靶向hTERT的siRNA对卵巢癌SKOV3细胞增殖及化疗敏感性的影响

目的:探讨RNA干扰沉默人端粒酶反转录酶(hTERT)的表达后对卵巢癌SKOV3细胞增殖及化疗药物敏感性的影响。方法:化学合成hTERT siRNA及Control siRNA,用EntransterTM-R转染试剂将hTERT siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞。采用Real time-PCR法及Western blot法检测SKOV3细胞中hTERT mRNA及对应蛋白的表达;流式细胞术(FCS)检测细胞凋亡率;并分别用顺铂、阿霉素作用于SKOV3细胞,WST-1法检测细胞存活率及两种化疗药物的IC50。结果:与对照组相比,转染hTERT siRNA后,hTERT mRNA及蛋白表达量明显降低(P<0.05),细胞凋亡率明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05),同时该组细胞的顺铂、阿霉素IC50显著下降。结论:hTERT siRNA不仅可以显著抑制卵巢癌SKOV3细胞中hTERT基因的表达,同时提高细胞对化疗药物的敏感性。     

靶向MICA基因对胃癌SGC-7901细胞增殖的抑制作用

目的探讨通过小干扰RNA(siRNA)抑制MICA基因表达对胃癌SGC-7901细胞生长的抑制作用。方法将靶向MICA的siRNA(MICA siRNA)通过脂质体转染法瞬时转染胃癌SGC-7901细胞48 h;Western blot检测siRNA转染前后SCG-7901细胞内MICA蛋白表达的变化;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测MICA siRNA转染对细胞增殖的影响,TUNEL检测siRNA转染对细胞凋亡的影响。结果 MICA siRNA转染干扰SCG-7901细胞内MICA表达,并诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖。细胞转染后,MICA蛋白表达降低70%~85%,明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);转染组细胞存活率明显低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);转染组细胞凋亡率明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论靶向MICA抑制胃癌SGC-7901细胞增殖并促进细胞凋亡,MICA可用于胃癌基因治疗的靶点。     

TPX2基因调控p38MAPK信号通路抑制乳腺癌细胞增殖及促进凋亡的机制研究

目的探讨Xklp2靶蛋白(TPX2)基因调控p38MAPK信号通路抑制乳腺癌细胞增殖及促进凋亡的影响及机制。方法 Western blot检测乳腺癌组织及癌旁组织中TPX2基因的表达;siRNA-NC、TPX2-siRNA1和TPX2-siRNA2转染人乳腺癌MCF-7细胞,未转染任何siRNA作为对照组,Western blot检测转染后各组细胞中TPX2蛋白表达;siRNA-NC、TPX2-siRNA转染细胞48 h后,CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测Cleaved caspase3、p38、p-p38蛋白表达。结果 TPX2在乳腺癌组织的蛋白表达显著高于癌旁组织(P<0.01);TPX2-siRNA1组和TPX2-siRNA2组细胞中TPX2蛋白表达显著低于对照组(P<0.01),TPX2-siRNA2组的抑制效果更明显,选择作为后续研究;siRNA-NC组的细胞存活率、细胞凋亡率及Cleaved caspase3、p-p38蛋白表达与对照组差异无统计学意义(P>0.05),TPX2-siRNA组细胞存活率及p-p38蛋白表达显著低于对照组,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著高于对照组(P<0.01),p38蛋白表达在三个组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TPX2基因在乳腺癌组织中高表达,抑制TPX2的表达可降低细胞增殖及促进细胞凋亡,其机制与p38MAPK信号通路有关。     

miR-378对卵巢癌细胞增殖能力的影响

目的探究微小RNA378(miR-378)与c-Myc表达的关系及其与卵巢癌细胞增殖能力的影响。方法培养对数生长期人卵巢癌细胞系SKOV3,慢病毒转染法外源性上调SKOV3细胞中miR-378的表达作为实验组,同时转染空白载体作为对照组,Taqman实时荧光定量PCR(RT-q PCR)技术检测两组细胞miR-378及c-Myc mRNA表达水平,免疫印迹实验(Western Bolt)检测两组细胞c-Myc蛋白表达水平,CCK-8实验检测两组细胞增殖能力的情况,克隆形成实验检测两组细胞克隆形成能力的情况。结果实验组miR-378的表达水平显著高于对照组细胞(P0.001);实验组c-Myc mRNA表达水平显著低于对照组细胞(P0.05);实验组c-Myc蛋白表达水平同样显著低于对照组细胞(P0.05);实验组细胞增殖能力在48及72h时显著低于对照组细胞(P0.05);实验组细胞克隆形成能力显著低于对照组细胞(P0.01)。结论 miR-378可能通过抑制原癌基因c-Myc的表达,介导卵巢癌细胞增殖能力的下调。     

