成年大鼠骨骼肌卫星细胞原代培养及鉴定

目的：探讨骨骼肌卫星细胞体外培养，鉴定的方法。方法：采用I型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离大鼠骨骼肌卫星细胞，经差速贴壁法纯化后，在培养液中进行培养，观察不同血清浓度下，卫星细胞生长融合的情况，倒置显微镜观察细胞形态，利用结蛋白免疫细胞化学染色方法鉴定肌卫星细胞。结果：细胞经过两步消化和差速贴壁后，纯度在90%以上，在生长培基中，细胞分裂增生；在融合培基中，细胞发生融合，形成肌管。结论：成年大鼠肌卫星细胞在不同的培养条件下可增生或分化，结蛋白免疫细胞化学染色可以早期鉴定骨骼肌卫星细胞。     

小鼠快、慢肌卫星细胞的分离培养及β肌动蛋白的表达

目的体外分离培养和纯化小鼠快、慢肌卫星细胞,观察细胞内β肌动蛋白(β-actin)的表达情况。方法采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化法及差速贴壁法纯化ICR小鼠后肢骨骼肌腓肠肌(快肌)和比目鱼肌(慢肌)卫星细胞,免疫荧光抗体细胞化学染色法鉴定。取第2代快、慢肌卫星细胞提取总RNA,以GAPDH作为内参行RT-PCR,半定量分析快、慢肌卫星细胞内β-actin基因的相对表达量。结果体外分离及传代培养快、慢肌卫星细胞的快、慢肌肌浆蛋白表达阳性,细胞生长和增殖情况良好。快、慢肌卫星细胞内β-actin基因的相对表达量分别为3.71072和2.106028,两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论小鼠快肌卫星细胞内β-actin表达高于慢肌,提示骨骼肌卫星细胞内β-actin表达可能与肌纤维类型有关。     

咀嚼肌卫星细胞的体外培养及生物学特性的研究

目的:探讨咀嚼肌卫星细胞的体外培养方法并研究其生物学特性。方法:取新生绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)转基因小鼠面部咀嚼肌,采用酶消化法分离出咀嚼肌卫星细胞,体外进行原代和传代培养。采用倒置显微镜及荧光显微镜观察、测定生长曲线等指标,研究咀嚼肌肌卫星细胞的增殖与分化能力,采用骨骼肌肌动蛋白(-αsarcometric actin)单抗免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果:酶消化法适于咀嚼肌卫星细胞的分离,体外培养的咀嚼肌卫星细胞增殖速度快。免疫化学染色显示,体外培养的咀嚼肌肌卫星细胞呈阳性表达。结论:体外培养的咀嚼肌肌卫星细胞有强的增殖分化能力,能用于颌面部组织工程种子细胞库的构建。     

小鼠小胶质细胞原代培养的高产改良方法

目的探索与改良建立简单高效的小鼠原代小胶质细胞的培养与分离纯化方法。方法选用新生1～2 d的近交系C57BL/6小鼠,结合与改进营养剥离法并在恒温震摇法纯化后差速贴壁以分离纯化小胶质细胞。用Iba1免疫细胞化学染色方法对分离纯化的小胶质细胞纯度进行鉴定。结果共收获2批小胶质细胞,经免疫细胞化学染色法鉴定,纯化分离的是小胶质细胞,并稳定获得超过1.59×105/25 cm2个,纯度达97%。结论改良过后的胶质细胞的培养纯化方法,操作简单,所需时间短且产量高,提高了原有的分离纯化效率。获得的细胞稳定,活性强纯度高。为体外研究培养小胶质细胞提供了更稳定的基础。     

犬骨骼肌卫星细胞的分离,培养及扩增方法探索

为骨骼肌卫星细胞自体移植治疗心肌疾病准备细胞材料,建立了体外分离、纯化、培养、扩增骨岂卫星细胞的方法。用机械法酶的消化法分离犬骨骼肌卫星细胞,在ｅｒｃｏｌｌ非连续密度梯度离心纯化过程后,以Ｄｅｓｍｉｎ链霉一物素一过氧化酶银川市细胞化学染色鉴定。以完全培养扩增卫星细胞。提取的卫星细胞工在９０％以中,且证明促肝细胞生长素能增强细胞的增殖能力。表明此法可获得沆纯度及治疗所需细胞数量。     

