pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒的构建及其活性测定

目的:构建pIRES2-绿色荧光蛋白(EGFP)-骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)真核表达质粒,并检测其表达活性。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人骨肉瘤组织中扩增出人骨形态发生蛋白2(hBMP-2)的基因片段,构建成pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒,经酶切、测序检测其构建的正确性,通过转染3T3细胞后分别采用RT-PCR、免疫组化及Western免疫印迹(Western blotting,WB)法检测其转录、表达活性。结果:构建的pIRES2-EGFP-BMP-2质粒经酶切、测序、RT-PCR、免疫组化、EGFP表达鉴定、WB等检验表明质粒构建成功并具有转录活性。结论:本实验成功构建了具有表达活性的hBMP-2真核表达质粒,为进一步研究用BMP-2基因转染的方法来促进实验动物骨折的愈合奠定了基础。     

BMP2-EGFP融合蛋白的构建及其生物活性

目的：构建BMP2/pLEGFP重组逆转录病毒表达载体,并检测其表达的融合蛋白的生物活性。方法：用基因重组技术构建BMP2/pLEGFP重组逆转录病毒表达载体,并通过酶切和PCR鉴定。脂质体法转染COS-7细胞,用荧光显微镜检测和Western blotting分析其在COS-7细胞表达,细胞活性实验和动物体内异位成骨实验进一步检测融合蛋白的生物活性。结果：经酶切和PCR鉴定重组质粒BMP2/pLEGFP构建成功。转染COS-7细胞后,荧光显微镜和Western blotting检测均显示融合蛋白在细胞中表达;分泌的产物经细胞活性实验和动物体内异位成骨实验证实具有BMP2和EGFP的双重蛋白活性。结论：基因重组技术成功构建BMP2/pLEGFP重组体,重组体表达的融合蛋白具有GFP和BMP2的双重活性。     

迁移侵袭抑制蛋白MIIP的GST融合蛋白表达及生物学活性鉴定

目的构建人MIIP蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达及生物学活性鉴定。方法 RT-PCR扩增得到人MIIP基因全长编码序列,采用重组DNA技术将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得重组原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌BL21细胞中,用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经纯化获得目的蛋白,用Western blot鉴定所得融合蛋白。结果构建了pGEX-4T-1-MIIP原核表达载体,在大肠杆菌中表达获得了GST-MIIP融合蛋白,经Glutathione Agarose纯化和Western blot检测,证实所得GST-MIIP融合蛋白具有生物学活性。结论成功获得了有生物学活性的GST-MIIP融合蛋白。     

小鼠IL-4重组质粒的构建及目的蛋白的表达和纯化

目的 构建重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,纯化目的蛋白并鉴定.方法 将优化后的小鼠IL-4 cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a (+)上,获得重组质粒pET32/rmIL-4,转入BL21(DE3)中经IPTG诱导表达得到包涵体.经复性处理后,依次用阴离子交换柱和分子筛纯化蛋白.对纯化得到的蛋白用Western blot检验免疫学特异性,用mIL-4生长依赖性细胞株CTLL-2增殖实验和动物实验测定其生物学活性.结果 经酶切和测序证实重组质粒pET32/rmIL-4构建成功.诱导得到的包涵体用3 mol/L盐酸胍溶液洗涤后溶于加有β-巯基乙醇的7 mol/L盐酸胍溶液中变性,在pH9.5的条件下梯度透析复性.纯化出的蛋白经Western blot鉴定,能与抗小鼠IL-4抗体特异性结合;经细胞和动物实验鉴定,rmIL-4蛋白具有生物学活性,能刺激mIL-4生长依赖性细胞株CTLL-2增殖,使小鼠体内细胞因子发生从TH1到TH2的漂移.结论 成功制备了高纯度、具有生物学活性的小鼠IL-4,为进一步研究其生物学功能提供了条件.     

重组人中期因子的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

目的：表达和纯化具有生物学活性的重组人中期因子蛋白。方法：应用RT—PCR从人肝细胞癌组织总RNA中扩增中期因子cDNA,将其克隆到表达载体pET-24a,在大肠杆菌中诱导表达,经肝素-琼脂糖亲和层析柱纯化,应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹和细胞增殖试验对纯化产物进行分析鉴定。结果：构建的重组质粒pET—HMK能在大肠杆菌中高表达,诱导表达的蛋白主要存在于包涵体中,经肝素琼脂糖柱亲和层析后纯化产物呈单一条带,特异性抗体反应证实是重组人中期因子,细胞增殖试验显示其能育效促进NIH3T3细胞生长,并且具有剂量依赖性。结论：原核系统表达的重组人中期因子蛋白纯品具有刺激细胞增殖的活性。     

高效的骨诱导生长因子——成骨蛋白—1

成骨蛋白-1（OP-1）又称骨形态发生蛋白-7（BMP-7）是BMP家族中的一员,具有高效的骨诱导活性。它可对成骨细胞系列中的不同细胞发挥阶段特异性调控作用,以诱导新骨形成。近年来,随着分子生物学技术的发展,以DNA重组技术生产的重组人OP-1已经问世,并已在多方     