卵巢癌细胞中膜联蛋白A_2的表达及功能

目的:探讨膜联蛋白A2(ANXA2)在卵巢癌细胞中的表达及其功能。方法:常规培养卵巢癌细胞株SKOV3,取正常卵巢细胞为正常对照组,RT-PCR法检测不同细胞中ANXA2的表达,并采用MTT法检测两种细胞的存活率。结果:SK-OV3细胞株内ANXA2mRNA含量(89.13±3.66)%明显高于正常卵巢细胞(10.09±1.41)%(P<0.05),转染siRNA后,SK-OV3细胞株内ANXA2mRNA较转染前明显降低(21.13±2.54)%(P<0.05)。转染阴性siRNA SKOV3细胞株内的ANXA2mR-NA(88.21±3.54)%与未转染siRNA SKOV3细胞株内的ANXA2mRNA水平相当(P>0.05)。SKOV3细胞株存活率(70.71±5.34)%较正常卵巢细胞(55.35±4.71)%明显增高,转染siRNA后SKOV3细胞株存活率下降到(52.19±4.97)%与正常卵巢细胞的存活率相似(P>0.05),正常卵巢细胞转染siRNA后其存活率(49.93±5.67)%无明显改变(P>0.05)。结论:ANXA2的高表达参与卵巢癌的发生发展。     

LINC 01118通过调控vimentin蛋白影响卵巢癌细胞紫杉醇耐药

目的探讨LINC 01118对人卵巢癌细胞紫杉醇耐药的影响,并研究其调控机制。方法利用RT-qPCR测定两组卵巢癌紫杉醇耐药细胞系及亲本细胞系中LINC 01118的表达水平;利用Lipofectamine TM2000将siRNA-LINC 01118、siRNA-LINC 01118+GV 230-vim以及相关对照转染至卵巢癌紫杉醇耐药细胞SKOV 3-TR 30中,RT-qPCR验证siRNA对LINC 01118的靶向沉默效率;利用MTT法测定转染后SKOV 3-TR 30细胞对紫杉醇的敏感性;利用流式细胞仪测定转染后SKOV 3-TR 30细胞的凋亡率;利用免疫印迹实验(Western blot)测定转染后vimentin蛋白,耐药蛋白MRP 1、MDR 1及ABCG 2的表达水平。结果RT-q PCR实验结果显示,LINC 01118在卵巢癌紫杉醇耐药细胞中的表达水平显著高于其亲本细胞(P<0.05);转染siRNA-LINC 01118可明显抑制SKOV 3-TR 30细胞中LINC 01118的表达(P<0.05);MTT实验结果显示,抑制LINC 01118的表达显著增加了SKOV 3-TR 30细胞对紫杉醇的敏感性(P<0.05),过表达vimentin能逆转抑制LINC 01118表达时卵巢癌耐药细胞对紫杉醇的敏感性增加现象(P<0.05);流式细胞术结果显示,抑制LINC 01118表达显著增加了SKOV 3-TR 30细胞的凋亡率(P<0.05);Western-blot实验结果显示,抑制LINC 01118表达后,vimentin蛋白的表达水平明显降低(P<0.05),耐药蛋白MRP 1、MDR 1及ABCG 2的表达均显著减少(P<0.05)。结论LINC 01118在卵巢癌紫杉醇耐药细胞中异常高表达;抑制LINC 01118表达可以逆转卵巢癌细胞紫杉醇耐药,诱导细胞凋亡;LINC 01118可以通过正向调控vimentin蛋白影响卵巢癌细胞紫杉醇耐药。     

靶向H-ras基因的小干扰RNA对卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用

目的:探讨脂质体介导的靶向H-ras基因的小发夹状RNA重组质粒对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞增殖的抑制作用。方法:实验分4组:正常对照组(仅予脂质体处理)、转染psh RNA/H-ras处理24h组、48h组及72h组。分别于转染后不同时间进行MTT实验、软琼脂克隆形成实验、细胞周期检测和AO/EB双染实验,观察各组细胞增殖、凋亡及细胞周期的变化。结果:FCM显示转染psh RNA/H-ras 24h及48h后的SKOV3细胞均出现细胞周期的抑制,48h后SKOV3细胞有显著的凋亡发生;转染psh RNA/H-ras1和pshRNA/H-ras2对SKOV3细胞克隆形成的抑制率分别为51.5%(P<0.05)和63.3%(P<0.01);MTT检测转染psh RNA/H-ras1和psh RNA/H-ras 272h后对SKOV3细胞增殖抑制率分别为62.5%和64.5%。AO/EB实验显示48h细胞的凋亡率为29.3%(P<0.05)。结论:重组质粒psh RNA/H-ras在人卵巢癌SKOV3细胞中有明显抑制细胞增殖的作用,并介导肿瘤细胞的凋亡。     

