PAK6基因的克隆、抗体制备及在前列腺癌中的表达

目的 在克隆P21相关激酶6(PAK6)全长cDNA的基础上,进一步克隆PAK6-N端基因并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化基因产物并进行多克隆抗体制备,为研究PAK6与疾病的关系奠定基础.同时研究PAK6在前列腺癌中的表达.方法 根据人全长PAK6 cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板利用PCR技术克隆PAK6全长cDNA.在此基础上,以PAK6全长cDNA为模板克隆PAK6-N端基因,将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中,经EcoRI/XhoI双酶切鉴定后,进行DAN序列测定.GST-PAK6-N融合蛋白在硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下在大肠杆菌BL21中得到表达.利用G1utothione亲和层析纯化融合蛋白,用纯化的GST-PAK6-N融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并用纯化的抗PAK6多克隆抗体在3例前列腺癌病人标本中进行了免疫组化表达的初步研究.结果 成功克隆了PAK6全长cDNA和PAK6-N端基因片断,在E.coli中表达了PAK6-NT,纯化了GST-PAK6-N融合蛋白,并制备了PAK6特异性抗体.免疫组织化学研究表明:3例前列腺癌患者石蜡包埋病理组织切片免疫组化染色全部表现为间质阳性,PAK6在前列腺癌间质中呈现表达,而前列腺癌细胞则不染色.结论 首次克隆了PAK6全长cDNA和PAK6-N端基因片断并成功制备了PAK6特异性抗体,为深入探讨PAK6在前列腺癌中的作用奠定了基础.初步揭示PAK6在前列腺癌的表达     

肿瘤抗原基因MAGE-3的克隆、原核表达与纯化

目的: 克隆人MAGE-3基因并进行原核表达和分离纯化. 方法: 通过RT-PCR从人黑色素瘤细胞株中扩增MAGE-3全长cDNA,经PCR扩增MAGE-3基因3′端324 bp片段,克隆入pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX/MAGE-3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化.结果: 经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,以此为模板经PCR扩增出约320 bp片段,测序结果与GenBank公布的MAGE-3序列一致,成功构建了pGEX/MAGE-3原核表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达Mr约42 000的GST融合蛋白,纯化的蛋白纯度为89%.结论: 成功克隆了人MAGE-3基因全长cDNA并对其3′端324 bp片段编码的108个氨基酸的蛋白进行了原核表达和分离纯化,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

小鼠TLR-2N末端基因的克隆表达和抗体制备

目的 克隆mTLR-2基因氨基端序列,并表达和纯化N端融合蛋白,制备抗mTLR-2 N末端的多克隆抗体.方法 采用PCR技术扩增编码mTLR-2N端1～153氨基酸的基因,并将其克隆到pET32A载体中,测序验证;用大肠杆菌表达融合蛋白,并以Probond树脂柱纯化;免疫家兔制备多克隆抗体,采用免疫组化、流式细胞术及间接ELISA检测抗体特异性及效价.结果 成功构建了融合表达载体pET-N,表达和纯化了相应的融合蛋白,所制备多克隆抗体可与pGEX-N表达的融合蛋白反应,并可结合表达TLR-2的RAW264.7及转染mTLR-2全长基因的CHO细胞.结论 获得了mTLR-2 N末端重组融合蛋白及其可与天然mTLR-2结合的多克隆抗体.     

粘附结构蛋白migfilin基因N末端的克隆和抗体制备

目的 克隆migfilin-N末端基因并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化基因表达产物并进行多克隆抗体制备,为研究migfilin与大肠癌的关系奠定基础.方法 根据人migfilin全长cDNA系列,设计PCR引物,以人大肠癌cDNA文库为模板克隆migfilin-N末端基凶,将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中,经EcoRI/XhoI双酶切鉴定后,进行DNA序列测定.GST-migfilin-N融合蛋白在硫代半乳糖苷诱导下在大肠杆菌BL21中得到表达.利用谷胱甘肽亲和层析纯化融合蛋白,用纯化的GST-migfilin-N融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体.并用纯化的抗migfilin多克隆抗体在不同的细胞株中用Western blotting检测migfilin的表达.结果 成功克隆了migfilin-N端基因片段,表达并纯化了GST-migfilin-N融合蛋白,制备了migfilin特异性抗体.Western blotting检测migfilin在不同细胞株中的表达,结果显示migfilin在肺癌及大肠癌细胞株中高表达.结论 migfilin特异性抗体制备成功,为深入探讨migfilin在大肠癌中的作用奠定了基础.     

