超声辅助VEGF165转染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞定向分化血管内皮细胞的可行性研究。方法 VEGF165基因的质粒PEGFP-C1，采用超声辅助电穿法转染骨髓间充质干细胞，转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况。结果 超声辅助转染后5h可见细胞内有GFP表达，10h后可达高锋，持续3天左右，其后有些细胞荧光开始减退。结论 VEGF基因转染骨髓间充质干细胞后，骨髓间充质干细胞内有GFP表达，提示细胞转染成功，骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。     

超声辅助转基因治疗缺血性心脏病的骨髓间充质干细胞的实验研究

目的血管内皮生长因子（VEGF）基因转染骨髓间充质干细胞,探讨骨髓间充质干细胞定向分化血管内皮细胞的可行性研究。方法VEGF165基因的质粒PEGFP-C1,采用超声辅助电穿法转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达情况。结果超声辅助转染后5h可见细胞内有GFP表达,10h后出现表达高锋,持续3d左右,其后有些细胞荧光开始减退。结论VEGF基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有GFP表达,提示细胞转染成功,骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。     

AKT1基因过表达骨髓间充质干细胞的建立

目的 使用慢病毒系统建立AKT1基因过表达的稳转骨髓间充质干细胞.方法 扩增AKT1 cDNA基因,并构建AKT1-cDNA表达载体,再结合穿梭质粒pCDH1-AKT1转染人胚肾293T细胞进行扩增后,使用慢病毒转染系统进行基因重组,并以其为载体转染猪的骨髓间充质干细胞,观察其荧光表达,采用Western blot和RT-PCR分别检测AKT1蛋白和mRNA表达水平.结果 双酶切鉴定和测序结果表明,所获取的cDNA为AKT1的蛋白质编码功能区基因.293T细胞和骨髓间充质干细胞的转染效率均达到90％以上.Western blot和RT-PCR结果表明,稳转细胞的AKT1蛋白和mRNA表达水平均明显高于原代细胞.结论 成功构建AKT1-cDNA表达载体;通过使用慢病毒系统,猪骨髓间充质干细胞能长期稳定过表达AKT1.     

山柰酚体外促成骨分化作用研究

目的 探究不同浓度的山柰酚对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响。方法 使用含不同浓度山柰酚的培养基培养骨髓间充质干细胞,通过CCK8检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶活力检测细胞的碱性磷酸酶表达水平,茜素红染色观察钙化结节形成情况,实时荧光定量聚合酶链式反应检测细胞Runx2、OCN成骨相关基因的表达水平。结果 10^-4mol/L山柰酚对骨髓间充质干细胞增殖分化有明显抑制作用(P <0.05),10^-5、10^-8mol/L山柰酚对骨髓间充质干细胞增殖分化无影响(P> 0.05),10^-6、10^-7mol/L山柰酚对骨髓间充质干细胞增殖有明显促进作用(P <0.05),其中10^-6mol/L山柰酚还可促进骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶表达、成骨矿化以及Runx2、OCN成骨相关基因的表达。结论 10^-6mol/L山柰酚可以促进骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化。     