雷帕霉素对卵巢癌细胞株生物学特性影响的实验研究

目的 探讨雷帕霉素对卵巢癌细胞株SKOV3增殖凋亡、周期分布的影响及可能的分子机制。方法 体外培养卵巢癌SKOV3细胞,MTT检测雷帕霉素对SKOV3细胞生长抑制率的影响;流式细胞术检测雷帕霉素对细胞凋亡、细胞周期的影响;蛋白印迹法检测雷帕霉素对mTOR通路蛋白PTEN、AKT、p-mTOR、mTOR、S6K及抗凋亡蛋白Bcl-2的影响。结果 雷帕霉素可抑制细胞增殖、阻滞细胞周期,加速细胞凋亡,呈现时间依从性,但作用24h其阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡的能力较低,与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。其他各组与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。同时雷帕霉素可引起细胞的G1阻滞,S期、G2-M期减少。蛋白印迹法显示SKOV3细胞经雷帕霉素处理后导致PETN上调,mTOR、p-mTOR及Bcl-2下调;对AKT的影响,作用24 h表达上调,48 h、72 h后表达下调,S6K表达无变化,各组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 雷帕霉素可抑制卵巢癌细胞株生长增殖,促进细胞凋亡,可能通过阻断mTOR通路、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来发挥抗肿瘤作用。     

RNA干扰NGAL基因表达对乳腺癌细胞增殖凋亡的影响机制研究

目的分析RNA干扰中性粒细胞相关载脂蛋白(NGAL)基因的表达对乳腺癌细胞增殖凋亡的影响及机制。方法利用蛋白质印迹(Western Blot)方法检测乳腺癌组织及人乳腺癌MCF-7、T47D和MDA-MB-231细胞株中NGAL的蛋白表达;小干扰RNA(siRNA)-NC及NGAL-siRNA转染人乳腺癌MCF-7细胞,未转染任何siRNA作为对照组,检测转染48 h后各组细胞中NGAL的蛋白表达情况;利用细胞计数试剂盒(CCK8)方法检测细胞的增殖情况;利用流式细胞仪检测细胞的凋亡;利用Western Blot方法检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、磷脂酰肌醇-3(PI3K)、丝氨酸苏氨酸激酶(AKT)及磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶(p-AKT)的蛋白表达情况。结果乳腺癌组织中NGAL的蛋白表达显著高于癌旁组织(P0.05),NGAL于乳腺癌MCF-7细胞中的蛋白表达最高,选择其作为后续研究;siRNA-NC组NGAL、Cleaved Caspase-3、PI3K及p-AKT蛋白表达和细胞存活率及凋亡率与相应的对照组比较差异无统计学意义(P0.05),而NGAL-siRNA组NGAL、PI3K和p-AKT蛋白表达及细胞存活率均显著低于相应的对照组(P0.05),NGAL-siRNA组的细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白表达均显著高于相应的对照组(P0.05)。结论 NGAL基因在乳腺癌组织及细胞中高表达,抑制NGAL基因的表达会显著降低细胞增殖及促进细胞凋亡,其机制与PI3K/AKT信号通路的调控有关。     

siRNA干扰△Np63基因表达对人宫颈癌Siha细胞增殖及凋亡影响研究

目的 通过抑制宫颈癌细胞株Siha中△Np63的表达,探讨△Np63对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响.方法 将宫颈癌细胞株Siha分为实验组和对照组,实验组转染△Np63的特异性siRNA,对照组转染阴性对照siRNA.实时荧光定量PCR(QRT-PCR)及蛋白质印迹法检测Siha细胞转染前后△Np63基因在mRNA及蛋白水平的变化;CCK8法检测细胞增殖,流式细胞仪测定细胞凋亡率.结果 实验组Siha细胞转染siRNA后,△Np63的mRNA表达为0.32±0.06,低于阴性对照组0.95±0.08(t=10.92,P＜0.05).实验组Siha细胞转染siRNA后,△Np63的蛋白表达为0.32±0.09,低于阴性对照组1.00±0.06(t=9.78,P＜0.05).实验组Siha细胞生长速度明显低于阴性对照组,实验组Siha细胞凋亡率为2.13±0.75,低于阴性对照组14.19±1.36(t=15.36,P＜0.05).结论 人宫颈癌细胞株中存在△Np63的表达,特异性siRNA可下调宫颈癌细胞株Siha中△Np63基因的表达,对细胞的增殖具有负性调节作用,并能诱导细胞凋亡.     