兔骨骼肌卫星细胞的分离、培养及成肌特性

目的建立高纯度、高丰度的兔骨骼肌卫星细胞的分离、培养方法,并对培养的肌卫星细胞体外增殖和成肌特性进行观察。方法采用改良I型胶原酶和胰蛋白酶混合消化法结合差速贴壁培养以分离、纯化1周龄幼兔小腿三头肌来源的骨骼肌卫星细胞。镜下观察肌卫星细胞生长形态,结蛋白(Desmin)免疫组化染色鉴定体外培养的肌卫星细胞,MTT法绘制细胞生长曲线,并对分离培养的肌卫星细胞成肌特性进行诱导培养观察。结果差速贴壁后的悬浮肌卫星细胞折光性强,呈透亮球形,数量较多,贴壁生长后逐渐变为长梭形;免疫组化染色检测分离培养的细胞高表达Desmin,证明为肌卫星细胞,纯度高达95%;传代培养的肌卫星细胞24 h后开始增殖,第3~7天处于对数生长期,第8天后进入平台期;不经诱导分化培养基培养的肌卫星细胞也可融合形成肌管,但形成肌管速度不及诱导分化培养组快速。结论成功建立了具有操作简便、不易污染和纯度高的兔骨骼肌卫星细胞分离、培养方法,为采用肌卫星细胞为种子细胞的再生医学研究奠定实验基础。     

骨骼肌卫星细胞的纯化、培养、鉴定及生物学特性的研究

目的 研究骨骼肌卫星细胞体外纯化、培养、鉴定的方法及其生物学特性。方法 采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法纯化出大鼠骨骼肌卫星细胞（SC）,进行体外原代和传代培养,借此观察SC的增殖、分化特点并进行免疫细胞化学染色鉴定。结果 两步消化法是获取SC可靠的方法。生长培养基促使细胞的增殖;延迟分瓶或分化培养基促使细胞分化形成肌管。骨骼肌肌球蛋白（myosin）单克隆抗体免疫细胞化学染色SC呈弱阳性,而肌管呈强阳性。结论 体外培养的大鼠SC在合适的培养条件和传代比例下能够增殖与分化并保持其生物学特性,为其在组织工程和基因治疗中的应用奠定了基础。     

受体相互作用蛋白140在小鼠原代小胶质细胞中的表达分析

目的:分离、纯化和原代培养小鼠的小胶质细胞并检测该细胞中受体相互作用蛋白140(RIPl40)的表达模式.方法:以McCarthy等的经典培养方法为基础进行小鼠小胶质细胞的分离,以不换液营养缺失法、机械振摇法纯化和培养小鼠小胶质细胞;用CD11b(MAC-1)对分离的小鼠小胶质细胞进行鉴定;采用实时-聚合酶链反应和western免疫印迹法检测RIP140 mRNA和蛋白质在小鼠原代小胶质细胞中的表达模式:用免疫细胞化学确定RIP140在小胶质细胞中的定位表达模式.结果:成功对小鼠小胶质细胞进行了分离、纯化和培养;mRNA和蛋白表达分析显示,RIP140在小鼠原代小胶质细胞中确有表达,免疫组化结果提示RIP140主要在小鼠小胶质细胞的细胞核中表达.结论:利用McCarthy经典改良方法可成功分离纯化出高纯度小鼠原代小胶质细胞;小鼠原代小胶质细胞确实表达RIP140,以细胞核表达为主.     

大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养生长和成肌特性

目的建立大鼠骨骼肌卫星细胞分离和纯化方法,并观察骨骼肌卫星细胞的体外增殖和成肌特性。方法采用改良两步酶消化法结合差速贴壁技术,获得高纯度的骨骼肌卫星细胞。免疫组化染色鉴定体外培养的骨骼肌卫星细胞;MTT法检测体外培养骨骼肌卫星细胞的生长情况;倒置显微镜观察不同培养条件下骨骼肌卫星细胞的分化特性。结果获取的骨骼肌卫星细胞纯度高,细胞中肌源性标志中间丝蛋白desm in呈强阳性表达。体外培养时,骨骼肌卫星细胞有1~2 d的潜伏期,5~6 d进入平台期。细胞汇合至60%~70%或降低培养基血清浓度时,开始相互融合形成肌管细胞。结论酶两步消化法和差速贴壁技术是一种简便易行、获得较高纯度的骨骼肌卫星细胞的方法。骨骼肌卫星细胞体外培养时无需特殊诱导即可相互融合,形成具有骨骼肌收缩特性的肌管细胞。     

成年犬骨骼肌成肌细胞的培养纯化、鉴定及生长特性的研究

目的 建立简便、有效的成年犬骨骼肌成肌细胞(skeletal myoblast cells,SMCs)体外分离培养、纯化和鉴定的方法,并观察犬SMCs的生长特性.方法 采用机械分解法与IA型胶原酶和胰蛋白酶的二步酶消化法相结合,分离消化法培养获取犬SMCs,用DMEM培养液培养,以Ficoll梯度液纯化,进行Desmin免疫组化鉴定,并观察细胞形态、生长特性.结果 犬SMCs培养后经台盼蓝检查成活率达95%以上,在接种后4～5 d增殖达高峰,细胞生长旺盛;Ficoll分离纯化的SMCs纯度较高;Desmin免疫细胞化学染色有97%的SMCs胞浆呈阳性反应.结论 改良方法获得的SMCs具有良好的增殖、分化能力;采用Ficoll纯化以血清培养,即可获得高产量高纯度的SMCs.     

