荧光探针杂交技术检测临床标本内结核分支杆菌的价值

目的　评价聚合酶链反应(PCR)荧光探针杂交技术(TaqMan技术)检测临床标本中结核分支杆菌的应用价值。方法 应用细菌学方法(涂片镜检和培养)及TaqMan法检测133份结核病患者痰标本,53份非结核呼吸系疾病患者痰标本。结果 细菌学方法检测结核病患者临床标本中结核分支杆菌阳性率为36.1%,TaqMan法阳性率为61.7%,高于细菌学检测法,经统计学处理,两者有显著性差异(P<0.05),用TaqMan法检测临床标本特异性为96.2%。结论 TaqMan技术将PCR扩增、荧光探针杂交及检测一体化,在单一管内完成,具有简便、快速、防污染、敏感性及特异性较高等优点,是结核病辅助诊断的有效方法之一。     

rDNA探针杂效检测病人痰标本中结核杆菌的研究

目的 应用结核分枝杆菌特异的ｒＤＮＡ探针杂交检测痰标本中的结核杆菌ｒＤＮＡ,评价其在临床标本检测中的应用价值。方法 用引物ｂ对结核分枝杆菌１６Ｓ－２３ＳｒＤＮＡ间隔区序列进行扩增,同时加入生物素标记制成２５０ｂｐ的ｒＤＮＡ探针。对该探针的敏感性、特异性进行了研究,并对９０分结核病人,３０份非结核病人痰标本的ＰＣＲ产物进行了斑点杂交检测。结果 ｒＤＮＡ探针检测引物ｂ增产物杂交只有结核分枝杆菌、胃分枝     

PCR-SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

PCR－SSCP技术快速检测结核分枝杆菌 rpoB基因突变的研究

目的 应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。     

PCR-ELISA微孔板杂交技术检测结核杆菌DNA

目的　采用PCR ELISA微孔板杂交技术检测结核杆菌DNA。方法 采用PCR技术扩增结核杆菌DNA，并将扩增产物加入预先包被结核杆菌探针的微孔板，再加入结核杆菌显色探针，同时进行微孔板核酸夹心杂交ELISA显色。共检测肺部疾病患者痰标本 510例。结果 该法的灵敏度为 59.3%，特异性为 95.0%；阳性预测值为 96.3%，阴性预测值为 51.4%。结论 PCR ELISA微孔板杂交技术可快速、准确地检测结核杆菌DNA，是结核病早期诊断和鉴别诊断的可靠实验室方法。     

多重交叉置换扩增联合羟基萘酚蓝检测脓肿分枝杆菌方法的建立

目的 建立一种可视化的恒温扩增方法用于检测脓肿分枝杆菌(MAB)。方法 采用特异性全长erm(41)基因建立基于多交叉置换扩增(MCDA)结合羟基萘酚蓝(HNB)的方法,通过比色法直接检测扩增产物,采用23株脓肿分枝杆菌复合群和8种细菌标准株对该方法进行初步评价。结果 建立的MAB-MCDA-HNB检测限为100 fg的DNA模板。31株细菌菌株中,只有脓肿分枝杆菌检测结果为阳性,其它细菌包括结核分枝杆菌,卡介苗,马赛分枝杆菌、鸟分枝杆菌等非结核分枝杆菌和金黄色葡萄球菌等均为阴性。脓肿分枝杆菌模拟痰标本检测灵敏度为1.7×10³ CFU/mL(每次反应17 CFU)。结论 MAB-MCDA-HNB方法能够快速准确诊断脓肿分枝杆菌的感染。     

微孔杂交技术诊断肺外结核

目的　将聚合酶链反应(PCR)、核酸杂交、酶联免疫吸附三种技术有机结合,从分子水平检测结核杆菌,为临床诊断肺外结核提供病原学依据。方法 使用生物素标记的特异性引物扩增结核杆菌(TB)DNA,带有生物素的产物与包被在微孔板内的靶基因杂交,加入酶标链毒亲和素与生物素结合,最后加辣根过氧化物酶显色,2MH₂SO₄终止反应。根据酶标仪检测各孔吸光度判断结果。结果通过对临床高度怀疑为肺外结核的408份标本的检测,PCR微孔板杂交法的检出率为43.6%,培养法的检出率为25.9%直接涂片抗酸染色为6.4%。结论 PCR杂交法灵敏度高,特异性强,有助于临床准确、快速诊断肺外结核。     