RI基因稳定转染的SKOV3细胞系的建立及其对细胞增殖的作用

目的:建立稳定表达RI基因的卵巢癌SKOV3细胞系,并观察外源基因对细胞体外增殖的作用。方法:以脂质体为介导,将携有RI基因的重组载体pLNCX-ri转染SKOV3细胞,实验分3组,RI基因转染组(SKOV3/RI组)、空质粒转染组(SKOV3/Neo组)和空白对照组(SKOV3组)。采用G-418筛选获得稳定转染的细胞系后,通过RT-PCR技术和免疫细胞化学染色方法鉴定各组细胞中RI基因的表达;通过MTT、细胞周期分析、细胞凋亡检测方法观察该基因对细胞生长的影响。结果:外源性RI基因已整合于细胞基因组中,并获得稳定表达。转染RI基因后的细胞生长速度减慢,明显低于对照组,差异有统计学意义。细胞周期分析显示,实验组G1期细胞增至69.23%,S期细胞降至24.34%,与另外两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。细胞凋亡检测表明SKOV3/RI组细胞凋亡率为58.25%,与SKOV3组(17.97%)及SKOV3/Neo组(21.42%)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:通过脂质体介导,可以建立RI基因稳定表达的卵巢癌细胞系,且RI基因对SKOV3细胞的体外增殖有抑制作用。     

丹参酮ⅡA对人卵巢癌细胞SKOV3增殖与凋亡的影响

目的:探讨丹参酮ⅡA(TanⅡA)对人卵巢癌细胞SKOV3的生长抑制和诱导凋亡作用及其可能机制。方法:培养人卵巢癌细胞SKOV3,经TanⅡA作用后,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定丹参酮ⅡA对人卵巢癌细胞SKOV3的增殖抑制作用;流式细胞术检测细胞周期;RT-PCR检测Survivin与Smac/DIABLO mRNA表达水平;免疫荧光细胞化学检测Survivin蛋白及Smac/DIABLO蛋白的表达。结果:1.0～10.0μg/ml TanⅡA对人卵巢癌细胞SKOV3具有生长抑制作用,并具有时间-剂量依赖性。实验组较对照组G1/G2期细胞数量增多,而S期细胞数量减少(P<0.05)。随着TanⅡA干预浓度的增加和作用时间的延长,Survivin mRNA的表达受到明显抑制(P<0.05),而Smac/DIABLO mRNA的表达明显上调(P<0.05)。Survivin蛋白及Smac/DIABLO蛋白均表达于SKOV3细胞,其表达多定位于细胞质中,偶见于细胞核。结论:TanⅡA对人卵巢癌细胞SKOV3具有生长抑制和诱导凋亡作用,其作用机制可能是通过抑制人卵巢癌细胞SKOV3 Survivin和促进Smac/DIABLO的表达而实现的。     

血管生成素-1对人绒毛膜外滋养细胞基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9表达的调控作用

目的分析血管生成素-1(Ang-1)对人绒毛膜外滋养细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的调控作用。方法将体外培养的人绒毛膜外滋养细胞株HTR8/SVneo分为空白对照组(未转染)、NC-siRNA组(转染阴性对照siRNA)及Ang-1-siRNA组(转染Ang-1 siRNA)。采用实时定量PCR法检测3组细胞中Ang-1 mRNA的表达,采用Western blot法检测Ang-1、MMP-2及MMP-9蛋白的表达,采用Transwell小室法检测细胞侵袭能力。结果转染48 h后,空白对照组Ang-1 mRNA表达水平为(1.36±0.04),NC-siRNA组Ang-1 mRNA表达水平为(0.98±0.07),Ang-1-siRNA组Ang-1 mRNA表达水平为(0.24±0.02),3组比较差异有统计学意义(F=257.128,P<0.001)。空白对照组Ang-1蛋白水平为(0.54±0.03),NC-siRNA组Ang-1蛋白水平为(0.49±0.07),Ang-1-siRNA组Ang-1蛋白水平为(0.12±0.06),3...     

