华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a类抗原基因的克隆、表达和免疫学诊断价值评价

目的采取免疫学方法筛选华支睾吸虫成虫cDNA表达文库,寻找新的抗原基因。方法使用华支睾吸虫病人混合血清以及华支睾吸虫排泄分泌抗原的免疫小鼠血清,分别免疫学筛选华支睾吸虫成虫λ ZAP cDNA表达文库;将阳性噬菌体克隆、测序以及核苷酸序列比对分析;将目的基因的编码区克隆至原核表达质粒pET28a(+)中,采用制备不带N端融合标签的天然蛋白的策略表达融合蛋白,使用组氨酸标签亲和纯化柱（Ni NTA树脂）纯化融合蛋白;采用间接ELISA法,检测血清中的特异性抗体,共检测35例华支睾吸虫虫卵粪检阳性血清,36例正常人血清,15例日本血吸虫、15例卫氏并殖吸虫和13例猪囊尾蚴病人血清,评价重组蛋白的免疫学诊断价值。结果发现华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a（GRA2a）类抗原基因家族,将其中的Cs4抗原基因植入重组表达质粒pET28a(+)的NcoI位点,成功实现融合蛋白的表达,并进一步纯化得到可溶性重组蛋白。采用间接ELISA法检测血清中的特异性抗体,该ELISA法的敏感性为80.0%,特异性为97.2%,总符合率为88.7%;日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴病人血清的假阳性率分别为6.7%、6.7%和7.7%。经核苷酸序列同源性比较,华支睾吸虫GRA2a类抗原是迄今为止尚未进行功能研究的华支睾吸虫特异性抗原。结论发现华支睾吸虫GRA2a类抗原基因家族;成功构建重组表达质粒,并表达、纯化出可溶性重组蛋白;该抗原具有较高的免疫学诊断价值。     

华支睾吸虫钙结合蛋白Cs16的重组表达及血清诊断应用的初步评价

目的以原核和真核表达系统克隆、表达华支睾吸虫含有EF手型结构域的钙结合蛋白(Cs16),纯化并初步评价其在华支睾吸虫病免疫诊断中的作用。方法以华支睾吸虫成虫c DNA为模板,PCR扩增含有EF手型结构域的Cs16基因,分别构建原核重组质粒p GEX-4T-1-Cs16和真核重组质粒p PIC9K-Cs16,将酶切和测序鉴定正确的重组质粒分别转入大肠埃希菌BL21和毕赤酵母GS115后,表达并纯化目的蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)验证其纯度及免疫原性。以华支睾吸虫重组蛋白Cs16为包被抗原,采用ELISA检测24例华支睾吸虫病患者血清中相应抗体的反应性及其与日本血吸虫病患者血清的交叉反应性。结果PCR扩增获得Cs16基因片段,大小为515 bp。构建的重组质粒p GEX-4T-1-Cs16和p PIC9K-Cs16经酶切和测序鉴定正确。SDS-PAGE结果显示,2个重组质粒在大肠埃希菌BL21和毕赤酵母GS115中均为可溶性表达,重组蛋白Cs16相对分子质量约为16 000。Western blotting结果显示,2个重组蛋白能分别被抗GST抗体和抗His抗体特异性识别。ELISA检测结果显示,原核表达和真核表达重组蛋白Cs16的敏感性分别为70.8%(17/24)和54.2%(13/24),特异性分别为95.2%(20/21)和100%(21/21),差异均有统计学意义(P0.05)。与日本血吸虫病患者血清的交叉反应为1/10。结论获得了原核和真核Cs16重组抗原,其在华支睾吸虫病的诊断上具有潜在的应用价值。     