骨内应力环境下复合血管内皮生长因子骨髓基质干细胞修复创伤性股骨头坏死的实验研究

目的探讨骨内应力对转染VEGF基因的骨髓间充质干细胞修复创伤性股骨头坏死的作用。方法设计制作能骨内加压的空心螺钉,骨髓间充质干细胞培养并转染VEGF基因,20只实验犬通过手术截断股骨颈方法造模,根据术后不同的处理方法分为四组:A组(单纯空心螺钉固定);B组(空心螺钉加人工骨填塞);C组(空心螺钉加复合转染VEGF的骨髓间充质干细胞的人工骨填塞);D组(空心螺钉加复合转染VEGF的骨髓间充质干细胞的人工骨填塞,同时加压)。造模20周后,行大体观察、X线及组织学、免疫组化及Western blot检测骨修复效果。结果通过手术方式成功制作出创伤性股骨头坏死的动物模型;在造模20周后,D组血管计数和VEGF的蛋白含量明显高于其他三组(P<0.05);C组血管计数和VEGF的蛋白含量高于A组和B组,有显著性差异(P<0.05),低于D组比较有显著性差别(P<0.05);A组和B组血管计数和VEGF蛋白水平远低于C组和D组,差异有统计学意义(P<0.05)。A组和B组血管计数和VEGF蛋白水平之间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论骨内加压能显著提高转染VEGF的骨髓间充质干细胞对创伤性股骨头坏死的再血管化,适当的应力刺激有利于骨组织的修复。     

rAAV2介导bFGF修饰的骨髓间充质干细胞与PDLLLA／HA的复合实验研究

目的探讨载bFGF基因腺相关病毒（rAAV2-bFGF）感染后的骨髓间充质干细胞与PDLLLA／HA的复合情况,为颅颌面骨基因治疗提供实验依据。方法rAAV2-bFGF转染至第3代骨髓间充质干细胞,在无菌情况下将bFGF基因腺相关病毒（rAAV2-bFGF）感染后的骨髓间充质干细胞与聚D,L-乳酸／羟基磷灰石（PDLLA／HA）支架材料充分混匀,4℃过夜,在扫描电镜下观察载骨髓间充质干细胞与支架材料的复合情况。结果rAAV2-bFGF成功转染至第3代骨髓间充质干细胞;扫描电镜下观察发现,BMSCs可以在PDLLA／HA上黏附、增殖、分泌细胞外基质。结论载bFGF基因腺相关病毒（rAAV2-bFGF）感染后的骨髓间充质干细胞可以在合成的PDLLA／HA上黏附、增殖、分泌细胞外基质,PDLLA／HA可以作为转基因细胞的支架材料。     

VEGF基因转染间充质干细胞移植与单纯间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死的疗效对比

目的探讨VEGF基因转染骨髓间充质干细胞与单纯骨髓间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死的疗效。方法将SD大鼠建立心肌缺血模型,1周后随机取30只采用随机分组法分为3组,A组为联合移植组,B组为单纯干细胞移植组,C组为对照组,通过一系列检测,对比3组的疗效。结果 A组的疗效优于B组和C组,B组的疗效优于C组（P〈0.05）。结论 VEGF基因转染骨髓间充质干细胞移植比单纯骨髓间充质干细胞移植的综合疗效好。     

龟板提取物对骨髓间充质干细胞中分化抑制蛋白1表达的影响

目的观察不同剂量的龟板提取物对骨髓间充质干细胞中分化抑制蛋白1（inhibitor of differentiation 1,Id1）的作用。方法将构建成功的PGL3-Id1启动子用磷酸钙共沉淀法转染大鼠骨髓间充质干细胞,龟板提取物分别作用于转染后的骨髓间充质干细胞12、24、36 h,选取作用最为明显的36 h,每组分别加入0、1、3、30、100μg/mL龟板提取物,药物作用36 h后收集细胞分别应用萤光素酶报告基因系统、RT-PCR和Western blotting检测Id1的表达。结果早期、小剂量龟板提取物对Id1的影响不大;随着时间和剂量的增加,Id1的表达水平也逐渐升高。结论龟板提取物促进了骨髓间充质干细胞中Id1的表达,剂量越大,作用时间越长,促进作用越明显。     

鹿茸精诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的:探讨鹿茸精体外定向诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法:通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,体外扩增培养。鹿茸精定向诱导分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。鹿茸精诱导3小时后大部分骨髓间充质干细胞转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性,GFAP阴性。结论:鹿茸精可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