人类生精相关基因TSARG6的原核表达和抗体制备

目的 构建人类生精相关基因pGEX-KG/TSARG6原核表达载体,原核表达、制备并鉴定多克隆抗体.方法 以人类睾丸cDNA文库为模板,用PCR方法扩增得到TSARG6基因开放阅读框(ORF)全长序列,插入原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入E.coli JM109细菌,IPTG 诱导表达GST/TSARG6融合蛋白,采用SDS-PAGE 和Western blot鉴定融合蛋白,免疫家兔,制备抗TSARG6 多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性.结果 经测序验证,我们成功构建了pGEX-KG/TSARG6 重组质粒;转化重组质粒的E.coli JM109细菌经 IPTG 37℃诱导3 h后高效表达GST/TSARG6融合蛋白;Western blot 实验结果显示制备的多克隆抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了TSARG6基因的原核表达和多克隆抗体制备,为TSARG6的后续功能研究提供了有力的工具.     

癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.     

重组人TALL-1基因全长及其胞外区片段的克隆和表达

目的　获得人TALL 1基因全长及其胞外区片段 ,构建重组表达载体并对其诱导表达。方法　利用RT PCR技术从人外周血单个核细胞中扩增出TALL 1全长及其胞外区基因编码区序列 ,克隆于载体pGEX 4T 1中 ,测序证实序列正确后转化大肠杆菌BL2 1,以IPTG诱导表达 ,SDS PAGE和Westernblot分析表达产物。结果　①从人外周血单个核细胞中扩增出编码TALL 1基因全长及其胞外区片段cDNA序列 ,序列测定证实与文献报道的序列一致 ;②成功构建了GST融合表达载体pGEX 4T 1 hTALL 1和pGEX 4T 1 sTALL 1;③表达了hTALL 1 GST和sTALL 1 GST融合蛋白。结论　人TALL 1基因全长及其胞外区片段的克隆成功及融合蛋白的表达 ,为进一步探索TALL 1抗原表位打下了基础。     

一个新的人信号识别微粒受体基因APMCF1的克隆、表达和抗体制备

目的：克隆人类新基因APMCF1，原核表达并制备其特异性多克隆抗体．方法：运用5’末端快速扩增方法，结合Genbank数据库进行电子拼接，完善APMCF1的5’端序列；利用RT-PCR方法，扩增出APMCF1的蛋白编码cDNA序列，克隆入pGEX-KG中，构建APMCF1的原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达后获得了GST-APMCF1融合蛋白，以此融合蛋白为免疫原制备兔抗血清，用Western blot鉴定抗体特异性．结果：通过RACE及电子拼接，完善了APMCF1的5’端序列，其cDNA长度为1745bp，与鼠信号识别微粒受体β亚基序列同源性较高，染色体定位于3q22．2；克隆了APMC2F1 816bp的开放读框序列并表达了GST-APMCF1融合蛋白．制备了特异性兔抗GST-APMCF1多克隆抗体．结论：APMCF1可能是编码人类信号识别微粒受体β亚基的基因．该分子多克隆抗体的初步制备，为进一步研究APMCF1的功能提供了必要工具。     

FKBP38的原核表达、抗体制备及其应用

目的 构建人FKBP38 N-末端及C-末端原核表达载体并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化基因表达产物,制备兔多克隆抗体并对该抗体用于Western免疫印迹、免疫荧光及免疫组织化学检测进行评价,为研究FKBP38的功能奠定基础.方法 以人FKBP38 cDNA为模板,根据人FKBP38全长cDNA系列,设计PCR引物分别扩增N-末端(1-207aa)及C-末端(209-387aa),将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-6P1中,经BamH I/Sa1 I双酶切鉴定.GST-FKBP38-N及GST-FKBP38-C融合蛋白在硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下在大肠杆菌BL21中得到表达.利用谷胱甘肽亲和层析纯化融合蛋白,用纯化的GST-FKBP38-N融合蛋白及GST-FKBP38-C融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体并进行纯化.使用纯化的抗FKBP38多抗以Western免疫印迹、免疫荧光及免疫组织化学检测FKBP38的表达与细胞内的定位.结果 成功构建FKBP38 N-末端及C-末端原核表达载体,表达并纯化了GST-FKBP38-N融合蛋白及GST-FKBP38-C融合蛋白,制备并纯化了FKBP38特异性抗体.该抗体用于Western免疫印迹检测FKBP38在不同细胞株中的表达,特异性强、效价高;用于免疫荧光检测FKBP38在细胞内主要定位于线粒体上;用于免疫组织化学检测FKBP38在乳腺组织细胞呈现胞浆阳性.结论 FKBP38特异性抗体制备成功,该抗体可用于FKBP38的免疫印迹、免疫荧光及免疫组织化学检测,为深入研究FKBP38的功能奠定基础.     

