nHA-PLGA支架材料与兔软骨细胞体外培养的生物相容性研究

目的 研究新型多孔复合支架材料纳米羟基磷灰石(nHA)-聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)的生物相容性,探讨其作为骨组织工程支架的可行性.方法 将胎兔膝关节软骨细胞接种于制备的nHA-PLGA复合支架上,体外共同培养后采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测软骨细胞增殖活性,倒置荧光显微镜、扫描电镜观察支架材料表面和孔隙内软骨细胞黏附情况,流式细胞术检测软骨细胞周期情况.结果 实验组(A组)复合支架材料上细胞增殖活性与空白对照组(B组)相比,无统计学差异(P＞0.05);倒置荧光镜、扫描电镜观察显示A组细胞在复合支架材料表面和孔隙内大量黏附、生长,其数量随着共培养时间增加呈几何级增长;流式细胞仪检测显示A组与B组细胞周期差异无统计学意义(P＞0.05).结论 nHA-PLGA多孔复合支架生物相容性好,是一种性能良好的骨组织工程支架材料.     

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究北大核心CSCD

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。     

半月板纤维软骨细胞与小肠黏膜下层相容性的研究

严重的半月板损伤需要进行半月板的移植，防止膝关节的退行性变。我们以猪小肠黏膜下层（SIS）作为支架材料，通过观察兔半月板纤维软骨细胞在此载体中的生长、增殖情况，评价SIS的生物相容性，为应用SIS作为支架材料构建组织工程半月板提供实验依据。[第一段]     

软骨细胞体外培养支架材料研究进展

软骨组织损伤后自身修复能力有限,组织工程构建对软骨缺损的修复意义重大,为功能软骨的修复提供了新希望,而软骨细胞体外培养支架的研究是重要一环.运用于骨组织工程的人工合成支架材料来源广、可批量生产、可控降解速度,力学强度好、易于塑形;天然支架材料亲水性强,细胞粘附性、生物相容性好;人工合成材料复合天然材料取各自所长,克服各自缺陷,支架性能提高.通过对材料表面进行修饰,可改善细胞与支架材料的相互作用.通过模拟细胞生长微环境,制备仿生材料,可提高材料的亲水性、对细胞的粘附性,促进细胞的分化增殖.纳米材料的出现为细胞体外培养支架的研究提供了新选择.该文就软骨细胞体外培养支架材料近年的一些新进展作一综述,并预测今后研究的主要方向.     

软骨细胞生物打印后细胞活力分析

目的：初步确立软骨细胞的二维生物打印方法,实现对细胞喷射过程的控制并保持打印后的细胞活力。方法取原代软骨细胞,常规培养至第2代。实验分2组：打印组,快速成型组织打印机进行二维细胞打印,X轴间隔300μm, Y轴间隔1500μm,激光共聚焦显微镜观察,经生物打印后培养2 h,Live/Dead viability Kit测定细胞活力,激光共聚焦显微镜观察细胞荧光染色情况;对照组除细胞悬液不行打印,其余操作同打印组。结果打印组细胞激光共聚焦显微镜观察,“细胞墨滴”在二维组织中均匀分布,满足二维设计细胞打印的要求,每个“细胞墨滴”含细胞15-35个。细胞活力测试显示,打印组细胞活力与对照组无明显区别。结论通过生物打印技术可实现软骨细胞在二维平面上的定向、定量规则分布,为进一步的细胞三维打印乃至器官打印体系奠定基础。     

