人肝再生增强因子单克隆抗体的制备:以非纯化的大肠杆菌表达抗原筛选杂交瘤

目的 :利用杂交瘤技术、以非纯化的大肠杆菌表达重组蛋白作为筛选抗原 ,制备小鼠抗人肝再生增强因子(hALR)的单克隆抗体。方法 :用实验室纯化的重组hALR 硫氧环蛋白融合蛋白免疫BALB c小鼠 ;小鼠脾细胞与SP2 0骨髓瘤细胞融合后经HAT选择培养基筛选杂交瘤 ;以重组质粒pQE30 hALR与空质粒pQE30在大肠杆菌中诱导表达后的细菌裂解产物作为筛选抗原和对照抗原 ,用ELISA方法筛选能分泌抗hALR单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆 ;进一步以ELISA方法和免疫印迹方法检测该杂交瘤细胞产生的抗体对真核细胞表达的重组hALR及人体血清中天然hALR的反应性。结果 :成功筛选出一株能稳定分泌抗hALR单克隆抗体的杂交瘤细胞 ;其产生的抗体能对真核细胞表达的重组hALR及人体血清中天然的hALR发生特异的抗原抗体反应。结论 :大肠杆菌表达的重组蛋白在以空质粒表达产物作为对照下 ,不经过任何纯化步骤也能够用于单克隆抗体制备中的杂交瘤筛选 ;hALR单克隆抗体为深入研究hALR提供了研究手段。     

体外免疫研制甲型肝炎病毒单克隆抗体

在细菌学、病毒学、免疫学及其它领域应用细胞融合法研制单克隆抗体取得许多成果。为建立分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系需要以抗原免疫BALB/c小鼠,而后用免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而获得。本文报告在体外免疫研制单克隆抗体。 作者们认为体外免疫的有用性,以甲型肝炎病毒(HAV)作为抗原,探讨了HAV单克隆抗体的制作法。取小测细胞在体外进行HAV免疫,与小鼠骨髓瘤细胞融合,243个孔有173     

杂交瘤细胞系在低血清和无血清培养基长期培养中抗体产生能力的丧失

本文报道了分泌特异性抗磷酰胆碱McAb(IgG_1)的鼠杂交瘤细胞系(167.4 G5.3),在不同血清浓度(10％、5％、2.5％、1.25％胎牛血清FBS)及无血清培养基OPTI—MEM中适应培养6个月以上,以观察其生长和细胞分泌抗体能力的变化。结果所有的适应细胞随着血清含量的升高,其分泌抗体能力越稳定。适应培养,虽然提高了该细胞系在低血清或无血清培养基中的生长率,但在低血清培养基中(1.25％FBS)细胞产生抗体能力丧失。在1.25％FBS条件下培养,     

体外免疫法生产单克隆抗体看来有希望

<正> 体外诱导抗特异性抗原的抗体的成功,将使生产人单克隆抗体的障碍得以排除。日内瓦大学的 Ness 等创建了一种体外免疫小鼠方法,用弱免疫原性和不溶性蛋白质能稳定地诱发产生相应的单克隆抗体。先将二氧化硅与蛋白质溶液混合,使蛋白质抗原固定在气化的二氧化硅上。继将悬浮在无血清培养基中的脾细胞与固定抗原混合7～9小时。再加胎牛血清温育5～8天。最后可用这种牌细胞产生杂交瘤,应用标准方法鉴定及分离适合的抗体。     

霉酚酸衍生物对小鼠T细胞免疫功能的抑制作用

目的研究2种新型霉酚酸衍生物(代号JU95-07B、JU100-07E)在体外对小鼠T细胞免疫功能的影响。方法小鼠脾细胞用抗CD3单克隆抗体(mAb)刺激,同时加入不同浓度(10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L)及在不同时间点(刺激细胞后第0、6、12 h)加入同一浓度(10-5mol/L)的霉酚酸衍生物后,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清中IFN-γ和IL-2的水平。同时利用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测霉酚酸衍生物对T细胞IFN-γ和IL-2的分泌、表面分子CD25的表达以及增殖的影响。结果 2种霉酚酸衍生物对抗CD3刺激条件下诱导的小鼠脾细胞产生的IFN-γ和IL-2均具有浓度依赖性抑制作用,并且在抗CD3刺激的不同时间点分别加入2种霉酚酸衍生物均能不同程度地抑制小鼠脾细胞产生IFN-γ和IL-2;同时,与单独使用抗CD3刺激相比,分别加入10-5mol/L浓度的2种霉酚酸衍生物后,均能抑制小鼠T细胞表面分子CD25的表达以及增殖。结论体外实验表明2种霉酚酸衍生物均对小鼠T细胞免疫功能具有明显抑制作用,该研究提示这2种霉酚酸衍生物可以抑制自身免疫性疾病和移植排斥反应。     

