UPLC-QTOF/MS分析芫花诱导人肝细胞L02损伤的毒性物质基础

目的: 研究芫花提取物诱导人肝细胞L02损伤的毒性物质基础。 方法: 选取人肝细胞L02作为体外实验模型,运用MTT法测定芫花提取物对细胞增殖的影响,并且采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF/MS)对芫花提取物及与L02细胞亲和后胞内化学成分进行定性分析。 结果: 芫花提取物对L02细胞的生长抑制呈明显的剂量依赖关系,48 h的IC₅₀为(48.34±4.66)mg·L^-1。通过UPLC-QTOF/MS鉴定的黄酮类成分主要有:芹菜素、3'-羟基芫花素、芫花素、5,4'-二羟基-7,3'-二甲氧基黄酮;二萜原酸酯类成分主要有:芫花酯戊、genkwanine L、芫花酯丙、芫花烯、芫花酯丁、芫花酯庚、芫花酯乙、芫花酯己、芫花酯甲。在芫花提取物亲和的L02细胞中鉴定出3'-羟基芫花素、芫花素、5,4'-二羟基-7,3'-二甲氧基黄酮、芫花酯戊、芫花烯、芫花酯丁、芫花酯乙、芫花酯甲。其中二萜原酸酯类成分芫花酯甲作用L02细胞48 h的IC₅₀为(29.57±2.01) mg·L^-1,黄酮类成分芫花素(0.1～100 mg·L^-1)未发现对L02有显著的细胞毒作用。 结论: 芫花提取物对人肝细胞L02具有细胞毒作用,其中二萜原酸酯类成分与细胞有明显的亲和作用,并具显著的细胞毒作用,是芫花提取物中主要的活性物质。     

芫花药材中芫花酯甲和芫花酯乙UPLC-MS含量测定方法

目的：对芫花药材中含量较低的毒效成分芫花酯甲和芫花酯乙建立相关含量测定方法,为芫花的临床使用安全性及进一步研究提供参考。方法：采用UPLC MS,选择离子扫描法建立相关检测方法。结果：建立了芫花药材中芫花酯甲和芫花酯乙含量测定方法,得到芫花酯甲的线性回归方程为Y=1048X 1 234,r=0998,芫花酯乙的线性回归方程为Y=1092X 1 997,r=0995。结论：所建立的芫花药材UPLC MS含量测定方法灵敏性高,操作简便,耐用性好,测定结果可靠,能较好地测定芫花药材中微量二萜类成分。     

芫花化学成分研究

目的:研究芫花的化学成分.方法:对芫花乙醇提取物的石油醚部位和乙酸乙酯部位进行色谱分离,根据光谱数据和理化性质确定各化合物的结构.结果:从芫花中分离得到10个化合物,分别鉴定为二十八碳烷(1)、三十二碳烷(2)、β-谷甾醇(3)、4′,7-二甲氧基-5-羟基黄酮(4)、金色酰胺醇酯 (5)、芫花素(6)、木樨草素(7)、芹菜素(8)、羟基芫花素(9)及Daphnoretin(10).结论:化合物1和2均为首次从该植物分离得到.     

芫花酯甲的快速TLC纯化技术与鉴定

目的:制备高纯度、低成本的芫花酯甲对照品.方法:采用硅胶柱-制备TLC制备芫花酯甲单体,通过HPLC分析纯度,NMR确定结构.结果:硅胶柱-制备TLC比制备液相成本低,未发现可见杂质斑点,所得单体纯度较好.结论:该方法解决了本品在分离纯化方面高消耗低产出的难题,为芫花萜类化合物的研究与开发提供参考.     

芫花酯甲模拟醋制品的HPLC分析

采用LPLC法分析了芫花酯甲模似醋制及其水解前后的变化。结果表明:芫花酯甲模拟醋制后其含量降低近22%。而且产生了一个芫花酯甲的水解物,该化合物紫外最大吸收λ_max264nm。其结构尚待进一步鉴定。     