应用PCR-SSCP技术检测痰中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变的研究

目的应用PCR-SSCP技术检测痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变,探索其临床应用价值。方法以结核分枝杆菌标准株H₃₇R_V为对照,应用套式PCR扩增目的基因,并使用SSCP技术直接检测100例耐药患者和10例敏感患者痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变并进行基因测序,将SSCP结果及测序结果与细菌培养药敏结果进行比较分析。结果PCR-SSCP直接检测痰样本中的结核分枝杆菌katG基因突变的敏感性和特异性分别是55.9%和70.0%,rpoB为76.0%和90.0%,embB为46.4%和60.0%。结论PCR-SSCP操作快速、简单,敏感性和特异性较高,可用来直接检测临床痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变。     

结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c蛋白融合表达与血清学评价

目的 原核表达结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c融合蛋白并进行纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法评价重组蛋白在结核病血清学诊断中的价值。方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,通过重叠PCR扩增得到Rv3425-Rv1168c全核酸序列克隆至表达载体pET-24b中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,通过ELISA检测100份确诊结核病人、20例非结核呼吸疾病患者、100份健康人血清,评价融合蛋白进行临床血清学诊断的可行性。结果 Rv3425-Rv1168c融合蛋白在原核系统内获得高表达,纯化的融合蛋白经ELISA方法测定,在血清学实验中敏感性为54%,特异性为95%。结论 Rv3425-Rv1168c融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫原性,在结核病血清学诊断方面具有很大的应用价值。     

套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测

目的应用套式PCR-DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变,以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法,并评价其临床应用价值。方法采用套式PCR-DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况。同份痰标本同时做涂片抗酸染色,罗氏培养及菌型鉴定。结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性,产物DNA测序31例有rpoB基因突变,其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变,耐药突变率90.6%(29/32),39例菌阴(涂阴培阴)痰中有2例发生突变。分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变,20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性,特异性100%。结论套式PCR-DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法。     

16S-23SrDNA间隔区序列PCR扩增及探针杂交用于偶然分支杆菌暴发感染的研究

目的　从基因水平上确认福建省南平市注射后偶然分支杆菌暴发感染的致病菌,并建立PCR结合DNA探针杂交快速鉴定偶然分支杆菌的方案。方法 根据偶然分支杆菌16S-23S rDNA间隔区序列,设计合成一段寡核苷酸探针,采用PCR扩增、RFLP和DNA斑点杂交技术,对29株偶然分支杆菌临床分离株进行鉴定。结果 29株偶然分支杆菌临床分离株均被PCR扩增出一条约470bp的DNA条带,DNA探针杂交也出现特异的杂交斑点。结论 16S23SrDNA间隔区序列PCR扩增及DNA探针杂交在基因水平上确认引起此次注射后暴发感染的致病菌为偶然分支杆菌,该方法具有灵敏、特异的特点。     

聚合酶链反应-增强化学发光法快速检测结核杆菌的研究

目的　建立聚合酶链反应 -增强化学发光法 (polymerase chain reaction-enhanced chemilumine cence ,PCR-ECL)快速高灵敏度和高特异性检测结核杆菌的方法。方法 以结核分支杆菌、牛分支杆菌特异性抗原Pab基因的419bp片段为靶序列,PCR体系经优化,直接酶标法标记探针 ,增强化学发光检测(ECL)进行分子杂交。结果 PCR体系对结核分支杆菌、牛分支杆菌、卡介苗的扩增为阳性,PCR体系灵敏度为5fgDNA分子。ECL体系灵敏度为0.5pgDNA分子。采用模拟痰样,可检至10个以下结核杆菌。结论 建立了结核杆菌的PCR-ECL快速检测方法,整个过程可在一天半内完成。     