人血小板衍生生长因子BB原核表达及生物学活性鉴定

目的 表达人血小板衍生生长因子(PDGF)BB蛋白并进行生物学活性鉴定.方法 基因扩增方法获得人PDGF-B基因;原核表达PDGF-BB蛋白,并纯化、复性;免疫印迹分析重组蛋白的免疫原性;应用培养的大鼠成骨细胞对其生物学活性进行鉴定.结果 扩增出327bp目的基因,与预期结果吻合,DNA序列分析正确.SDS-PAGE和免疫印记检测表明获得新生蛋白的分子量及免疫原性均与预期符合.体外细胞学鉴定表明,获得的rhPDGF-BB可明显促进大鼠成骨细胞的增殖和DNA复制,表明重组的PDGF-BB具有较好的生物学活性.结论 PDGF-B成熟肽基因克隆成功并成功地在大肠杆菌中实现了高表达.复性后细胞学MTT和FCM鉴定表明获得的rhPDGF-BB具有较好的生物学活性,为生产活性PDGF-BB蛋白及其在促进骨组织和创伤修复方面的进一步功能研究奠定了基础.     

VEGF165的载体构建、表达及其生物学活性

目的:构建血管内皮生长因子(VEGF)165原核表达载体,在大肠杆菌中表达,获得重组VEGF165,并通过细胞和鸡胚尿囊膜试验鉴定其生物学活性.方法: 本实验室保存的T-VEGF165质粒,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,将其克隆至原核表达载体pET28a( )中,获得含人VEGF165全序列基因的表达载体pET28a( )-VEGF165,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,对表达产物进行纯化,获得VEGF165蛋白.通过体外促进HUVEC细胞增殖及鸡胚尿囊膜血管增生实验鉴定其生物学活性.结果:成功构建了VEGF165蛋白的原核表达载体,表达纯化了VEGF165蛋白,经过细胞增殖试验及鸡胚尿囊膜血管增生实验,证明该蛋白具有良好的促进血管内皮细胞增殖的生物学活性.结论:成功地获得了人VEGF165重组蛋白,并证实了该蛋白具有促进血管内皮细胞增殖活性.     

Smad蛋白在BMP-2诱导成骨分化过程中的作用

目的研究Smad蛋白在骨形态发生蛋白-2（BMP-2）诱导成骨分化过程中作用,探讨Smad蛋白在成骨分化期间信号传导的机制。方法将取自MDX大鼠颅盖骨组织分离获得成骨细胞进行培养,培养的成骨细胞分组,加入不同浓度的BMP-2或BMP-2与Trx2SARA混合物后,用反义PCR和Western Blot斑点杂交对各组诱导成骨分化的情况进行分析。体内实验中肌肉局部埋植BMP-2或BMP-2和Trx2SARA,取不同时间点处死动物,制备组织切片,用SO染色进行组织学观察。结果BMP-2处理的成骨细胞碱性磷酸酶增加,降钙素mRNA增加,Smad蛋白的表达水平呈剂量依赖性增加。Trx2SARA处理组出现碱性磷酸酶和降钙素mRNA下调。体内实验组织切片SO染色显示,BMP-2处理组大部分异位组织由增殖中、肥厚前和肥厚软骨细胞构成,而Trx2SARA处理组很少向软骨源细胞分化。结论Smad蛋白在BMP-2诱导成骨分化中发挥重要的信号传导作用。     

血管内皮生长因子在原核细胞中的高效表达、纯化与活性研究

目的用基因工程的方法在大肠杆菌中诱导表达人血管内皮生长因子（VEGF165），分离纯化并检测其免疫学以及生物学活性，为后期构建携带VEGF165蛋白的预成血管化组织工程骨提供充足的蛋白来源。方法利用PCR亚克隆的方法获得目的基因片段，构建表达质粒pQE30-VEGF165，在大肠杆菌JM109中用IPTG进行诱导表达并使用Ni^2＋--NTA进行蛋白纯化。酶联免疫吸附（ELISA）和Western blot技术检测纯化的VEGF165蛋白免疫学活性，鸡胚尿囊绒毛膜实验和matrigel血管形成实验检测其生物学活性。结果重组表达质粒pQE30-VEGF。在大肠杆菌中成功的表达了相对分子质量为23000的蛋白,该蛋白以不溶性包涵体的形式存在，占菌体总蛋白的30％左右。经过分离和Ni柱纯化获得了VEGF165蛋白，浓度约为0．2mg／ml，ELISA和Westernblot实验显示其具有良好的免疫学活性，鸡胚尿囊绒毛膜实验和matrigel血管形成实验显示所表达的蛋白具有良好的生物学活性。结论本实验在原核细胞中稳定、高效的表达了具有活性的VEGF165蛋白，为后期预购血管化组织工程骨的构建提供了充足的蛋白来源。     