3*Flag-hPAK4重组质粒的构建及其在COS7细胞中的表达与定位

目的:构建3*Flag-hPAK4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内的表达与定位,并纯化PAK4蛋白。方法:提取人乳腺癌细胞MCF-7 mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPAK4全长编码基因,亚克隆至含有3*Flag标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到非洲绿猴肾成纤维细胞COS7中,提取细胞蛋白进行Western blotting检测,同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察3*Flag-hPAK4在COS7细胞内定位。使用免疫沉淀的方法纯化PAK4蛋白。结果:hPAK4全长基因序列克隆到了真核表达载体3*Flag中,酶切鉴定片段为1 800 bp。Western blotting检测到了融合蛋白3*Flag-hPAK4的表达,分子质量约为68 kDa,3*Flag-hPAK4在COS7细胞中表达定位在细胞浆中,成功纯化了PAK4蛋白。结论:成功地构建了3*Flag-hPAK4真核表达质粒,同时鉴定了3*Flag-hPAK4融合蛋白的表达,并纯化了PAK4蛋白。3*Flag-hPAK4蛋白主要定位在细胞浆中。     

人L-选择素的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建人L-选择素原核表达载体,表达并纯化人L-选择素重组蛋白,制备兔抗人L-选择素多克隆抗体。方法：利用人L-选择素cDNA的N末端胞外结构区153个氨基酸的开放阅读框架(ORF),通过PCR方法扩增出人L-选择素目的片段。将扩增的基因插入表达载体pQE40的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点之间,再经转化使其在大肠杆菌M15中表达,产生含6-His-tag的融合蛋白。融合蛋白经Ni亲合层析柱纯化和SDS-PAGE分析后,用以免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。最后经Western blotting检测和斑点杂交（DIBA）进行抗体效价测定。结果：酶切鉴定和DNA测序显示,pQE40-L-选择素重组表达载体含有人L-选择素N末端结构区153个氨基酸的cDNA序列;通过在大肠杆菌M15中的表达和纯化分析,获得了蛋白含量为600 mg·L^-1的人L-选择素蛋白;通过免疫新西兰白兔和抗体效价测定,得到抗血清效价达1∶1 000的多克隆抗体。结论：人L-选择素蛋白可在M15大肠杆菌中高效表达,其多克隆抗体效价较高。     

LRRC4多抗制备及在构建不同级别脑胶质瘤差异表达中的应用

目的:制备兔抗脑瘤候选抑瘤基因LRRC4(leucine-rich repeats containing 4)的多克隆抗体,应用该抗体检测LRRC4表达与脑胶质瘤病理分级的相关性.方法:应用DS Gene1.1软件分析LRRC4全长蛋白,避开跨膜结构域,选取亲水性及抗原性均好的蛋白序列.构建相应的融合表达载体pGEX-4 T-2/276 bp,转入E.coli JM109中IPTG诱导表达.融合蛋白经纯化后免疫新西兰兔,收集并纯化抗血清,获得兔抗人LRRC4多抗,应用该抗体通过Western印迹和免疫组织化学检测LRRC4在正常人胚胎各器官组织中的表达及其在正常脑组织与各级脑胶质瘤中的表达差异.结果:制备了效价高、特异性好的兔抗人LRRC4多抗,进一步证实了LRRC4在正常人脑组织中相对特异高表达,在脑胶质瘤中表达下调(22例/37例)或缺失(15例/37例),其表达水平与脑胶质瘤的病理分级相关.结论:兔抗人LRRC4多抗效价高、特异性好,应用该抗体检测到LRRC4的表达水平与脑胶质瘤病理分级密切相关,为LRRC4后续的研究工作奠定了基础.     

生精相关基因mTSARG3的原核表达和抗体制备

目的 构建小鼠生精相关基因pGEX-KG/mTSARG3重组载体,进行原核表达和多克隆抗体制备.方法 应用RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mTSARG3的开放阅读框,T-A克隆后将mTSARG3插入到原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入宿主菌E.coliBL21,IPTG诱导表达GST/mTSARG3融合蛋白,采用SDS-PAGE和Westernblotting对融合蛋白进行分析和鉴定.以融合蛋白为免疫原免疫家兔,制备抗mTSARG3多克隆抗体并进行Westernblotting鉴定.结果 成功构建了pGEX-KG/mTSARG3重组质粒,测序结果与预期一致;转化重组质粒的E-coliBL21经IPTG37℃诱导4h后高效表达GST/mTSARG3融合蛋白:Westernblotting实验结果显示制备抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了mTSARG3基因的原核表达和多克隆抗体制备,为下一步的功能研究奠定基础.     