结核分支杆菌镜检、培养和PCR技术诊断结核病的临床评估

目的　评估结核分支杆菌PCR、培养、镜检对结核病诊断的临床效果。方法 对1217例临床可疑结核病人用PCR、培养和镜检三种方法的阳性检出率进行比较。结果 不同临床标本用PCR技术诊断结核病,其敏感性高于培养和涂片镜检,阳性检出率分别为:88.7%,43.4%,26.5%。结论 通过三种方法比较分析,说明PCR技术是一种速度快、检出率高的检测结核分支杆菌的重要方法,对结核病的诊断有重要的参考价值。     

分子病理学诊断颈部淋巴结结核及其耐药性的应用价值

目的 评价分子病理学方法诊断颈部淋巴结结核及其耐药性的临床应用价值。方法 搜集2010年3月至2013年10月首都医科大学附属北京胸科医院病理科收治的符合纳入标准(临床症状和体征均符合颈部淋巴结结核、抗结核药物治疗均有效)的全部97例颈部淋巴结结核患者(结核组);以及符合纳入标准(通过病理学或临床检测结果明确诊断为其他淋巴结疾病)的全部20例其他淋巴结病变患者(非结核组)的石蜡包埋标本。所有标本以萋-尼(Z-N)抗酸染色法查找抗酸杆菌,荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)检测结核分枝杆菌特异基因序列IS6110;以临床最后诊断为标准,比较两种方法的检测效能;并对FQ-PCR检查结果为阳性且结核分枝杆菌DNA含量满足耐药突变检测下限的标本,以探针熔解曲线法检测利福平、异烟肼耐药相关基因突变情况。结果 以临床最后诊断为标准,抗酸染色和FQ-PCR检测结核组的敏感度分别为22.7%(22/97)和67.0%(65/97);FQ-PCR技术检测敏感度明显高于抗酸染色法,差异有统计学意义(χ²=38.53,P<0.001)。抗酸染色和FQ-PCR检测非结核组标本均为阴性,特异度均为100.0%(20/20)。抗酸染色和FQ-PCR的阳性预测值分别为100.0%(22/22)和100.0%(65/65),阴性预测值分别为21.1%(20/95)和38.5%(20/52),符合率分别为35.9%(42/117)和72.6%(85/117)。对41例FQ-PCR检查结果为阳性且结核分枝杆菌DNA含量满足耐药突变检测下限的患者标本进行结核分枝杆菌耐药基因突变检测,利福平和异烟肼可评估标本分别为10份(例)和27份(例),其中利福平耐药1份(例),异烟肼耐药13份(例)。 结论 分子病理学诊断技术在颈部淋巴结结核石蜡包埋标本中检测结核分枝杆菌DNA的敏感度和特异度较高,并且能筛查可能的耐药患者,可为颈部淋巴结结核的正确诊断与合理化治疗提供依据。     

GeneXpert MTB/RIF与线性探针技术检测骨关节结核及利福平耐药性的价值

目的探讨GeneXpert MTB/RIF(简称"GeneXpert")和线性探针技术检测骨关节结核及利福平耐药性的临床应用价值。方法选取2018年3-12月接受病灶清除手术或穿刺术的疑似骨关节结核患者172例,同时采用GeneXpert、线性探针技术及BACTEC MGIT 960对患者病灶标本进行检测。以临床综合诊断为参照标准,评价GeneXpert、线性探针技术及两种方法联合检测骨关节结核的效能。以BACTEC MGIT 960药物敏感性试验(DST)结果为参照标准,评价GeneXpert、线性探针技术及两种方法联合检测MTB对利福平耐药性的效能。结果 172例疑似骨关节结核患者经临床综合诊断,112例诊断为骨关节结核,60例为非骨关节结核。以临床综合诊断为参照标准,GeneXpert检测骨关节结核的敏感度和特异度分别为82. 14%(92/112)和96. 67%(58/60),与临床诊断结果一致性良好(Kappa=0. 74);线性探针技术检测的敏感度和特异度分别为69. 64%(78/112)和90. 00%(54/60),与临床诊断结果一致性一般(Kappa=0. 54);两种方法联合检验的敏感度和特异度分别为82. 14%(92/112)和90. 00%(54/60),与临床诊断结果一致性良好(Kappa=0. 68)。三种方法诊断骨关节结核的受试者工作特征曲线(简称"ROC曲线")下面积分别为0. 89、0. 80、0. 86,提示诊断价值均较好。以BACTEC MGIT 960DST结果为参照标准,GeneXpert检测MTB对利福平耐药性的敏感度和特异度分别为100. 00%(18/18)和92. 31%(24/26),与BACTEC MGIT 960 DST结果一致性较高(Kappa=0. 91),ROC曲线下面积为0. 96;线性探针技术检测MTB对利福平耐药性的敏感度和特异度分别为100.00%(18/18)和88.46%(23/26),与BACTEC MGIT 960 DST结果一致性较高(Kappa=0. 86),ROC曲线下面积为0. 94;两种方法联合检验结果与线性探针技术检测结果一致。结论 GeneXpert、线性探针技术能够快速、准确的检测骨关节结核及其耐药性,具有较好的临床应用价值。     