肌形成蛋白在人体失神经骨骼肌表达的形态学

目的　研究肌形成蛋白在人体失神经骨骼肌中的表达规律。　方法　成人骨骼肌 1 8例 ,正常骨骼肌 3例 ,失神经时间 1 2个月内骨骼肌 9例 ,1 3～ 2 4个月 6例。免疫组织化学染色方法 (ABC法 )研究肌形成蛋白在骨骼肌内的表达。　结果　正常骨骼肌未见肌形成蛋白表达 ,失神经人体骨骼肌内肌形成蛋白蛋白表达在肌纤维细胞核与肌卫星细胞细胞核 ;失神经 1年内可见到肌形成蛋白阳性染色细胞核 ,之后阳性肌细胞核明显减少 ,具有统计学意义 (P<0 .0 5 )。　结论　人体骨骼肌失神经 1年后再生反应明显降低 ,提示人体骨骼肌失神经后应该尽早修复。     

应用Percoll分离纯化组织工程用肌卫星细胞

目的探讨应用改良Percoll非连续密度梯度离心法分离纯化培养组织工程用肌卫星细胞。方法分别采用差速贴壁法和Percoll非连续密度梯度离心法进行兔肌卫星细胞的原代培养、光镜及扫描电镜检查细胞形态,通过免疫细胞化学染色方法鉴定培养细胞纯度,噻唑蓝法测定细胞生长曲线。结果差速贴壁法所得细胞纯度为30%~40%,Percoll非连续密度梯度离心法所得细胞纯度在90%以上,两种方法光镜及电镜检查均符合卫星细胞形态,细胞生长曲线显示细胞生长状况良好。结论应用Percoll非连续密度梯度离心法可以得到高纯度的肌卫星细胞,可以作为组织工程用种子细胞的培养方法。     

成年大鼠骨骼肌成肌细胞的培养和鉴定

目的探索成年大鼠骨骼肌成肌细胞的高浓度培养方法。方法以成年同种系Wistar大鼠为研究对象,采用两步消化法获取大鼠骨骼肌卫星细胞,进行体外培养,对获得的细胞进行形态学研究,以免疫组织化学方法进行鉴定。结果细胞增殖旺盛,分化良好,可融合成肌管。免疫细胞化学染色显示,骨骼肌卫星细胞呈弱阳性,肌管呈强阳性。结论两步消化法体外培养的骨骼肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力,用此种方法可培养出高纯度的骨骼肌成肌细胞,操作简单、污染少。     

Influence of skeletal muscle satellite cells implanted into infarcted myocardium on remnant myocyte volumes

Objective To study the effects of skeletal muscle satellite cells implanted into infarcted myocardium on the volume of remnant myocytes.Methods Thirty-six adult mongrel canines were divided randomly into implantation group and control group. In the implantation group, skeletal muscle satellite cells taken from the gluteus maximus muscles of the dogs were cultured, proliferated and labeled with 4’, 6-diamidino-2-phenylindone (DAPI) in vitro. In both groups, a model of acute myocardial infarction was established in every dog. In the implantation group, each dog was injected with M199 solution containing autologous skeletal muscle satellite cells. The dogs in the control group received M199 solution without skeletal muscle satellite cells. The dogs of both groups were killed 2, 4 and 8 weeks after implantation (six dogs in a separate group each time). Both infarcted myocardium and normal myocytes distal from the infracted regions isolated were observed under optical and fluorescent microscope. Their volumes were determined using a confocal microscopy image analysis system and analyzed using SAS. A P&lt;0.05 was considered significant.Results A portion of the implanted cells differentiated into muscle fiber with striations and were connected with intercalated discs. Cross-sectional area and cell volume were increased in normal myocardium. Hypertrophy of remnant myocytes in the infarcted site after skeletal muscle cell implantation was much more evident than in the control group. Cross-sectional area, cell area and cell volume differed significantly from those of the control group (P&lt; 0.05). Hypertrophy of the cells occurred predominantly in terms of width and thickness, whereas cell length remained unchanged. Conclusion Skeletal muscle satellite cells implanted into infarct myocardium, could induce the hypertrophy of remnant myocyte cells in the infarcted site and could also aid in the recovery of the contractile force of the infarcted myocardium.     