纳米结构PCL—b—PLLA材料特性及其与犬软骨细胞的生物相容性研究

目的探讨具有纳米结构的聚己内酯／左旋聚乳酸共聚物（PCL—b—PLIJA）作为半月板组织工程支架的可行性，及其与犬软骨细胞的体外生物相容性。方法开环聚合制备PCL-b-PLLA，液-液相分离技术制备纳米结构PCL—b—PLLA支架，固-液相分离技术制备PCL—b—PLLA支架，扫描电镜（SEM）观察材料结构；测定纳米结构支架体外降解率及力学强度。分离培养犬软骨细胞，取第3代软骨细胞接种于纳米结构PCL—b—PLIA（实验组）、PCL—b—PLLA（对照组）支架材料上进行三维培养6d，SEM观察软骨细胞的形态、粘附、生长状况；细胞支架复合培养3、6、12d后，Hoechst33258荧光法检测复合物中细胞DNA含量、BCA法测定蛋白质含量。结果实验组支架材料相对分子量150kD，压缩强度为72．6KPa，孔隙率为93％。SEM示实验组支架表面为多孔状，孔壁为纤维网状连接。其降解率起初始较慢，8周后降解速率明显加快。软骨细胞在实验组支架上粘附、增殖优于对照组。随时间延长细胞在支架材料上DNA和蛋白质含量逐渐增加，实验组DNA和蛋白质含量均明显高于对照组（P〈0．01，P〈0．05）。结论具有纳米结构的PCL-b—PILA支架具有良好的生物力学性能及可降解性，可显著促进细胞粘附、增殖及合成代谢，有望成为一种较为理想的半月板组织工程支架材料。     

三种支架材料与软骨细胞复合构建组织工程化软骨的研究

目的：研究细胞、材料及孔径在诱导关节软骨发育过程中的作用。方法：采用细胞与支架的三维培养和体内植入技术。结果：种入支架的原代软骨细胞增殖差，未形成软骨组织。而第2代软骨细胞生长良好，最终发育成软骨组织。孔径为25－100μm的胶原海绵捕捉的细胞量明显多于孔径为100－550μm的明胶海绵和PDLLA泡沫。裸鼠皮下植入16周时3种支架－细胞复合体比较，胶原海绵－细胞复合体中的支架材料降解最彻底，软骨组织发育最好。结论：第3代软骨细胞细胞增殖优于原代细胞；25－100μm的小孔径支架对细胞的吸附量优于100－550μm的大孔径支架；软骨发育中支架材料的彻底降解是优质软骨组织形成的前提。     

兔髂骨骺板软骨细胞体外构建骺板样软骨组织

目的　利用组织工程学技术体外构建骺板样软骨组织。方法　从 4～ 5周龄兔髂骨骺板软骨处获取软骨细胞 ,在离心管内轻微离心后 ,体外培养。行组织学观察。结果　培养至第 7天时 ,细胞呈现定向分化 ,形态与体内骺板软骨细胞相类似 :肥大软骨细胞体积较大、呈圆形或椭圆形 ;增殖、成熟软骨细胞体积小 ,呈圆形或扁圆形 ;细胞周围充满大量的细胞外基质。这些不同分化阶段的细胞形成了分化区带 ,肥大软骨细胞位于上侧 ,增殖、成熟细胞位于中间 ,其次是散在静止软骨细胞。培养第 14天 ,分化区带更加明显 ,增殖、成熟细胞和肥大软骨细胞呈现纵向定向排列。培养第 2 1天 ,组织表面出现膜样的结构。结论　体外构建的骺板样软骨组织与天然骺板的组织学形态极为相似。从髂骨处骺板处获取肥大软骨细胞进行体外构建骺板软骨材料 ,更具有临床实用性     

胶原海绵与兔软骨细胞体外三维培养的实验研究

目的 观察用人胎盘Ⅰ型胶原海绵作为兔软骨细胞体外三维培养支架时，软骨细胞形态学特征和功能及该支架的吸附性和组织相容性。方法 将新生兔原代和传代软骨细胞接种于人胎盘Ⅰ型胶原海绵进行体外培养，用光镜和扫描电镜观察细胞形态和结构及支架的吸附性和组织相容性，用免疫组化观察细胞Ⅱ型胶原合成。结果 以胶原海绵作为支架的传代软骨细胞能维持其形态学特征及细胞功能，该支架有较好的吸附性和组织相容性。结论 人胎盘Ⅰ型胶原海绵可作为软骨细胞体外三维培养较好的支架材料。     