大肠埃希菌Ⅵ型分泌系统相关蛋白多克隆抗体制备及分泌蛋白检测

目的为研究新近发现的大肠埃希菌(E.coli)Ⅵ型分泌系统的组成和功能,制备与之相关的三种重要蛋白AaiC、CRP和OmpA的多克隆抗体,并对分泌蛋白AaiC进行检测。方法采用PCR技术扩增出目的基因,并将其连接到pET-22b或pQE80原核表达载体中,酶切及测序鉴定正确后转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达蛋白并纯化,使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体。应用AaiC抗体检测E.coli RS218菌株分泌蛋白。结果重组质粒构建成功,并能够在E.coli中高效表达,免疫得到AaiC、CRP和OmpA高效价的特异性多克隆抗体。AaiC抗体检测证实RS218菌株能够分泌AaiC蛋白。结论成功制备了E.coli三种重要蛋白AaiC、CRP和OmpA的特异性抗体,检测出RS218菌株分泌AaiC蛋白,为进一步研究E.coliⅥ型分泌系统的生物学功能以及E.coli的致病机制奠定了基础。     

Clusterin蛋白在大肠杆菌中的表达及其多抗制备

目的：在大肠杆菌中表达Clusterin蛋白,并制备其兔抗Clusterin蛋白的多克隆抗体。方法：从MCF-7细胞提取mRNA,逆转录为eDNA,以此为模板PCR扩增Clusterin编码基因;将Clusterin编码区eDNA插入的pRSET-A原核表达载体,构建pRSET-A-elusterin;将重组质粒转化BL21（DE3）感受态细菌,以IPTG诱导6×His-C1usterin融合蛋白的表达,经亲和纯化柱与凝胶柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,将纯化的融合蛋白与弗氏佐剂混合制备成油包水悬液,常规免疫新西兰大白兔制备多抗,Western-blot检测该抗体识别内源性clusterin的特异性。结果：成功构建了Clusterin蛋白的原核表达载体pRSETA-clusterin;经表达并纯化的Clusterin蛋白纯度达到98％以上,免疫新西兰大白兔后制备得到了特异性的抗Clusterin的多抗。结论：成功地表达并纯化了Clusterin蛋白,并制备了特异性抗Clusterin多抗。     

人VIGILINN端融合蛋白的表达及亚细胞定位

目的 原核表达人VIGILIN N端基因,制备抗人VIGILIN的多克隆抗体,对人VIGILIN作亚细胞定位.方法 用PCR扩增人VIGILIN基因N端,克隆到表达载体pGEX-4T-2中,并在大肠杆菌中以IPTG诱导表达.产物经 Glutathion Sepharose 4B纯化后免疫新西兰白兔制备抗人VIGILIN N端融合蛋白抗体,采用ELISA和Western blot鉴定抗体的效价及特异性.通过细胞免疫荧光染色,观察VIGILIN在细胞中的分布.结果 在28 ℃、1 mmol/L IPTG诱导3 h的最优条件下成功表达GST-VIGILIN N端融合蛋白,抗体ELISA滴度为1:16000,Western blot证实抗体特异性较高,VIGILIN在细胞质和核中均有分布,核中的分布集中在核膜内侧和靠近DAPI染色显著的区域. 结论 成功表达人VIGILIN N端融合蛋白和制备兔抗人VIGILIN抗体,并应用于亚细胞定位,为研究人VIGILIN的性质和功能奠定基础.     

果蝇Bves蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的为了进一步研究细胞粘附分子Bves在肿瘤的发生及转移过程中的作用,需要获得Bves蛋白并制备其抗体。方法根据Flybase网站所提供的Bves基因序列,以果蝇的总RNA为模板进行PCR扩增,得到Bves部分编码序列,随后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达载体。重组表达质粒经酶切测序鉴定后,转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,并用IPTG诱导融合蛋白的表达,使用活化的Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化后得到的His-Bves融合蛋白免疫注射新西兰大白兔制备Bves多克隆抗体,并用Western blot对抗体效价进行检测。结果和结论获得了Bves原核表达重组融合蛋白及高效价的兔抗Bves多克隆抗体,为后期深入研究Bves基因的功能奠定了基础。