蝉翼藤根中木质素苷及蔗糖酯成分研究

运用硅胶、MPLC和制备HPLC等柱色谱方法对蝉翼藤根的化学成分进行分离,并通过理化性质和MS、NMR波谱数据进行结构鉴定。从蝉翼藤根的95%乙醇提取物中分离鉴定了9个化合物,包括5个木质素苷acernikol-4″-O-β-D-glucopyranoside(1),(7R,8S)-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 9-O-β-D-glucopyranoside(2),(7R,8S)-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside(3),(7R,8S)-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 9'-O-β-D-glucopyranoside(4),(7R,8S)-5-methoxydihydrodehy drodiconiferyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside(5);3个蔗糖酯3,6'-O-diferuloylsucrose(6),3-O-feruloyl-6'-Osinapoylsucrose(7),sibricose A5(8);1个有机酸酯mehyl ferulate(9)。化合物1~5,8,9为首次从蝉翼藤属中分离得到。采用MTT法测定了化合物对肺癌细胞株A549、宫颈癌细胞株Hela和乳腺癌细胞株MCF-7的细胞毒活性。结果表明化合物2,3和7对所测试的人源肿瘤细胞具有较弱的抑制活性。     

芫花根质量标准研究

目的建立芫花根中芫花酯甲的定性鉴别和定量分析方法。方法采用薄层色谱法对芫花根中芜花酯甲进行定性鉴别,采用高效液相色谱法测定芫花酯甲的含量。色谱条件：KromasilC18色谱柱（4．6mm×250mm,5μm）;流动相为甲醇-水（85：15）,流速1．0mL／min;柱温40℃;检测波长为238nm;记录时间40min。结果芫花根中芫花酯甲的薄层色谱鉴别特征明显、专属性强;含量测定线性范围为0．047-0．282btg（r=0．9996）;平均回收率为99．2％,RSD=2．00％（n=6）。结论该方法操作简便,结果准确,能够对芜花根中的芜花酯甲进行定性鉴别和定量分析,提高了该药材的质量控制水平。     

芫花化学成分研究

目的 研究芫花Daphne genkwa的化学成分.方法 使用色谱技术对芫花醇提物进行分离和纯化,根据理化常数和波谱数据对化合物的结构进行鉴定.结果 共鉴定出10个化合物,分别为芫花素(genkwanin,1)、3'-羟基芫花素(3'-hydroxygenkwanin,2)、芹菜素(apigenin,3)、山柰酚-3-O-β-D-(6"-P-香豆酰)-吡喃葡萄糖苷[kaempferol-3-O-β-D-(6"-P-coumaroyl)-glucopyranoside,4]、芫根苷(yuenkanin,5)、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(kaempferol-3-O-β-D-glucoside,6)、木犀草素-7-甲氧基-3,-O-β-D葡萄糖苷(luteolin-7-O-methylether-3' -O-β-D-glu-eoside,7)、芫花素-5-O-β-D-葡萄糖苷(genkwanin-5-O-β-D-glucoside,8)、β-谷甾醇(β-sitosterol,9)、胡萝卜苷(daucosterol,10).结论 化合物6～8为首次从该植物中分得.     

南海海洋真菌Penicillium sp. FS60的次级代谢产物研究

目的:研究南海海洋真菌Penicillium sp.FS60的次级代谢产物及其细胞毒活性。方法:采用正相硅胶柱、反相硅胶柱、凝胶柱、HPLC和薄层制备等色谱技术和重结晶对菌株FS60的发酵产物进行分离纯化,并通过波谱分析进行结构鉴定;以神经胶质瘤细胞SF-268、乳腺癌细胞MCF-7、大细胞肺癌细胞NCI-H460为供试细胞株,采用SRB法测试化合物的细胞毒活性,以金黄色葡萄球菌(SA)、大肠杆菌(EC)和铜绿假单胞菌(PA)为指示菌株,采用改良的MMT法测试化合物的抗菌活性。结果:从发酵物中分离并鉴定了7个化合物,分别为:2,4-二羟基-3,5,6三甲基苯甲酸甲酯(1)、对羟基苯乙酮(2)、5-羟甲基糠酸(3)、isochromophilone VIII(4)、麦角甾醇(5)、过氧化麦角甾醇(6)、啤酒甾醇(7)。结论:化合物1为首次从青霉属真菌中分离得到,化合物3具有较强的抗菌活性,化合物4具有显著的胞毒活性。     