负载滋养层细胞抗原对小鼠树突状细胞表型及功能的影响

目的 研究负载滋养层细胞抗原对小鼠髓源性树突状细胞(DC)分化成熟过程的影响,获得致耐受性DC.方法 体外使用粒细胞巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导小鼠骨髓细胞定向分化、经LPS刺激获得成熟DC;通过外胎盘锥组织块培养法获得滋养层细胞,制备可溶性抗原,加入DC培养体系.流式细胞术检测DC表面共刺激分子及MHC-Ⅱ的表达,ELISA法检测DC分泌IL-10和IL-12的浓度,混合淋巴细胞培养评估 DC刺激同种T细胞增殖、活化的功能.结果 成熟DC表型为CD40high CD80highCD86highMHC-Ⅱhigh,分泌大量的IL-12和极少量的IL-10 ,体外能有效刺激T细胞的增殖;负载滋养层细胞抗原的DC表型为CD40midCD80lo wCD86lowMHC-Ⅱlow,在分泌大量IL-12的同时IL-10也明显升高,不能有效刺激T细胞增殖,并使T细胞分泌细胞因子呈现明显Th2偏倚.结论 负载滋养层细胞抗原后的DC表面共刺激分子及MHC-Ⅱ表达降低,刺激T细胞增殖能力下降;其自分泌和促使T细胞旁分泌的细胞因子呈现Th2偏倚,是一种耐受性DC.     

Flt3L对小鼠胸腺树突状细胞在FTOC体系中分化发育的作用

为了借助FTOC体系探讨Flt3L对小鼠胸腺树突状细胞分化发育的影响。摘取15～16d龄胎鼠胸腺进行体外器官培养(胎鼠胸腺器官培养-FTOC),根据所使用培养基的不同实验分为两组:对照组(基础培养基)和Flt3L组(培养基中含有细胞因子Flt3L),在体外进行FTOC常规培养,12d后分别收集两实验组的胸腺细胞,流式细胞仪检测细胞表面分子CD4、CD8、CD11c、Ia等的表达,通过光学显微镜观察细胞形态。骨髓来源的c-kit+造血干细胞通过悬滴培养方法种植入2-脱氧鸟苷处理过的胸腺,随后将胸腺放置于组织器官培养皿中所使用的培养基为基础培养基或加入细胞因子Flt3L的培养基,进行为期12d的FTOC常规培养。12d后收集不同条件下FTOC培养的胸腺细胞,通过流式细胞仪对胸腺细胞的表型进行分析;将在不同条件下FTOC培养获得的胸腺细胞进行MACS分选,从而获得胸腺树突状细胞(CD11c+DC),再与异源的CD4+T细胞进行混合淋巴细胞反应,通过MTT法检测T细胞的增殖情况。结果:在正常FTOC体系中,流式细胞仪检测结果和细胞形态学结果显示:Flt3L组胸腺DC有明显的增加,且FTOC联合悬滴培养体系中Flt3L组胸腺DC的生成率明显高于对照组;MTT检测结果也显示:没有CpG2006刺激时,胸腺DC刺激T细胞增殖的能力比较弱,但添加CpG2006刺激后,胸腺DC趋向于成熟表型,刺激T细胞增殖的能力有所增强。提示,Flt3L在小鼠胸腺DC的分化发育中发挥重要的调节作用,明显促进小鼠骨髓来源的c-kit+造血干细胞向胸腺DC的分化。     

分泌抗H_(815)单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

制备兔抗正常615小鼠肝癌细胞免疫血清,以此处理615小鼠肝癌细胞用处理过的瘤细胞免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0融合,以间接免疫荧光法和细胞ELISA二种方法检测,建立两株分泌抗615小鼠肝癌细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞系。两杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体与正常615小鼠的肝、脾、肺、肾、脑、心肌、横纹肌、胸腺组织细胞和多     

抗丁型肝炎病毒mAb的制备及其初步应用

目的 :以基因工程表达丁型肝炎病毒抗原蛋白 (HDAg)为抗原 ,建立分泌单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞系 ,并对其分泌的mAb进行鉴定。方法 :用Ni NTA技术纯化HDAg免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞及骨髓瘤细胞按常规方法融合、筛选、克隆化及腹水注射制备mAb。采用ELISA及免疫组化技术进行鉴定。结果 :筛选出 2株能稳定分泌特异性抗 HD的mAb杂交瘤细胞株 (HD1,HD2 ) ,经多次复苏传代仍能稳定分泌抗体 ,特异性强 ,效价高。应用于ELISA测定患者血清HDAg均呈特异性阳性反应。免疫组化检测肝组织显示 ,针对该mAb的抗原主要分布于细胞核或浆内。结论 :此两株丁肝杂交瘤细胞株分泌的抗体对丁肝抗原具有特异亲和性 ,为丁型肝炎病毒的临床诊断及病理检测提供技术基础     