兔髂骨骺板软骨细胞体外构建骺板样软骨组织

目的 利用组织工程学技术体外构建骺板样软骨组织。方法 从4～5周龄兔髂骨骺板软骨处获取软骨细胞，在离心管内轻微离心后，体外培养。行组织学观察。结果 培养至第7天时，细胞呈现定向分化，形态与体内骺板软骨细胞相类似：肥大软骨细胞体积较大、呈圆形或椭圆形；增殖、成熟软骨细胞体积小，呈圆形或扁圆形；细胞周围充满大量的细胞外基质。这些不同分化阶段的细胞形成了分化区带，肥大软骨细胞位于上侧，增殖、成熟细胞位于中间，其次是散在静止软骨细胞。培养第14天，分化区带更加明显，增殖、成熟细胞和肥大软骨细胞呈现纵向定向排列。培养第21天，组织表面出现膜样的结构。结论 体外构建的骺板样软骨组织与天然骺板的组织学形态极为相似。从髂骨处骺板处获取肥大软骨细胞进行体外构建骺板软骨材料，更具有临床实用性。     

人胎关节软骨细胞体外培养的生物学特性

目的 研究软骨组织工程中传代软骨细胞与原代的差异。方法 用５个月人胎关节软骨分离培养细胞,观察细胞存活率、贴壁率、生长曲线和组织形态学的改变。结果 ⑴软骨块在４℃下,３ｄ内细胞存活率可达９３．４％～９７．６％。⑵原代细胞为圆形或三角形;第４代有一半转变成梭形,到第６代全部变为长梭形。⑶传代细胞贴壁时间（２～３ｈ）短于原代（４～７ｈ）。玻璃瓶内贴壁率传代细胞为７８．７％～８５．５％,原代８．８％。⑷     

三步酶消化法高效分离兔原代关节软骨细胞及体外培养观察

目的　观察设计的三步酶消化法分离原代关节软骨细胞的效果,并对体外培养不同代次细胞的生物学活性进行评价。方法　三步酶消化法设计为以培养液配制的1g/L胰蛋白酶及1g/LEDTA混合液、1g/L透明质酸酶和2g/LⅠ型胶原酶顺序消化关节软骨分离细胞,检测细胞收获效率和存活率;体外传代培养观察细胞形态、生长及胞外基质中Ⅰ型和Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚集体等的变化。结果　(1)关节软骨经三步酶消化基质逐步解离和降解,细胞得以完全释放和分离,每克软骨的细胞收获量平均为50 3×106 个细胞,细胞存活率平均为98. 8%。(2)原代和第一代细胞附壁生长呈三角形或多角形,生长融合时呈卵圆形,Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝异染反应均呈阳性,原代细胞外基质有高的硫酸糖胺多糖含量为(92±10)μg/cm2;第三代后细胞逐渐变为梭形,Ⅱ型胶原免疫组化为阴性,甲苯胺蓝异染反应明显减弱,第四代细胞外基质的硫酸糖胺多糖含量为(48±12)μg/cm2。结论　(1)三步酶消化法可使关节软骨基质完全消化降解,具有高细胞收获率、高细胞存活率和操作简便等特点。(2)原代和第一代软骨细胞具有良好的生物学活性,而第三代以后的细胞生物学活性低下。     

兔胚胎关节软骨细胞体外培养的研究

目的 探讨兔胚胎软骨细胞体外培养的生物学特性。方法 对孕4周兔胚胎关节软骨用酶消化法分离培养细胞。观察细胞存活率、贴壁率、生长曲线和组织形态学改变。结果 兔胚胎软骨细胞可从胚胎软骨组织中消化分离出来，经鉴定具有软骨细胞的特性。原代兔胚软骨细胞存活率达97％以上，细胞贴壁率达80％以上，从原代到第4代都有高增殖力，到第8代时增殖力降低。到第12代时几乎丧失细胞增殖。结论 体外培养的胚胎软骨细胞前4代适合于作修复关节软骨缺损的组织工程细胞。     

胶原凝胶包埋软骨细胞复合聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸支架异体移植修复兔关节软骨缺损