巨片形吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶的克隆、表达和免疫学诊断价值评价

目的免疫筛选巨片形吸虫成虫c DNA表达文库,并克隆和重组表达巨片形吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx),初步评价其免疫诊断价值。方法用巨片形吸虫病患者的混合血清免疫学筛选巨片形吸虫成虫λZAP c DNA表达文库,取阳性噬菌体进行克隆、测序及序列比对分析。将TPx基因全长片段和N段截短片段分别克隆至原核表达质粒p ET28a(+)中,用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化2种重组蛋白r Fg TPx和r Fg TPx_nt(N端截短型)。以间接ELISA法,检测27例巨片形吸虫病患者治疗前后的血清,15例日本血吸虫病和15例华支睾吸虫病的患者血清,32位健康人血清,评价重组蛋白的免疫诊断价值。结果克隆的巨片形吸虫TPx基因,经原核表达、纯化并复性,获得其可溶性重组蛋白r Fg TPx和r Fg TPx_nt,相对分子质量(Mr)分别为30 000和26 000。以重组蛋白r Fg TPx_nt为检测抗原的ELISA检测的敏感性为66.7%(18/27),特异性为96.8%(60/62),总符合率为87.6%(78/89),与日本血吸虫病和华支睾吸虫病患者血清的交叉反应率分别为0和1/15。巨片形吸虫病患者治疗前后血清的A450值分别为0.233±0.088和0.129±0.072,差异有统计学意义(t=4.27,P0.01)。结论筛选并克隆了巨片形吸虫TPx抗原基因,实现原核表达,并证明该重组蛋白作为人体巨片形吸虫病的免疫诊断抗原具有较好的诊断意义,亦有可能具有早期诊断和疗效考核价值。     

华支睾吸虫19kDa分泌型蛋白(CsSP19)基因的克隆、表达与免疫学功能研究

目的对一个新发现的华支睾吸虫分泌型蛋白的未知基因,进行克隆表达和重组产物的免疫学鉴定,确定其免疫学功能。方法利用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫全长cDNA质粒文库中发现一个编码分泌型蛋白的新基因（克隆号Cs004f03）,将去除信号肽序列的编码序列克隆到原核表达质粒pET-28a（＋）中,IPTG诱导表达,产物经亲和层析纯化,并制备大鼠免疫血清,Western-blot方法分析其抗原性和分泌性。结果CsSP19开放阅读框（ORF）有564bp,编码188个氨基酸,理论分子量为21.2kDa,成熟肽的理论分子量为19kDa。该基因的成熟肽编码区在大肠杆菌中可获得高表达,重组蛋白能被华支睾吸虫病人血清所识别,同时,重组蛋白免疫血清也能识别华支睾吸虫分泌排泄抗原中分子量约19kDa的蛋白条带。结论CsSP19蛋白是华支睾吸虫分泌排泄抗原中一个有潜在诊断价值的分泌蛋白。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶的基因表达与在ELISA诊断上的应用研究

目的 探讨重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶在华支睾吸虫病血清学诊断上的应用价值。方法 以成虫cDNA为模板PCR扩增GenBank中一个华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(No．AF093242，简称CysB)的部分基因片段，亚克隆到pTrcHis表达载体，转化入大肠埃希菌DH5α。表达出的重组蛋白经亲合层析纯化后用于ELISA检测华支睾吸虫及其他寄生虫感染血清，评价其诊断应用价值。结果 成功克隆与表达CysB基因片段，纯化后的重组蛋白用于华支睾吸虫病诊断的敏感性达96．0％(48／50)，与其他寄生虫病的总交叉反应为3．8％(1／26)，而对比实验中可溶性粗抗原(CAA)用于检测的敏感性为88．0％(44／50)．与其他寄生虫感染血清无交叉反应。结论 重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(CysB)用于ELISA诊断技术具有较高的敏感性及特异性，有希望成为可溶性粗抗原的替代之一。     

华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因的克隆表达和重组蛋白的免疫学分析

目的对新发现的华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)的组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因进行克隆、表达和免疫学初步研究。方法将华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因(去除了信号肽编码序列)克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白免疫SD大鼠制备抗血清。用蛋白印迹(Western blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性;并且能识别感染了华支睾吸虫的SD大鼠血清,表明具有免疫反应性。结论华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