HSV-1体外感染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:在体外原代培养大鼠骨髓间充质干细胞,观察单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染骨髓间充质干细胞情况。方法:分离骨髓间充质干细胞,并对其作鉴定。用HSV-1感染骨髓间充质干细胞,提取总DNA,PCR法扩增骨髓间充质干细胞内的HSV-1特异性片段。结果:骨髓间充质干细胞经14d诱导后,碱性磷酸酶含量增高,形成钙结节,表现出成骨细胞特性。HSV-1感染骨髓间充质干细胞,细胞出现典型的病变,PCR法成功扩增出骨髓间充质干细胞内的HSV-1特异性片段。结论:大鼠骨髓间充质干细胞在体外可以向成骨细胞方向分化,可作为组织工程学的种子细胞。HSV-1可以在体外感染骨髓间充质干细胞。     

血小板衍化生长因子-B基因转染对成纤维细胞生长增殖的影响

目的　研究血小板衍化生长因子 B(PDGF)基因转染成纤维细胞后对其生长增殖的影响。方法　构建PDGF B真核表达质粒 ,用脂质体LipofectAMINE介导转染成纤维细胞。相差显微镜观察成纤维细胞生长状况 ,MTT法测绘成纤维细胞生长曲线。结果　PDGF B基因转染的成纤维细胞生长良好 ,细胞生长曲线显示PDGF B基因转染 3d后的成纤维细胞较未转染的成纤维细胞生长明显增快 (P <0 0 5 )。结论　PDGF B基因转染后可显著加速成纤维细胞的生长增殖。     

CS/igf-1基因复合物促骨髓基质细胞增殖及分化的研究

目的:研究壳聚糖/igf-1基因(CS/igf-1)复合物对体外培养的骨髓基质细胞(MSC)分化及增殖的影响。方法:自大鼠股骨及胫骨组织中分离培养大鼠骨髓基质细胞,以含有人igf-1基因cDNA的哺乳动物表达载体pTRacer-igf-1与壳聚糖制备成CS/igf-1复合物加入细胞培养基中进行干预;另设空白细胞组、CS/空质粒干预组及单纯CS干预组作为对照。3H-TdR掺入法、甲苯胺兰染色分别检测细胞的增殖情况及成软骨活性。结果:与空白对照细胞相比,壳聚糖可使所培养的骨髓基质细胞表现出明显的成软骨活性。igf-1基因的参与则可显著促进细胞的增殖。结论:CS/igf-1复合物可促进对体外培养的骨髓基质细胞增殖并向成软骨细胞分化。     

肝细胞生长因子对兔骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的　观察腺病毒携带肝细胞生长因子cDNA(adHGF)转染兔骨髓基质细胞 (MSC)后的主要生物学特性。方法　抽取成年雄性新西兰白兔骨髓 ,密度梯度离心获得MSC。取兔膝关节软骨 ,体外培养软骨细胞至第 3代。adHGF转染第 5代MSC ,噻唑蓝 (MTT)法检测细胞增生活力 ,阿尔新蓝法检测细胞培养上清液中氨基己糖多糖 (GAG)含量。酶联免疫吸附实验 (ELISA)检测adHGF转染MSC后HGF的表达。免疫组织化学染色及反转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达。结果　原代MSC为短梭形、簇状生长 ,传代细胞呈长梭形、旋涡样生长。adHGF转染前后细胞增生状态差异无显著性。MSC转染后GAG含量增加。免疫组织化学染色MSC转染前后I型胶原阳性 ,转染后Ⅱ型胶原弱阳性。转染后HGF表达量在转染 1周内最高 ,达 12 0 5ng/ml,并可持续至 6周。RT PCR表明MSC在adHGF转染前后均表达I型胶原 ,转染后微量表达Ⅱ型胶原。结论　MSC在体外培养过程中的自然转归是趋向于成骨。MSC不仅是HGF的源细胞 ,而且可作为靶细胞接受外源目的基因的转染并有效表达     

Impregnation of plasmid DNA into three-dimensional PLGA scaffold enhances DNA expression of mesenchymal stem cells in vitro

