nm与4株非Nm,能准确地鉴定并可将Nm分成5个血清群;检测4例流行性脑脊髓膜炎患者的脑脊液,2例出现A群400 bp的特异条带,而细菌培养和胶乳凝集方法检测均为阴性;检测18份流行性乙型脑炎患者标本,与胶乳凝集试验结果一致.结论多重PCR诊断方法能正确鉴别不同群Nm,对流行性脑脊髓膜炎的临床诊断与流行病学调查有重要意义.     

神经外科患者脑脊液病原菌分布及耐药性变迁

目的了解北京天坛医院神经外科患者脑脊液分离病原菌及其耐药趋势变化情况。方法对1997年8月—2013年8月该院神经外科患者脑脊液标本分离的病原菌情况及其药敏结果进行分析。结果共分离病原菌2 732株,其中革兰阳性(G+)菌1 946株(71.23%),革兰阴性(G-)菌786株(28.77%)。居前3位的病原菌分别为葡萄球菌属(1 751株,64.09%)、不动杆菌属(254株,9.30%)和肠球菌属(172株,6.30%)。G+菌仍占主体,其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)检出率分别为74.34%和80.73%;但近年G-菌逐渐增多。所有葡萄球菌属对万古霉素、利奈唑胺保持较高敏感性(90%);G-菌总体敏感率下降,尤其不动杆菌属对亚胺培南及美罗培南的敏感率分别为51%、44%。结论神外患者颅内感染仍以G+菌多见,MRSA和MRCNS检出率高;但近年,G-菌,尤其是泛耐药的不动杆菌属所占比例呈上升趋势。     

单核细胞增生李斯特菌PCR鉴定技术的研究

目的建立单核细胞增生李斯特菌PCR鉴定技术.方法选择Hly Inl基因设计扩展片段分别为300～400bp、600～700bp的二对特异性引物,进行PCR扩增.结果单增李斯特菌标准菌株及本实验室分离保存的单增李斯特菌均扩增出两条明显条带,其它食品中常见致病菌及非单核细胞增生李斯特菌均不见扩增条带.52株李斯特菌生化符合菌中,有30株菌同时扩增出两条明显条带,与Mini-VIDSA测定法比较,两者符合率达92.31%.结论本实验建立的PCR鉴定技术为一种简便、快速、敏感、特异的单增李斯特菌鉴定方法.     

微型寡核苷酸芯片检测脑脊液病原菌研究与应用

目的建立快速检测脑脊液标本中常见病原菌的微型寡核苷酸芯片。方法根据脑脊液中常见病原菌16S rRNA基因序列设计通用引物和检测探针;探针固定于尼龙膜上制成寡核苷酸芯片;通用引物扩增病原菌DNA并标记生物素,产物与芯片进行反向杂交检测;对该体系的敏感性和特异性进行了测试,并检测了32例临床病原菌感染的脑脊液标本。结果所有实验菌株均只与芯片上相应探针杂交。该法最低可检测出10 CFU/ml的大肠埃希菌;32例临床本的检测结果与常规鉴定法完全一致。结论该寡核苷酸芯片法能够准确、敏感、快速地检测脑脊液标本中的病原菌。     

食品样品中大肠杆菌O157:H7复合PCR检测方法的研究

根据大肠杆菌O15 7:H7特异性基因fliC ,rfbE ,SLTI与SLTII设计四对引物 ,建立了复合PCR方法 ,扩增产物长度分别为为 5 6 0bp ,6 78bp ,2 10bp与 4 84bp。该方法可以一步检测出O15 7与H7特异性抗原基因 ,并可同时检测该菌产生SLT毒素的类型 ,与 71株试验菌株的基因型完全配合 ,是一种特异、高效的检测方法。该方法适用于牛奶样品中大肠杆菌O15 7:H7的检测 ,经过增菌步骤检测限可达 0 1cfu ml     

山东地区不同季节优势恙螨自然感染恙虫病东方体的分子流行病学调查

目的从分子水平探讨山东地区不同季节优势恙螨自然感染恙虫病东方体（Ot）情况及其作为恙虫病传播媒介的可能性.方法根据Ot-Sta56 kDa外膜蛋白基因部分序列设计Ot种和型特异性引物,对标本提取的DNA先采用种特异性引物扩增,然后再采用型特异性引物扩增分型,并对部分标本进行序列测定.结果从不同季节优势恙螨幼虫共得到11株Ot分离株和16份恙螨匀浆,从这27份标本提取的DNA经首轮PCR扩增后,18份标本有预期的目的带.对首轮PCR产物采用nested PCR扩增分型,结果17份为Kawasaki型,1份（LHGM2株）为Karp型.序列同源性分析结果证实了nested PCR分型结果：XDM2株首轮PCR产物碱基序列与Kawasaki型相应DNA片段的碱基序列同源性最高,为97.00%,在系统发育树上与Kawasaki株位于同一分支,应属于Kawasaki型;LHGM2株首轮PCR产物碱基序列与Karp型相应DNA片段的碱基序列同源性最高,为96.45%,在系统发育树上与Karp株位于同一分支,应属于Karp型.结论山东地区不同季节优势恙螨中存在Ot自然感染,Ot主要基因型为Kawasaki型.     

两种反转录聚合酶链反应检测甲型肝炎病毒

目的 建立一种灵敏、特异的RT－PCR 方法检测环境中的HAV。方法 对两种RT－PCR，即常规两步法RT－PCR和一步法RT－PCR检测HAV的效果进行了观察，并采用半套式PCR对扩增产物的特民划性进行验证。结果两种RT－PCR与半套式PCR检测HAV均得到预期条带，所设计的引物对其它的肠道病毒扩增呈阴性；在同等反应条件下，一步RT －PCR的反应效率远高于常规RT－PCR，二者的检测灵敏度也有显著性差异，一步RT－PCR的检测灵敏 度为10TCID50／ml，两步法RT－PCR检测灵敏度为10^3TCID50/ml.结论 一步RT -PCR较常规RT-PCR易于操作,重复性好,不易污染,具有更高的反应效率和灵敏度.