华支睾吸虫CsSCCRO基因的克隆表达和蛋白纯化

目的原核表达华支睾吸虫鳞状上皮癌相关肿瘤基因(SCCRO)全长编码区序列,获得纯化的重组蛋白,为进一步功能研究做好准备。方法用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫全长cDNA文库中识别出与人鳞状上皮癌相关基因的同源序列及其全长编码区,将其编码区序列克隆到原核表达载体PET-30a(+),测序鉴定重组质粒,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,重组产物用His-镍蛋白纯化柱纯化。结果华支睾吸虫鳞状上皮癌相关基因长度为1 218bp,其全长编码序列长度为780bp,编码259个氨基酸,1-22位为分泌信号肽,在羧基端有一个高度保守的区域。该基因在大肠杆菌中得到了高效的可溶性表达,重组蛋白达总蛋白的39%,纯化后的重组蛋白纯度可达98%。结论鳞状上皮癌相关基因的PET-30a(+)原核重组质粒在大肠杆菌BL-21/DE3中可以稳定高效地表达可溶性蛋白。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶的基因表达与在ELISA诊断上的应用研究

目的探讨重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶在华支睾吸虫病血清学诊断上的应用价值. 方法以成虫cDNA为模板PCR扩增GenBank中一个华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(No. AF093242,简称CysB)的部分基因片段,亚克隆到pTrcHis表达载体,转化入大肠埃希菌DH5α.表达出的重组蛋白经亲合层析纯化后用于ELISA检测华支睾吸虫及其他寄生虫感染血清,评价其诊断应用价值. 结果成功克隆与表达CysB基因片段,纯化后的重组蛋白用于华支睾吸虫病诊断的敏感性达96.0%(48/50),与其他寄生虫病的总交叉反应为3.8%(1/26),而对比实验中可溶性粗抗原(CAA)用于检测的敏感性为88.0%(44/50),与其他寄生虫感染血清无交叉反应. 结论重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(CysB)用于ELISA诊断技术具有较高的敏感性及特异性,有希望成为可溶性粗抗原的替代之一.     

华支睾吸虫3个半胱氨酸蛋白酶N端短片段原核表达及其抗原性分析

目的 通过克隆和表达获得华支睾吸虫3个半胱氨酸蛋白酶N端短片段重组蛋白并分析其抗原性。方法 以pET-28a-CsCP1-3重组质粒为模板进行目的片段CsCP1a-3a PCR扩增,构建pET28a-CsCP1a-3a表达载体,并转化至BL21(DE3)大肠埃希菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE分析;表达产物经变性、纯化及复性,与华支睾吸虫感染大鼠血清行Western blot分析。结果 成功构建pET28a-CsCP1a-3a重组质粒;SDS-PAGE分析显示,重组蛋白CsCP1a-3a以包涵体形式表达;重组蛋白CsCP1a-3a可被华支睾吸虫感染后第4、5周大鼠血清识别。结论 重组蛋白CsCP1a-3a具有较好抗原性,可作为华支睾吸虫感染诊断候选分子。     

重组华支睾吸虫诊断抗原研究进展

华支睾吸虫多种诊断抗原的基因已被克隆和重组表达，一些重组抗原已初步应用于华支睾吸虫病的免疫学诊断，显示出较高的诊断价值。     

华支睾吸虫一个谷胱甘肽转移酶新基因的克隆与表达

目的 克隆华支睾吸虫(Clonorchis sinensis,Cs)谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase,GST)的一个新基因,并在大肠杆菌中表达。方法 用PCR方法从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库中扩增新基因CsGST1,对DNA及其推导的氨基酸进行序列分析。将CsGST1克隆到原核表达载体pET-30a(+),在大肠杆菌BL21/DE3表达,用SDS-PAGE鉴定重组蛋白。结果 从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库扩增出642 bp的CsGSTl,序列分析显示它所编码的氨基酸序列与麝猫后睾吸虫GST的同源性最高(88％),并具有GST N-末端和C-末端的保守功能域。构建了重组质粒pET-30a(+)-CsGST1,SDS-PAGE显示CsGST1在大肠杆菌中得到了高效表达,pET-30a(+)-CsGST1的蛋白条带的分子量约为30 kDa。结论成功构建了CsGST1的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究该基因的功能打下了基础。     