桦褐孔菌水提物通过caspase 3介导细胞凋亡对口腔鳞癌抑制作用的研究

目的 探讨桦褐孔菌水提物对口腔鳞癌SCC - 25细胞的抑制作用及其相关机制。方法 使用水提醇沉方法获得桦褐孔菌水提物,并以不同浓度加至SCC - 25细胞,根据对细胞增殖和凋亡的作用选择合适剂量用于后续实验。将SCC - 25细胞分为空白组、caspase 3抑制剂组、si - NC组和si - caspase 3组,分别加入caspase 3抑制剂或通过脂质体转染法将siRNA转染入细胞。采用CCK8法和集落形成实验检测桦褐孔菌水提物对SCC - 25细胞增殖能力的影响,通过流式细胞术和彗星实验检测细胞凋亡和DNA损伤情况,使用Western blot检测细胞caspase 3、caspase 7、B细胞淋巴瘤/白血病 - 2（B - cell lymphoma / leukemia 2,bcl - 2）蛋白表达情况。实验结果按t检验和one - way ANOVA统计分析。结果 桦褐孔菌水提物呈剂量依赖性提高caspase 3蛋白表达,诱导细胞DNA损伤,促进细胞凋亡并抑制SCC - 25细胞增殖（P＜0.05）。在基因水平沉默caspase 3或使用caspase 3抑制剂能够拮抗桦褐孔菌水对SCC - 25细胞的促凋亡和抑制增殖作用（P＜0.05）。结论 桦褐孔菌水提物通过caspase 3介导SCC - 25细胞DNA损伤和细胞凋亡,抑制口腔鳞癌细胞的增殖。     

Survivin基因沉默对胰腺癌细胞Patu8988增殖及其对吉西他滨敏感性的影响

目的研究Survivin基因沉默对人胰腺癌Patu8988细胞增殖和对化疗药物吉西他滨敏感性的影响。方法设计合成Survivin的siRNA序列,Lipofectamine^TM 2000转染入Patu8988细胞。采用RT．PCR和Western blot检测Survivin在干扰后mRNA和蛋白的表达情况,利用流式细胞仪检测细胞周期。通过MTY法和细胞克隆形成试验法观察Survivin基因沉默后Patu8988细胞对吉西他滨的敏感性。结果Survivin基因沉默48h后,Patu8988细胞的Survivin基因和蛋白表达明显降低,基因表达分别为：对照组：0．78±0．03,空白组：0．82±0．06,实验组：0．52±0．05;蛋白表达分别为：对照组：0．77±0．21,空白组：0．77±0．26,实验组：0．57±0．03,差异有统计学意义（P〈0．05）。细胞周期被阻滞在G0／G1期,S期细胞数减少,其差异有统计学意义（P〈0．05）。Survivin基因沉默组细胞对吉西他滨的敏感性显著性增强。结论Survivin特异性siRNA能显著沉默Patu8988细胞Survivin基因,抑制细胞增殖,并增强Patu8988细胞对吉西他滨的敏感性。     

IEX-1基因转染对人卵巢癌细胞增殖活性及顺铂敏感性的影响

目的:探讨即刻早期反应基因-1(immediate early response gene X-1,IEX-1)转染人卵巢癌细胞SKOV3后,对顺铂药物敏感性的影响。方法:提取并鉴定重组质粒pEGFP-N1-IEX-1,采用脂质体介导将重组质粒转染到人卵巢癌细胞SKOV3,RT-PCR检测转染前后IEX-1mRNA和蛋白的表达情况,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染后卵巢癌细胞SKOV3增殖情况以及对顺铂敏感性的变化。结果:成功转染IEX-1基因后可检测到IEX-1mRNA的高表达;转染组细胞的增殖速度增快(P<0.05),但对顺铂的敏感性明显增强(P<0.05)。结论:IEX-1可增强卵巢癌细胞的体外增殖能力,并增强卵巢癌细胞体外对顺铂化疗的敏感性,为肿瘤的有效干预和治疗提供新的靶点。     

shRNA-聚束蛋白基因对人结肠癌细胞SW-480侵袭和凋亡影响的实验研究

目的探究shRNA-Fascin基因对人结肠癌细胞SW-480侵袭和凋亡影响。方法利用慢病毒转染技术,构建Fascin的shRNA干扰表达载体,RT-qPCR和Western blot等方法检测Fascin基因和凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达。Transwell试剂盒检测人结肠癌细胞的侵袭,以及AV-PI试剂盒检测人结肠癌细胞的凋亡。结果shRNA-Fascin载体慢病毒转染效率为95%以上。实验组SW-480中Caspase-3和Caspase-9的mRNA的相对表达量明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组SW-480中Caspase-3和Caspase-9的蛋白相对表达水平明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组SW-480细胞侵袭能力明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组SW-480细胞的凋亡率明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论shRNA-Fascin可以明显的抑制人结肠癌细胞SW-480的侵袭,促进人结肠癌细胞SW-480的凋亡。