目的探讨胶原凝胶包埋软骨细胞复合聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸(CPPf／PLLA)支架异体移植修复兔关节软骨缺损的有效性和可行性。方法将胶原凝胶包埋的软骨细胞接种CPPf/PLLA支架构建的复合物体外培养3周，行倒置显微镜和扫描电镜观察，并将复合物异体移植入兔关节软骨缺损，术后4、8、12周取材，从大体、组织学和Ⅱ型胶原免疫组织化学对再生软骨组织进行评价。结果复合物体外培养3周，细胞被大量基质包裹，在支架内分布均匀；新形成的组织为透明软骨样组织、表面光滑且与周围组织整合良好、基质内有Ⅱ型胶原分布。结论胶原凝胶包埋软骨细胞接种CPPf／PLLA支架的方法能提高细胞一支架复合物构建质量，胶原凝胶复合CPPf／PLLA支架可作为软骨细胞载体修复关节软骨缺损。     

兔软骨细胞在可注射温敏型壳聚糖/聚乙烯醇凝胶中生长的研究

目的 探讨以壳聚糖(CS)和聚乙烯醇(PVA)制备的可注射温敏型凝胶作为兔软骨细胞生长支架的可行性.方法 将壳聚糖和聚乙烯醇溶液混合制成温敏型凝胶,取第三代软骨细胞接种于凝胶支架,于接种后24、48和72 h采用MTT测定细胞活性及毒力;于1、2及3周后采用扫描电镜及共聚焦激光扫描荧光显微镜观察软骨细胞在凝胶中的形态及生长状态.结果 MTT结果显示接种细胞数量随着接种细胞生长时间的推移而明显增加,各组之间差异有统计学意义(P＜0.05).扫描电镜及激光共聚焦荧光显微镜观察表明软骨细胞在CS/PVA凝胶支架中生长良好.软骨细胞在凝胶支架中保持了很高的增殖能力,材料对细胞无明显不良反应.结论 壳聚糖/聚乙烯醇混合凝胶可作为兔软骨细胞培养的生长支架,应用于软骨组织工程.     

软骨细胞与静电纺丝聚已内酯支架灌流培养构建组织工程软骨的实验研究

目的 采用静电纺丝聚已内酯(polycaprolactone,PCL)支架与软骨细胞复合培养,比较静态和灌流生物反应器培养条件下对细胞增殖及基质分泌的影响.方法 构建PCL支架,自制灌流生物反应器,分离兔软骨细胞,培养后接种于PCL支架,分为灌流培养组和静态培养组.在培养第3、7、14天对支架-细胞复合体行扫描电镜观察,DNA、糖胺聚糖和总胶原定量检测;在培养第14天分析软骨特异性基因表达并观察软骨基质分泌情况.结果 电镜观察PCL支架纤维直径(1.67±0.76) μm,孔径(17.65土7.11)μm,可见支架中软骨细胞黏附生长良好,灌流培养条件下细胞增殖快,且较好地保持了软骨细胞特征形态.在培养第7天,灌流培养组DNA定量高于静态培养组;在培养第3、7和14天,灌流培养组糖胺聚糖定量均高于静态培养组,灌流培养组糖胺聚糖/DNA比值均高于静态培养组.在培养第14天,灌流培养组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖基因表达增加;软骨分化指数高于静态培养组.在培养第14天,组织学染色可见灌流培养促进细胞的增殖和渗透生长,提高了软骨基质的分泌,并见软骨陷窝样结构.结论 在灌流生物反应器培养条件下,静电纺丝PCL支架与软骨细胞复合培养可促进软骨细胞的增殖和基质的分泌,提高了组织工程软骨的质量.     

纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞修复兔膝关节软骨缺损的实验研究

目的：探讨纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞作为软骨组织工程支架的可行性及有效性,并为后续研究可注射性材料做基础。方法：体外分离培养软骨细胞后接种到纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料体外培养4周,然后植入兔膝关节软骨缺损区继续培养4、8、12周后取材,分别行大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学观察。并进行Wakitani评分,观察其体内修复关节缺损效果。结果：大体观察4周后,实验组软骨缺损区可有乳白色组织修复,12周可修复完全,并无明显凹凸感。光镜下8周可见大量软骨细胞修复,并在TB染色下见Ⅱ型胶原比4周时明显增多。12周时软骨陷窝结构形成,细胞形态排列及Ⅱ型胶原与正常软骨组织相近。结论：纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞可以作为软骨组织工程支架材料,能够用于再生修复软骨的缺损。并为构建可注射性修复材料提供途径。     