两种方法纯化的抗体筛选华支睾吸虫模拟抗原表位的比较

目的比较用不同方法纯化的IgG从噬菌体随机12肽库中筛选出的华支睾吸虫模拟抗原表位。方法用饱和硫酸铵沉淀法和饱和硫酸铵沉淀法加层析法(两步法)纯化提纯的华支睾吸虫病患者血清IgG筛选华支睾吸虫模拟抗原表位,扩增随机挑取噬菌斑并进行序列分析和免疫学鉴定。结果硫酸铵沉淀法纯化IgG筛选的20个噬菌体克隆,6个有不同的DNA插入序列,Western blot显示6个克隆均可与华支睾吸虫患者血清反应,斑点免疫金银染色法有3个克隆可被华支睾吸虫患者血清识别。两步法纯化IgG筛选的20个噬菌体克隆,9个有DNA插入序列,其中有2个序列相同;Western blot和斑点免疫金银染色法显示9个克隆均可与华支睾吸虫患者血清反应。结论两种方法纯化的IgG均筛选到了可与华支睾吸虫患者血清结合的模拟抗原表位,用两步法纯化IgG筛选的模拟抗原表位更具有潜在的诊断价值。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶两种表达方式的比较

目的 比较原核和真核2种表达系统重组表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶方法的优劣和目的产物的血清免疫学检测效果。方法 根据已知的华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶序列分别设计引物扩增目的基因, 与相应的表达载体相连分别构建原核表达质粒pET28a?CP和真核表达质粒pPIC9K?CP, 双酶切及测序鉴定后, 将正确的重组质粒分别转入大肠埃希菌（E. coli） BL21 （DE3） 和毕赤酵母GS115中诱导表达、 纯化; 将获得的纯化蛋白采用ELISA方法检测华支睾吸虫病人血清和正常人血清, 比较诊断效果。结果 原核表达系统表达的华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶以包涵体形式存在, 表达量为6.84 mg/L; 真核表达系统表达量达到65.00 mg/L, 且为可溶性蛋白; 两者检测华支睾吸虫病的敏感性分别为95.00%（57/60） 和 93.30% （56/60）, 特异性分别为91.67% （77/84） 和94.10% （79/84）, 差异均无统计学意义 （P均 > 0.05）。结论 真核表达华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶较原核表达系统具有更高的应用价值。     

华支睾吸虫F0-ATP合酶b亚基基因的克隆表达和重组蛋白的免疫原性分析

目的 对华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基（CsF₀-ATP-synt_B）基因进行克隆、表达及重组蛋白的免疫原性分析。 方法 以华支睾吸虫成虫cDNA文库中含有F₀-ATP合酶b亚基基因的质粒为模板，扩增该基因（去除线粒体靶向序列的成熟肽基因），将其克隆到原核表达质粒pET-28a（+）中，转化大肠埃希菌BL21（DE3），异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，经亲和层析获得的纯化表达产物免疫SD大鼠，制备抗血清。蛋白质印迹（Western blotting）分析重组蛋白的免疫原性。 结果 华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基成熟肽基因的编码区含813个碱基，编码271个氨基酸，相对分子质量（Mr）为31 171.9。经亲和层析获得的重组蛋白可被其免疫的大鼠血清识别。 结论 华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达。     

华支睾吸虫Rap2B样基因的生物信息学分析及其克隆、表达

目的从华支睾吸虫cDNA文库中筛选Rap2B样基因并分析其结构和功能,初步进行克隆和表达纯化,为进一步研究其功能奠定基础。方法利用多种生物信息学分析软件,分析华支睾吸虫Rap2B蛋白的拓扑学结构、生物学和免疫学功能特征。设计引物,从华支睾cDNA质粒文库中扩增目的基因cDNA序列,构建原核重组质粒并初步表达纯化。结果华支睾吸虫Rap2B样基因长度为847bp,其全长编码序列为426bp,编码141个氨基酸,理论分子量是15851.1。重组的原核表达质粒pET-28a(+)-Rap2B经PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒构建成功。该基因在大肠杆菌中能高效表达。经His亲和层析柱获得了纯化的重组蛋白,Western blotting证实Rap2B重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别。结论华支睾吸虫Rap2B蛋白经生物信息学预测为ras原癌基因家族成员,可能在华支睾吸虫致癌过程中有一定作用。该基因可在原核表达系统中高效表达,并得到了纯化的重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能以及在致病尤其是可能促发肿瘤的作用方面奠定一定基础。     