Current efforts had been made to undertake a three-dimensional (3-D) reverse transfection of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs) in PLGA scaffolds. As a kind of multipotent stem cells, BM-MSCs show great potential and tremendous capacity in the gene transfection field and PLGA 3-D scaffold has been shown to be a biomaterial that provides structural support to cells proliferation and tissue engineering. The objective of this study was to assess the transfection efficiency of BM-MSCs with a 3-D reverse transfection method by using PLGA scaffold and observe the SEM photographs of BM-MSCs cultured on PLGA scaffold. BM-MSCs were cultured in 3-D PLGA scaffold which was incorporated with pullulan-spermine/pGL3. It was shown that the gene expression duration of BM-MSCs transfected using 3D reverse method with pullulan-spermine/DNA in the presence of serum maintained 12 days at high levels as compared with the plasmid DNA in medium, and scanning electronic microscopy (SEM) photographs of BM-MSCs cultured on PLGA scaffold exhibited robust cell attachment and viability when cultured in PLGA scaffold in vitro. This study demonstrates that the 3-D reverse transfection method of BM-MSCs using PLGA scaffold could achieve long gene expression in a relatively high level, therefore this transfection system is promising in gene transfection and tissue engineering.     

pcDNA3.1(+)/GDF-5真核表达质粒的构建及其在小鼠骨髓基质干细胞的表达

目的:通过基因重组技术体外构建真核表达质粒pcDNA3．1( )／GDF-5,并检测其在小鼠骨髓基质干细胞中的表达。方法:提取孕14 d小鼠胚胎肢芽组织总RNA,RT-PCR扩增,将扩增产物GDF-5基因片断插入至pcDNA 3．1( )载体,并进行酶切鉴定及测序;脂质体介导pcDNA 3．1( )／GDF-5重组质粒瞬时转染小鼠MSC,RT-PCR和免疫细胞化学检测GDF-5的表达。结果:重组质粒双酶切图谱显示有5．4 kbp和1．6 kbp两条带;测序结果与Genbank中的序列完全相同;转染后RT- PCR显示实验组有一219bp特异性条带,免疫细胞化学检测发现实验组细胞胞浆内有棕色阳性染色,实验对照组和空白组均为阴性。结论:本实验成功构建pcDNA3．1( )／GDF-5真核表达质粒,转染小鼠MSC中有GDF-5表达,为进一步研究其在软骨发育机制和软骨骨组织工程领域提供了实验基础。     

Regenerative medicine through mesenchymal stem cells for bone and cartilage repair

Bone and cartilage defects are common features of bone fracture and joint diseases, such as rheumatoid arthritis or osteoarthritis, that have great social and economic impact on the aging occidental population. Despite progress in orthopedic surgery, bone and cartilage repair is a major challenge as large defects will not spontaneously heal. Recent investigations on the stromal mesenchymal stem cell (MSC) offer a new perspectivefor bone and cartilage tissue engineering. However, the standard offull healing is extremely demanding and may be achieved through the engineering of MSCs combined with scaffolds and growth factors as recombinant proteins, or using a gene therapy approach.     

Ad5-IFN-γ-GFP重组腺病毒转染的骨髓间充质干细胞对小鼠喉旁组织IFN-γ蛋白表达的实验研究

目的探讨干扰素-γ（IFN-γ）转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）对喉部疾病的治疗效果。方法采用Ad5-IFN-γ-GFP重组腺病毒,将转染IFN-γ的BMSCs注射到小鼠喉旁组织,第1、3、7、14、28天取骨髓和喉旁组织用Western blot检测IFN-γ蛋白表达水平。结果当MOI=100和转染时间72h时,细胞上清液IFN-γ表达水平分别达到峰值。注射空白培养液和空白mBMSC的骨髓和喉旁组织IFN-γ基本不表达。注射病毒转染的mBMSC后,骨髓和喉旁组织中都开始大量表达IFN-γ,且表达量随注射时间延长而增加。结论IFN-γ导入BMSCs并通过小鼠喉旁局部注射,可以在组织获得持久表达。为临床IFN-γ基因治疗喉部肿瘤提供了动物实验依据。     