培养基对鼠杂交瘤的影响:杂交瘤活性、细胞增殖和抗体产生最佳条件的确定

由于培养基的选择对杂交瘤的表型有深刻影响,所以检测所使用的培养基是否为杂交瘤的增殖、维持生长以及抗体的产生提供了最佳条件是很有意义的。本文作者选用了三种来自不同亲代骨髓瘤的杂交瘤系对8种培养基进行了实验,初步鉴别出了最佳的培养基配方。 杂交瘤细胞系培养基配方如表1。另添加4.0mML-谷氨酰胺,10~(-4)M次黄嘌呤,10(-5)M胸腺嘧啶核苷,10u/ml青霉素和10μg/ml链霉素以及20％的小牛血清。     

抗人CT抑制物单克隆抗体的制备及应用

作者以CT抑制物免疫的BALB/c小鼠脾细胞,与Sp2/0骨髓瘤细胞在50％PEG(Mr2000)的介导下融合,获得三株分泌抗人CT抑制物McAb的杂交瘤细胞系(A2、F7、G10)。用ELISA测定杂交瘤细胞培养上清及其所诱生的小鼠腹水,特异性抗体效价分别为10~(-2)～10~(-3)及10~(-4)～10~(-6)。抗原阻断试验及取代试验结果表明,这些McAb     

酶联免疫斑点方法改进及应用

建立了ELISPOT方法并通过改进 ,应用到抗人CD8杂交瘤细胞及LACA小鼠体外脾细胞分泌IgG量的检测 ,同时观察六味地黄多糖CA4 3在体外对LACA小鼠脾细胞分泌IgG的影响。结果表明 10 μg/mlLPS作用下可明显提高小鼠脾细胞体外产生抗体的量和提高分泌抗体的细胞数。 5 0 μg/mlCA4 3在体外与LPS具有相似的作用 ,可以刺激小鼠脾细胞分泌IgG的量和分泌抗体的细胞数量增多。     

半固体培养基法制备单抗的可行性研究

目的建立稳定的甲基纤维素半固体培养基一步法筛选和克隆化杂交瘤细胞的方法。方法常规细胞融合后,用甲基纤维素半固体培养基重悬细胞沉淀,通过优化甲基纤维素半固体培养基中甲基纤维素、血清及L-谷氨酰胺三种成分的浓度,建立稳定高效的杂交瘤细胞克隆化方法。并进行有限稀释法和甲基纤维素半固体培养基法筛选杂交瘤细胞的对照实验。阳性克隆扩大培养,ELISA检测后冻存,再次复苏后ELISA检测呈阳性为稳定杂交瘤细胞株。结果甲基纤维素三种浓度中,甲基纤维素浓度1．0％和1．2％时获得的杂交瘤细胞团个数约为甲基纤维素浓度1．25％时的2倍。而甲基纤维素浓度1．2％时细胞团固定效果较甲基纤维素浓度1．0％更好。通过对梯度稀释的SP 2／0细胞培养后,选择半固体培养基中使用的胎牛血清浓度（25％）,在半固体培养基中含4mmol／L L-谷氨酰胺比含2mmol／L L-谷氨酰胺得到多近一倍的杂交瘤。得到的5株阳性杂交瘤在扩大培养、冻存复苏后抗体分泌稳定,得到5株稳定阳性杂交瘤细胞株。有限稀释法和甲基纤维素半固体培养基法筛选杂交瘤细胞对照实验显示半固体培养基法可节省一半时间。结论建立了稳定的甲基纤维素半固体培养基一步法筛选和克隆化杂交瘤细胞的方法。该法缩短了克隆化的时间,节省了人力和材料．不需要添加饲养细胞和细胞因子,是一种稳定高效的杂交瘤细胞克隆化方法。     