卫氏并殖吸虫TPx基因的克隆、表达和免疫学诊断价值

目的免疫筛选卫氏并殖吸虫成虫c DNA表达文库,克隆并表达卫氏并殖吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx),初步评价其免疫诊断价值。方法用卫氏并殖吸虫病患者的混合血清筛选卫氏并殖吸虫成虫λZAP c DNA表达文库,取阳性噬菌体进行克隆、测序和序列比对分析。将TPx基因全长片段和前端截短片段分别克隆至原核表达质粒pET28a (+)中,构建r Pw TPx (全长型)和r Pw TPx1 (截短型)表达载体。构建的重组蛋白经1 mmol/L的异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。使用蛋白抽提剂、溶菌酶和核酸酶裂解表达细菌,用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化r Pw TPx和r Pw TPx1, SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况。以r Pw TPx、r Pw TPx1和粗抗原作为检测抗原,间接ELISA法检测36份卫氏并殖吸虫病、 15份华支睾吸虫病、 15份日本血吸虫病、 15份片形吸虫病和15份猪囊尾蚴病的患者血清,以及36份健康人血清,评价该重组蛋白的免疫诊断价值。以健康人血清对照组的平均值加上4个标准差作为阳性判断值。所有数据均采用SAS 9.2软件进行统计学分析。结果克隆的卫氏并殖吸虫TPx基因,经原核表达、纯化,获得其可溶性重组蛋白r Pw TPx和r Pw TPx1,相对分子质量(Mr)分别为25 000和22 000。以r Pw TPx作为检测抗原的ELISA检测结果显示,卫氏并殖吸虫病患者、健康者、华支睾吸虫病患者、日本血吸虫病患者、片形吸虫病患者和猪囊尾蚴病患者血清组的吸光度(A450值)分别为0.150±0.092、 0.036±0.014、 0.043±0.019、 0.047±0.013、 0.060±0.022和0.048±0.021。卫氏并殖吸虫病患者血清阳性率为58.3%(21/36), 36份健康人血清、 15份华支睾吸虫病患者血清、 15份日本血吸虫病患者血清、 15份猪囊尾蚴病患者血清均未检出阳性,15份片形吸虫病患者血清假阳性为2/15。以r Pw TPx1作为检测抗原ELISA检测结果则为0.144±0.092、 0.022±0.009、 0.027±0.015、 0.033±0.022、 0.036±0.015和0.032±0.018。卫氏并殖吸虫病患者血清阳性率为88.9%(32/36),健康人血清未检出阳性,15份华支睾吸虫病患者血清仅1份存在交叉反应,15份日本血吸虫病患者血清假阳性为3份,15份片形吸虫病患者和15份猪囊尾蚴病患者血清假阳性均为2份。重组蛋白r Pw TPx的ELISA检测敏感性为58.3%,特异性为97.9%,总符合率为87.1%;r Pw TPx1则分别为88.9%、 91.7%、 90.9%。r Pw TPx1敏感性高于r Pw TPx (P <0.05)。以成虫粗抗原为检测抗原的ELISA检测结果显示,36份健康者血清A450值为0.012,标准差为0.006。敏感性为100%,特异性为83.3%,总符合率为87.9%,与r Pw TPx-ELISA和r Pw TPx1-ELISA检测的总符合率差异无统计学意义(P> 0.05)。结论筛选并克隆了卫氏并殖吸虫TPx基因,表达并纯化全长型和截短型两种重组TPx抗原,构建的全长型和截短型重组TPx抗原作为人体卫氏并殖吸虫病的免疫诊断抗原具有一定的诊断意义。     