Clinical application of the polymerase chain reaction for a rapid diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection.

A gene amplification method of Mycobacterium tuberculosis DNA by the polymerase chain reaction (PCR) has been devised. A primer pair used in this study is 5'GTTGCCGTGGCGG TATCGG3' and 5'GCGACATTACGGGGCAGGTGG3', which brackets a 152-base region encoding the 65KD antigen, and a specific probe is 5'TTTGGGGTCATCTTTGGAGCG3'. The procedure could be completed within 2 days. The specificity and the sensitivity of the PCR for M. tuberculosis complex in identifying M. tuberculosis complex did not conflict with the conventional methods at all. Using this method, we could diagnose three cases of the disease, which had been very difficult to diagnose by the conventional methods, by detecting the DNA from the blood, liver biopsy specimen, lung aspirate, and pleural effusion.     

PCR-荧光探针法检测临床痰标本结核分枝杆菌的可靠性研究

目的 评价PCR-荧光探针法快速检测Mtb和非结核分枝杆菌（NTM）的临床应用价值。方法 应用分枝杆菌核酸检测试剂对1015 例痰标本和56株临床分离株进行检测,与Mtb核酸扩增（PCR）荧光（目前临床上认可惟一同类产品）检测结果进行比较。采用SPSS 11.5统计软件进行数据统计处理,采用χ²检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。结果 PCR-荧光探针法检测痰标本分枝杆菌灵敏度50.3%（373/741）,特异度98.9%（271/274）;菌阳肺结核标本检测灵敏度97.0%（257/265）,菌阴肺结核标本检测灵敏度24.4%（116/476）;1015份痰标本中检测出11例非结核分枝杆菌（NTM）核酸阳性标本（占1.1%）,经16S rDNA 测序确认,准确率100.0%。随机数字量表法抽取138例标本重复进行第2次检测,符合率100.0%。对56株临床分离株（1株Mtb临床分离株,55株NTM临床分离株）检测,准确率100.0%。对临床需要的226份标本同时与达安公司试剂盒检测结果比较,总体符合率95.1%（215/226）,经统计学分析,两者之间差异无统计学意义（χ²=2.98,P=0.226）。结论 PCR-荧光探针法可快速检测和区分痰标本Mtb与NTM,具有临床推广应用价值。     

不同人群中筛查肺结核病人的效果评价

目的　评价从不同特征的人群中筛检肺结核病人的效果。方法 将受检人群分成肺结核可疑症状组和其他三组,分析比较各组人群中肺结核病人的检出率及其成本效果。结果 肺结核可疑症状组的活动性肺结核检出率为 3590.9/万、涂阳肺结核检出率为 1159.1/万,明显比其他三组人群的检出率高 (P＜0.001)。肺结核可疑症状组检出活动性肺结核的平均费用为 103.0元/例,检出涂阳肺结核的为 319.2元/例,明显比其他三组人群的低。结论 在现有卫生资源的情况下,采取因症就诊为主的发现方式可最大可能地发现肺结核病人。