FAM3B基因cDNA克隆及其在胃癌细胞系BGC-823的表达

目的克隆FAM3B cDNA,构建FAM3B重组表达载体并在胃癌细胞系BGC-823中表达,观察其对细胞系的影响,探索新的肿瘤治疗途径。方法构建pEGFP-N2-FAM3B真核表达质粒,将pEGFP-N2-FAM3B转染人胃癌细胞系BGC-823,研究其对胃癌细胞产生的作用。结果重组pEGFP-N2-FAM3B真核表达质粒构建成功,经pEGFP-N2-FAM3B转染后,荧光显微镜下可见转染的BGC-823细胞有绿色荧光蛋白的表达,转染后的BGC-823细胞生长减慢。结论构建完成真核表达载体pEGFP-N2-FAM3B,重组pEGFP-N2-FAM3B质粒在胃癌细胞系BGC-823细胞内成功表达。     

人PD-1基因克隆及其在L929基因转染细胞上的表达

目的 克隆人PD-1基因,构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体,并转染入L929细胞,获得稳定高表达PD-1分子的L929细胞。方法 用PCR法从pGEX-5X-3-PD-1扩增出PD-1基因,通过双酶切（PstI BamHI）装入逆转录病毒载体pGEZ Term中,脂质体法共转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清感染L929细胞,72h后,加入Zeocin进行筛选,挑选出能稳定表达PD-1分子的L929细胞株。结果 成功克隆了人PD-1基因,构建了含PD-1基因的重组逆转录病毒载体,包装出具有感染能力的重组PD-1逆转录病毒,筛选出具有稳定表达人PD-1分子的L929基因转染细胞。经流式细胞仪检测：PD-1分子在L929基因转染细胞中具有高表达,达到97．6％。结论 构建了含人PD-1基因重组逆转录病毒的载体,筛选出稳定表达人PD-1分子的L929细胞株。     

Reduced irradiation pulmonary fibrosis and stromal cell migration in Smad3-/- marrow chimeric mice

Pulmonary irradiation fibrosis involves migration to the lungs of bone marrow origin myofibroblast progenitor cells (marrow stromal cells (MSCs)). Smad3-/- mice display decreased ionizing irradiation-induced skin fibrosis, defective osteochondrogenesis and other abnormalities thought to be associated with a defective stromal cell response(s) to transforming growth factor-beta (TGFFbeta). Clonal bone marrow stromal cell lines were derived from the adherent layer of continuous bone marrow cultures of homozygous deletion recombinant negative Smad3-/- mice and Smad3+/+ littermates. Quantitation in an Automated Cell Tracking System of the in vitro single cell migratory capacity over five days demonstrated a significant decrease in locomotion in microns per 24 h of Smad3-/- compared to Smad3+/+ clonal MSC lines. Reexpression by retroviral vector transfection of the Smad3 but not control ds-red transgene restored in vitro migratory capacity. Intravenously injected GFP transgene product labeled Smad3-/- (MSCs) seeded 10-fold less effectively than ds-red transgene product labeled Smad3+/+ cells to the 80 days post 20 Gy irradiated lungs of C57BL/6J mice and proliferated less significantly for 60 days after cell injection. Female mice chimeric for male Smad3-/- compared to Smad3+/+ marrow showed decreased irradiation pulmonary fibrosis, Y+ stromal cell migration to the lungs, and improved survival. The data show that the reduced in vitro and in vivo migratory capacity of Smad3-/- bone marrow stromal cells correlates with decreased radiation pulmonary fibrosis observed in mice chimeric for Smad3-/- marrow.