华支睾吸虫磷脂酶A2基因生物学特性的初步研究

目的对新发现的华支睾吸虫磷脂酶A2（CsPLA2）基因进行生克隆、原核表达,确定该蛋白是否为成虫分泌/排泄蛋白（excretory-secretory protein,ESP）。方法利用多种生物信息学分析软件,从华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中识别出CsPLA2样基因,分析该基因表达蛋白的生物学功能特征;将CsPLA2克隆入原核表达质粒pET28a（＋）,并在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达,蛋白表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定;应用Western blot确定CsPLA2是否为ESP;应用免疫荧光方法观察CsPLA2在成虫的组织定位。结果该基因编码307个氨基酸,含有信号肽序列,具有PLA2功能域和活化位点,与谷蛀虫同源蛋白相比,一致性为45%,相似性为52%。PCR、双酶切及DNA测序结果表明pET28a-CsPLA2重组质粒构建成功,SDS-PAGE显示目的基因在大肠埃希菌BL21/DE3中高效表达,表达产物为包涵体。Western blot结果表明CsPLA2是华支睾吸虫的ESP组分之一。虫体免疫组织化学定位显示CsPLA2定位于虫体的腹吸盘、肠支、睾丸处。结论新发现一个CsPLA2基因,其表达的蛋白定位于虫体的腹吸盘、肠支、睾丸处,为华支睾吸虫成虫ESP组分之一。该基因可在原核表达系统中高效表达。     

华支睾吸虫NOSIP基因的克隆表达及免疫学鉴定

目的对华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白(CsNOSIP)进行克隆和原核表达,初步了解其重组产物的免疫学功能。方法从华支睾吸虫基因文库中获得CsNOSIP的全长cDNA并克隆至原核表达质粒pET-30a(+)中,诱导表达后用亲和层析柱进行纯化,用纯化的rCsNOSIP及rCsNOSIP蛋白免疫BALB/c小鼠以获得rCsNOSIP免疫血清,采用Western blot鉴定重组蛋白CsNOSIP的表达及其反应原性;采用ELISA检测rCsNOSIP免疫小鼠血清特异性抗体亚类水平。结果 CsNOSIP基因的开放阅读框(ORF)包含867 bp,编码288个氨基酸,PCR、双酶切及DNA测序表明pET-30a(+)-CsNOSIP重组质粒构建成功。SDS-PAGE检测目的蛋白在大肠埃希菌BL21/DE3中获得高效表达,表达产物相对分子质量为35×10~3;经亲和层析法获得高纯度的重组蛋白,该蛋白可被His单抗、CsNOSIP免疫小鼠血清、感染华支睾吸虫小鼠血清及ESP免疫血清识别,重组蛋白免疫血清能识别CsESP;ELISA检测显示rCsNOSIP免疫小鼠血清特异抗体滴度为1∶25 600,以IgG1水平较高。结论 CsNOSIP可在原核表达系统中呈现高效可溶性表达,且具有抗原性,是华支睾吸虫分泌排泄抗原(CsESP)之一,免疫小鼠后可获得高滴度的特异性抗体,抗体亚类以IgG1为主,为该蛋白的功能研究奠定了基础。     

华支睾吸虫GST2 TP22.3融合蛋白的构建及其免疫原性初步研究

目的构建华支睾吸虫候选诊断分子pET32a ( + ) GST2 TP22.3重组质粒,表达及纯化CsGST2 CsTP22.3融合蛋白,为诊断抗原的研究奠定基础。方法选用合适的限制性内切酶,先后将CsGST2、CsTP22.3克隆入pET32a(+)质粒,转化BL21 宿主菌,IPTG诱导重组质粒的表达,亲和层析纯化表达产物,用SDS PAGE 和Western blotting 进行分析鉴定。结果PCR、双酶切、测序结果均表明CsGST2 CsTP22.3重组质粒构建成功,重组融合蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性。结论pET32a ( + ) CsGST2 CsTP22.3重组质粒构建成功,为下一步研究其功能奠定基础。