紫玉盘内生真菌节菱孢中1个新的异香豆素类化合物

目的研究紫玉盘内生真菌节菱孢Arthrinium sp.A092发酵菌丝体的化学成分。方法采用硅胶柱、凝胶柱、HPLC等色谱技术进行分离纯化,根据理化性质和波谱数据进行化合物结构鉴定;以肝癌细胞Hep G-2、乳腺癌细胞MCF-7、大细胞肺癌细胞NCI-H460和神经胶质瘤细胞SF-268为供试细胞株,采用SRB法对化合物进行细胞毒活性测试。结果从节菱孢菌丝体中分离得到10个化合物,分别鉴定为3,4,5-trimethyl-6-methoxy-8-hydroxyisocoumarin(1)、decarboxycitrinone(2)、4-hydroxy-17R-methylincisterol(3)、3-甲氧基-4-羟基苯甲酸(4)、邻苯二甲酸二丁酯(5)、flemingipanic acid(6)、吲哚-3-羧酸(7)、过氧化麦角甾醇(8)、对羟基苯甲酸(9)、4-羟基苯甲醛(10);化合物3对SF-268和MCF-7的IC50值分别为63.8和57.2?mol/L,化合物8对SF-268、MCF-7和NCI-H460的IC50值分别为50.6、32.3、39.0?mol/L。结论化合物1为新化合物,命名为节菱孢异香豆素A,化合物3~5、7~10均为首次从该属真菌中分离得到;化合物3和8具有一定的细胞毒活性。     

椪柑柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶基因的克隆、分析及表达

目的克隆中药橘核主要来源品种椪柑Citrus reticulata的柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶(limonoid-UDP-glucosyl transferase gene,LGT)基因,并进行生物信息学及表达分析为橘核有效成分合成及调控机制研究提供基础。方法克隆获得LGT序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建LGT与相关物种LGT的系统进化树,利用RT-PCR分析橘皮、橘肉以及橘核中LGT基因表达量,并进行分析和比较。结果测序所得椪柑LGT序列全长为1 530 bp,具有1 509 bp的完整开放阅读框,编码502个氨基酸。并对其蛋白二级、三级结构进行了分析和预测。基因表达分析结果发现椪柑LGT基因在橘核中表达量最低,其次为橘皮,表达量最高为橘肉。结论成功克隆、分析并表达了椪柑LGT基因,为橘核中柠檬苦素类物质合成及调控机制研究提供基础。     

千金子制霜前后提取物对大鼠肠道菌群的影响

目的研究千金子制霜前后提取物对正常大鼠肠道菌群的影响,为进一步阐明千金子制霜减毒机制提供参考。方法大鼠ig高、中、低剂量的千金子生品和霜品提取物,采用平板菌落计数法考察千金子制霜前后大鼠粪便中4类代表性肠道菌群双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌的数量变化。结果平板菌落计数实验结果表明,ig千金子生品与霜品提取物后大鼠出现菌群失调现象,且千金子霜品较生品引起的菌群紊乱程度低,在低剂量给药时可使条件致病菌肠球菌和大肠杆菌的数量减少。结论千金子制霜前后提取物均会影响肠道菌群的生物多样性,影响肠道菌群平衡,且千金子制霜后对4类肠道菌群的作用减弱,引起肠道菌群紊乱程度减小,这与千金子霜品泻下作用缓和的研究结果相一致,表明从肠道微生态角度考察千金子制霜前后对肠道菌群的干预作用,可揭示制霜与肠道菌群数量变化可能存在相关性。     

不同比例甘草配伍祖师麻抗大鼠佐剂性关节炎的实验研究

目的 观察不同比例甘草配伍祖师麻对大鼠佐剂性关节炎（AA）模型的治疗作用,筛选两者配伍比例,探讨其配伍意义。方法 采用足跖皮内注射弗氏完全佐剂制备AA模型,将140只模型大鼠随机分成14组：模型组,雷公藤多苷片组,祖师麻低、中、高剂量组,甘草低、中、高剂量组,祖师麻-甘草（3：1）低、中、高剂量组,祖师麻-甘草（3：2）低、中、高剂量组,另取10只正常大鼠为对照组,给药组大鼠造模前2 d开始ig给药,连续给药31 d,观察各组大鼠体质量变化,计算足肿胀度、关节炎指数（AI）,采用ELISA法检测大鼠血清炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的水平,观察大鼠膝关节组织病理变化,通过免疫组化法测定大鼠膝关节滑膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）、巨噬细胞游走抑制因子（MIF）的表达。结果 与模型组比较,祖师麻组、祖师麻甘草配伍组能够明显抑制AA大鼠体质量减轻的趋势,对抗AA大鼠足肿胀度及AI的增加,降低异常升高的血清TNF-α、IL-1β水平,改善关节病理组织变化,减少滑膜组织VEGF、MIF的表达,其中以祖师麻-甘草（3：2）配伍组效果最优。结论 祖师麻甘草配伍后,对AA大鼠各项指标改善作用显著,作用优于单用祖师麻,其最佳配伍比例为祖师麻-甘草（3：2）。调节血清炎症细胞因子TNF-α、IL-1β及滑膜组织VEGF、MIF的表达,可能是祖师麻甘草配伍治疗类风湿性关节炎机制之一。     