成肌调节因子MyoD和Myf-5在人体失神经骨骼肌中的表达及其临床意义

目的　研究人体骨骼肌失神经支配后成肌调节因子MyoD和Myf 5蛋白的表达变化 ,了解骨骼肌的再生状态。方法　 2 0例不同时间人体失神经骨骼肌与 3例正常骨骼肌标本 ,HE染色和透射电镜观察肌卫星细胞形态变化 ;抗MyoD和Myf 5多克隆抗体免疫组织化学染色 (ABC法 ) ,统计阳性染色细胞核数。 结果　抗MyoD和Myf 5抗体阳性染色细胞核数在人体骨骼肌失神经 1～ 2月时的肌卫星细胞中最多 ;3个月后急剧下降 ,并维持在一低水平 ;1年后几乎无表达。结论　人体骨骼肌失神经支配后早期肌卫星细胞通过MyoD和 (或 )Myf 5途径激活、开始增殖分化并被耗竭     

bFGF、TGF-β联合使用对大鼠骨骼肌卫星细胞增殖能力的影响

目的:探讨bFGF和TGF-β联合使用对体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞增殖能力的影响。方法:采用组织学方法观察bFGF组、TGF-β组、bFGF+TGF-β组及对照组中体外培养的大鼠骨骼肌卫星细胞形态变化及细胞增殖状况。结果:bFGF和TGF-β单独作用对体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞增殖作用较弱;两者联合作用,促增殖作用显著增强。结论:bFGF和TGF-β联合作用对体外培养骨骼肌卫星细胞的增殖起了重要作用。     

骨骼肌卫星细胞的体外培养

目的:探讨GH,HGF,bFGF,TGF,IGF-Ⅰ等多种生长因子联合使用对体外培养人骨骼肌卫星细胞增殖能力的影响。方法:选取临床手术切取的儿童肌肉活检标本20例,实验分为4组:TGF+IGF-Ⅰ组(5例);bFGF+TGF-β组(5例);GH+HGF组(5例);GH,HGF,bFGF,TGF,IGF-Ⅰ组(5例)。进行体外骨骼肌卫星细胞的培养,然后在培养基中分别加GH,HGF,bFGF,TGF,IGF-Ⅰ等生长因子,采用MTT法测TGF+IGF-Ⅰ、bFGF+TGF-β、GH+HGF及GH,HGF,bFGF,TGF,IGF-Ⅰ对骨骼肌卫星细胞增殖的影响。结果:在体外培养过程中,GH,HGF,bFGF,TGF,IGF-Ⅰ联合使用促进骨骼肌卫星细胞增殖的作用明显高于TGF+IGF-Ⅰ组、bFGF+TGF-β组及GH+HGF组,差异有显著性(P<0.01);而TGF+IGF-Ⅰ组与bFGF+TGF-β组;TGF+IGF-Ⅰ组与GH+HGF;bFGF+TGF-β组与GH+HGF组骨骼肌卫星细胞的增殖能力比较,差异无显著性(P>0.05)。结论:TGF+IGF-Ⅰ组;bFGF+TGF-β组及GH+HGF组作用对体外培养大鼠骨骼肌卫星细胞有增殖作用,但其作用较弱,而GH,HGF,bFGF,TGF,IGF-Ⅰ联合使用对骨骼肌卫星细胞增殖作用明显。本实验为体外对骨骼肌卫星细胞的增殖能力提供了重要的实验依据。     

小鼠快、慢肌卫星细胞的分离培养及β肌动蛋白的表达

目的 体外分离培养和纯化小鼠快、慢肌卫星细胞，观察细胞内β肌动蛋白（β-actin）的表达情况。方法 采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化法及差速贴壁法纯化ICR小鼠后肢骨骼肌腓肠肌（快肌）和比目鱼肌（慢肌）卫星细胞，免疫荧光抗体细胞化学染色法鉴定。取第2代快、慢肌卫星细胞提取总RNA，以GAPDH作为内参行RT-PCR，半定量分析快、慢肌卫星细胞内β-actin基因的相对表达量。结果 体外分离及传代培养快、慢肌卫星细胞的快、慢肌肌浆蛋白表达阳性，细胞生长和增殖情况良好。快、慢肌卫星细胞内β-actin基因的相对表达量分别为3.71072和2.106028，两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论 小鼠快肌卫星细胞内β-actin表达高于慢肌，提示骨骼肌卫星细胞内β-actin表达可能与肌纤维类型有关。