昆明小鼠胰腺导管上皮样细胞向胰岛样细胞的诱导分化

目的研究正常昆明小鼠胰腺导管上皮样细胞向胰岛样细胞分化的诱导条件。方法取正常成年昆明小鼠胰腺导管上皮进行原代培养,利用细胞贴壁时间的差异在培养24、48、72 h连续换液除去腺体细胞,在含2%胎牛血清的培养条件下除去成纤维细胞,使可以在无血清培养基中生长的胰腺导管上皮样细胞形成优势生长。在此条件下培养并传代。取第三代细胞以无血清诱导培养基促使其分化。取诱导后3、5、7、14 d的细胞进行免疫细胞化学染色鉴定。ELISA检测诱导生成的胰岛样细胞在高糖刺激下分泌胰岛素的功能。结果经过无血清诱导培养基诱导7 d后,胰腺导管上皮样细胞开始向胰岛素分泌细胞分化,胰岛素抗体染色阳性。14 d胰岛素抗体染色阳性细胞明显增多。该细胞在高糖刺激下可以分泌胰岛素。结论昆明小鼠胰腺导管上皮样细胞经过无血清培养基诱导可以向胰岛样细胞方向分化。并且该胰岛样细胞在高糖刺激下具有分泌胰岛素的功能。     

抗HIV-1核心抗原p24单克隆抗体的制备及特性的初步鉴定

目的 :建立分泌抗HIV 1p2 4单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞株 ,并对其特性进行初步鉴定。方法 :以纯化的基因工程制备的p2 4抗原免疫BALB/c小鼠 ,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 /0骨髓瘤细胞融合 ,经HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后 ,用间接ELISA法及Dotblot对其进行筛选和特性鉴定。结果 :筛选到 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,其腹水效价为 1×10 -5,亲和力为 1.7× 10 4～ 1.8×10 4mol/L ,mAb的Ig亚类均为IgG1。两株mAb与HBcAg、HCVRNA阳性血清及HIVgp4 1等均无交叉反应 ,只与HIV 1p2 4抗原阳性血清产生特异反应。结论 :成功地建立了 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,为进一步研制HIV 1p2 4抗原的ELISA检测试剂盒奠定了基础     

抗人淋巴细胞T8抗原样McAb的研制和初步鉴定

用杂交瘤技术,将经人外周血E花环阳性细胞免疫小鼠脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合后,产生一分泌IgG_1亚型McAb杂交瘤株。其所分泌抗体经微量放射免疫测定及间接免疫荧光法分析,表明它只能与T细胞系、76％的胸腺细胞及22％的外周血T淋巴细胞反应,不与其它各种不同细胞反应。将此抗体所识别入外周血T淋巴细胞亚群与抗Leu-2a识别T8~+细胞、抗Leu-3a识别T4~+细胞比较,发现此抗体与抗Leu-2a识别同一群细胞。此抗体能从T细胞表面沉淀出30KD(还原条件)或78KD(非还原条件)分子,并完全阻断FITC标记抗Leu-2a与T细胞的结合,说明此抗体是识别T8抗原样的McAb。     

用一种单克隆抗体快速简易地检出细胞培养中的支原体(文摘)

检测支原体污染是细胞培养中有待解决的一个问题。作者应用常见几种污染细胞培养的支原体(口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体,莱氏无胆甾原体及唾液支原体,几种支原体占污染细胞培养支原体的96％)。为抗原,免疫了雌性BALB/c小鼠。将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Xg3Ag 865融合成杂交瘤细胞,建立了30种抗支原体单克隆抗体杂交瘤细胞等。应用ELISA,     

经福氏不完全佐剂诱发的小鼠单克隆抗体腹水产量增加

制备单克隆抗体的传统方法是在小鼠腹腔内种植分泌抗体的杂交瘤细胞后诱发小鼠产生单克隆抗体腹水。为了提高小鼠腹水的产量,本文作者探讨了用福氏不完全佐剂(FIA)诱导小鼠及小鼠性别对小鼠腹水产生和单克隆抗体产量的影响。在BALB/c小鼠腹腔内注射0.1ml降植烷或FIA间隔7d后再接种10~6杂交瘤细胞V2.6E4。小鼠腹部呈高度     

分泌抗绵羊红细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞的建立

自1975年Kohler和Milstein建立了杂交瘤技术以来,免疫学已进入了一个新的时代。通过杂交瘤技术产生的单克隆抗体具有专一、均匀和大量的优点。其应用范围几乎已深入到生物学的各个领域。我组采用绵羊红细胞(SRBC)作抗原免疫小鼠,取其脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,得到了分泌抗SRBC单克隆抗体的杂交瘤细胞,方法和结果报道如下。     

传统的ELISA方法不宜于用来筛选杂交瘤培养上清液中的小鼠单克隆抗体

最常用来筛选分泌特异性McAb杂交瘤的方法是将抗原固定在塑料板表面,加入杂交瘤培养上清与之反应,而后用标记同位素或标记酶(ELISA)的抗小鼠Ig来检测与固相抗原结合的McAbs.作者用此种ELISA方法筛选,制备了抗人肌酸激酶(CK)和抗人乳酸脱氢酶(LDH)的McAbs.当用液相RIA(~(125)I标记抗原与待测McAbs共育,用偶联有羊