胡黄连2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸胞苷转移酶基因的生物信息学分析

目的研究胡黄连Picrorhiza kurrooa 2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸胞苷转移酶(MCT)基因特征并预测MCT结构与功能位点。方法以胡黄连MCT基因为研究对象,利用NCBI网站及生物信息学软件对其碱基分布、氨基酸组成、亲疏水性、保守区及二级结构和三级结构进行预测和分析;并对9个物种的MCT基因进行多重比对与进化分析。结果胡黄连MCT基因的mRNA序列长为1 216 bp(GenBank JQ991625.1),编码由399个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白质相对分子质量为44 448.5,其中量最高的为Ser(10.0%);整个多肽中疏水性氨基酸占59.5%,平均疏水值为0.050;与丹参Salvia miltiorrhiza MCT氨基酸序列对比同源性最高,达99%。结论胡黄连MCT基因处于稳定状态,编码的蛋白为疏水性蛋白,在进化过程中是相对保守的,获得的保守区段序列信息为其他物种MCT基因的克隆奠定了基础。     

动态观测艾片、天然冰片、合成冰片、苏合香、安息香5种开窍药对脂多糖致发热大鼠生理指标的影响

目的基于中医整体观、动态观,平行比较艾片、天然冰片、合成冰片、苏合香、安息香5种开窍药调节脂多糖(LPS)致发热模型大鼠生理指标的作用节点及强度。方法采用Data Science International(DSI)植入式生理信号遥测技术,动态观测开窍药对模型大鼠体温(T)、心率(HR)、血压(SBP、DBP)、活动度(A)等生理参数的影响,用SPSS 17.0、SAS 9.2、Origin Pro 8.5处理数据及作图。结果 3种冰片(艾片、天然冰片、合成冰片)对模型大鼠的T、HR有抑制作用,艾片最优;苏合香对模型大鼠HR、SBP、DBP、A等总体呈现先兴奋后抑制趋势;安息香对各项指标无显著影响。主成分分析结果显示天然冰片、苏合香对模型大鼠作用有一致倾向性;合成冰片能同时对A、SBP、DBP产生较大影响。聚类分析和对应分析均表明3种冰片的作用特点可归为一类;苏合香、安息香具有各自作用规律。结论 3种冰片对各生理指标有抑制作用;苏合香整体呈现出先兴奋后抑制趋势,可能与其性温的时间窗有关;安息香对发热模型无显著影响,可能与其平性相关;今后可从开窍药对该模型大鼠作用机制展开研究。     

朱砂根化学成分和药理作用的研究进展

朱砂根Ardisiae Crenatae Radix是一种民间常见的观赏性中药材,具有解毒消肿、活血止痛、祛风除湿的功效,是贵州特色民族药八爪金龙的3大来源之一。朱砂根主要含有香豆素类、皂苷类、黄酮类、挥发油等多种化学成分,具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、保肝、抗生育等药理作用。主要综述了朱砂根化学成分和药理作用的研究进展,旨在为朱砂根的进一步开发和应用提供参考。     

基于毛蕊花糖苷含量分析陈皮和砂仁在熟地黄炮制中的影响性研究

[目的] 针对熟地黄的药性特点，深入研究熟地黄炮制过程中，陈皮与砂仁对其炮制过程中毛蕊花糖苷含量的影响，并建立超高压液相色谱-串联质谱（UPLC-MS）法检测熟地黄中毛蕊花糖苷含量的方法，并根据其含量变化，验证其炮制方法的科学性与合理性，为丰富熟地黄的炮制品种并建立其质量控制标准提供参考。[方法] 参考熟地黄在全国各省市《中药炮制规范》中的炮制方法，采用其中具有临床实用特色的方法，即：陈皮制熟地黄、砂仁制熟地黄（酒蒸法和拌制法），并以2015版《中华人民共和国药典》中熟地黄的质量标准为参照指标，采用UPLC-MS检测技术对其炮制过程中毛蕊花糖苷的含量变化进行研究，并结合性状评分，进行综合评价及统计学分析。[结果] 检测的线性范围为（1~1 000 ng/mL，r=1），其精密度、重复性、稳定性、准确度均较好（RSD<3%）。本实验中炮制后的熟地黄其毛蕊花糖苷的含量均超过药典标准，在炮制过程中当性状达到药典及传统标准时，其毛蕊花糖苷的含量能保持在较高水平，以陈皮制熟地黄后的毛蕊花糖苷含量最高，炮制过程中含量变化最显著。[结论] 陈皮制熟地黄可明显稳定和控制毛蕊花糖苷在熟地黄炮制过程中的下降趋势。这对通过相应的炮制方法，在有效保存熟地黄指标性成分的同时，扩大熟地黄临床使用范围有积极意义。同时UPLC-MS法由于操作简便、速度快、准确度高，可用于熟地黄炮制过程中毛蕊花糖苷含量的检测。     