碱性成纤维细胞因子对猪弹性软骨细胞增殖和成软骨能力的影响

目的　研究碱性成纤维细胞因子 (b FGF)对体外培养的弹性软骨细胞增殖和成软骨能力的影响 ,探讨b FGF对软骨组织工程的意义。方法　细胞取自猪耳软骨 ,用含 1 0、2 5、50 μg/L3种浓度b FGF的培养液 ,体外培养至第 3代 ,从细胞形态、数量和基质分泌等方面进行研究。结果　含b FGF组细胞贴壁呈类成纤维细胞样 ,撤去b FGF ,细胞形态可恢复正常 ;含b FGF各组在第 3代 ,细胞总数是无b FGF组的 60～ 70倍 (P <0 .0 1 ) ,但 3种不同浓度b FGF对细胞增殖差异无显著性 ;培养液氨基糖氨多糖 (GAG)含量测定各组差异无显著性 ;免疫组织化学和原位杂交示各组第 3代软骨细胞仍有Ⅱ型胶原表达。结论　应用b FGF能在 3周内从少量软骨组织获取大量软骨细胞 ,且未改变细胞表型和功能 ,对软骨组织工程有重要意义 ;在 1 0、2 5、50 μg/L 3种浓度中 ,1 0μg/L为b FGF在软骨组织工程应用中的最佳浓度     

壳聚糖作为组织工程软骨支架的实验研究

目的 探索壳聚糖作为组织工程技术中软骨细胞培养支架的可行性。方法 消化分离猪耳郭软骨细胞，接种于自制壳聚糖、壳聚糖-胶原复合多孔支架上培养，从光镜和扫描电镜观察其亲水性和对细胞吸附力，MTT检测软骨细胞在壳聚糖、壳聚糖-胶原上的黏附率及壳聚糖、壳聚糖-胶原复合多孔支架对细胞的增殖、功能的影响。结果 软骨细胞能够在壳聚糖、壳聚糖-胶原支架上黏附、伸展、增殖和发挥正常功能，MTT测得细胞黏附率分别为81.25%和87.50%，MTT测得软骨细胞在壳聚糖-胶原支架中的增殖能力较强。结论 壳聚糖、壳聚糖-胶原复合多孔支架与软骨细胞具有较好的相容性，壳聚糖-胶原复合多孔支架更适合作为软骨组织工程中的细胞培养支架。     

组织工程技术修复兔气管软骨缺损的实验研究

目的探讨以兔耳廓软骨细胞(auricularchondrocytes)为种子细胞,利用组织工程技术修复其自体气管软骨缺损的可行性。方法取兔耳廓软骨,以II型胶原酶消化分离软骨细胞,体外培养并扩增至第2代后,接种于聚羟基乙酸(PGA)纤维支架(3cm×2cm,约60mg),形成细胞—材料复合物。体外培养7d后,细胞—材料复合物环行包裹于直径为0.7cm的硅胶管外表面,置于裸鼠皮下。6周后取出,并将形成的管状软骨用于修复兔自体约1.5cm长的节段性气管软骨全层缺损。结果兔耳廓软骨细胞有较强的体外增殖能力,扩增至第2代时即可满足组织构建所需要的细胞量。软骨细胞种植于PGA后,细胞和材料黏附良好,细胞外基质分泌旺盛。置于裸鼠皮下6周后,细胞—材料复合物可形成弹性、韧性良好的管状软骨;其大体外观,组织学结构均与兔自体气管软骨相似。修复兔气管缺损后,组织工程化气管和周围组织愈合良好,实验动物可自主呼吸,成活1~28d不等,平均12.3d,死亡原因多为痰液积存和气管内肉芽增生。结论以兔耳廓软骨细胞与PGA相复合,利用组织工程学技术可以形成大体外观、组织学结构均与兔自体气管软骨相似的“组织工程化气管”,并能用于修复兔自体气管全层缺损。