酸碱药对甘草-马钱子配伍汤液沉积相态释放特性研究

目的 探讨甘草-马钱子配伍汤液沉积相态的释放行为,为甘草-马钱子配伍减毒提供科学参考。方法 建立沉积相态释放测定HPLC法,通过体外释放实验,追踪沉积相态在蒸馏水、人工胃液、人工肠液等不同介质中主成分的释放行为,并对其释放结果进行拟合研究分析。结果 甘草酸、马钱子碱以及士的宁在人工肠液中的释放量较大,且马钱子碱>甘草酸>士的宁。马钱子碱和甘草酸均与一级动力学模型拟合结果最佳,士的宁与Higuchi模型拟合结果最佳。结论 甘草-马钱子沉积相态主要毒效成分呈现出难溶性骨架材料缓释制剂的释放特性,毒(效)成分士的宁可能以沉积共聚体形式存在,在体释放呈缓释行为而减毒;同时,甘草酸的释放对减毒增效起到协同作用。     

夏天无HPLC指纹图谱及多指标含量测定研究

目的建立夏天无HPLC指纹图谱及多指标成分测定方法,为夏天无药材质量标准提升提供科学依据。方法采用HPLC法,Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱;以乙腈-0.2%冰醋酸溶液(三乙胺调pH 6.0)为流动相,梯度洗脱;体积流量1.0 mL/min;柱温35℃;进样量10μL;检测波长280 nm;建立15批夏天无药材的指纹图谱,用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012A版)进行评价,聚类分析和主成分分析将15批药材分为2类,同时测定原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱和延胡索乙素4种成分的含量。结果建立了夏天无药材的HPLC指纹图谱,共标定了10个共有峰;原阿片碱、黄藤素、荷包牡丹碱和延胡索乙素线性关系良好,r均大于0.999 9,平均回收率分别为97.12%、100.09%、98.53%、99.71%。结论 HPLC指纹图谱结合多指标成分测定可为夏天无药材质量评价提供参考。     

内生真菌链格孢菌醋酸乙酯提取物对大肠杆菌抑菌机制的研究

目的研究分离自药用植物白毛蛇Humata tyermanni的内生真菌链格孢菌发酵产物醋酸乙酯提取物(B06e)对大肠杆菌的抑菌机制。方法采用倍比稀释法测定了B06e对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC);测定了B06e作用前后大肠杆菌培养液电导率、核酸和蛋白质的变化;结合流式细胞仪、扫描电子显微镜、凝胶阻滞实验、圆二色谱和荧光实时定量PCR的分析方法研究了B06e对大肠杆菌细胞膜结构、形态、DNA的影响。结果 B06e对大肠杆菌的MIC为25μg/m L,3×MIC处理组的电导率是对照组的1.01倍;3×MIC处理组的β-半乳糖苷酶活性是对照组的11.6倍;流式细胞仪分析表明3×MIC处理组被碘化丙啶(PI)染色的阳性细胞比是对照组的286.5倍;扫描电子显微镜结果显示,B06e处理后菌体表面变得粗糙,细胞膜大量塌陷;以上结果说明B06e能增大细胞膜的通透性,破坏细胞膜的完整性。凝胶阻滞、圆二色谱的结果表明,B06e能够以嵌插的方式与DNA结合,但不能降解DNA;实时定量PCR结果表明,经B06e处理后rec A和rec N基因的表达量分别是对照组的2.9和3.7倍,说明B06e能破坏DNA的结构,迫使大肠杆菌启动了SOS修复。结论 B06e通过破坏大肠杆菌细胞膜完整性和DNA的结构,使得细菌代谢紊乱,最终导致细菌丧失了生长繁殖的能力。