人IL-37b在大肠埃希菌中的表达、纯化及活性鉴定

目的表达重组IL-37b蛋白并去除内毒素,鉴定其活性。方法构建原核表达载体p ET28/IL-37b,转化大肠杆菌感受态细胞;经IPTG诱导表达的重组蛋白由Ni2+-NTA凝胶进行变性条件下的亲和层析纯化;用SDS-PAGE分析、考马斯亮蓝染色鉴定重组蛋白是否为目的蛋白;去除蛋白中原核表达所产生的内毒素;将蛋白作用于受LPS刺激的RAW 264.7细胞,收集培养上清,通过ELISA方法检测IL-6的表达水平,鉴定蛋白的生物学活性。结果表达了纯度较好的重组IL-37b蛋白,降低了其中原核表达所产生的内毒素,经鉴定其具备良好的生物学活性。结论成功表达了具备良好生物学活性的IL-37b蛋白。     

重组人骨形成蛋白2基因在大肠杆菌中的克隆

目的：在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因,方法：由人成骨细胞中提取细胞总RNA,利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA;将获得基因片段重组到pCI质粒中,转化到大肠杆菌Top10后挑选克隆,利用限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定重组质粒。结果：质粒DNA酶切分析及核酸序列分析证实,获得的基因片段为人BMP2全编码序列,结论：克隆获得人骨形成蛋白2基因,为表达骨形成蛋白2奠定了基础。     

人骨形成蛋白-7基因在人骨髓间充质干细胞中的表达和对其分化表型的影响

目的：观察人骨形成蛋白-7(BMP-7)基因在人骨髓间充质干细胞(hMSC)中的表达及对其成骨表型的影响。方法：利用AdEasy腺病毒表达系统构建人BMP-7基因表达腺病毒AdB7V，体外感染hMSC后观察绿色荧光蛋白(GFP)表达及RT-PCR、免疫组化方法鉴定外源基因的表达，通过对感染细胞的碱性磷酸酶(ALP)染色和钙盐染色鉴定其成骨分化表型。结果：hMSC经AdB7V感染后72h可观察到GFP表达，RT-PCR、免疫细胞化学方法证实外源性BMP-7在hMSC中表达，感染细胞的ALP染色和钙盐染色均为阳性。结论：外源性的人BMP-7基因可在hMSC中表达并诱导其向成骨细胞分化。     

BMP-2表达载体的构建及其转录活性测定

目的构建BMP-2表达载体及测定其转录活性。方法将骨形成蛋白(bone morphology protein-2,BMP-2)基因克隆入带HA标签的BMP-2表达载体中,得到带HA标签的重组质粒pGBKT7/HA-BMP-2,转染pGBKT7/HA-BMP-2重组质粒入酵母AH109、Y187细胞。结果Western印迹检测表明表达了与预期分子量大小一致的BMP-2。结论BMP-2表达载体的成功构建为我们深入研究BMP-2在促进骨痂生成过程中的分子机制及其生物学功能打下了坚实的基础。     

BMPs与wnt-3a促进C3T3-E1细胞成骨作用的研究

【目的】 在促进MSCs骨形成的众多调节因子中,骨形成蛋白(BMPs)家族在胚胎发育及骨骼形成中扮演重要的角色。目前发现的BMPs家族成员骨诱导活性中,具有成骨活性的有 BMP2、7、9 亚型。除了BMP通路外,wnt通路在骨形成中也起到了重要的作用。本实验旨在进行BMP-2/wnt-3a、BMP-7/wnt-3a、BMP-9/wnt-3a三种联合转染,观察感染后细胞各基因和蛋白的干扰效率及细胞体外成骨分化的影响,评价三种转染的成骨分化能力的强弱,并与单独转染效果进行比较。 【方法】 以cDNA文库为模版,应用PCR方法获得BMP2、BMP7、BMP9、wnt-3a基因的编码序列,经大肠杆菌转化后抽取质粒,构建基因表达质粒载体,酶切鉴定重组体并且经测序进一步确定。然后用pLP/VSVG、pLP2、pLP1质粒与BMP2、BMP7、BMP9、wnt-3a共转染293FT细胞。包装pELNS-BMP2、BMP7、BMP9、wnt-3a后转染小鼠间充质干细胞MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染效果。茜素红染色检测钙结节,蛋白质印迹和real-time PCR检测成骨相关基因(Runx2)的表达水平,鉴定各成骨诱导因子的单独转染效能。最后用双基因联合转染(BMP-2/wnt-3a,BMP-7/wnt-3a,BMP-9/wnt-3a三组)MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染效果;应用ELISA检测MC3T3-E1细胞培养上清中BGP和ALP的表达水平;应用real-time PCR检测Runx2 mRNA的表达水平;应用蛋白质印迹法检测蛋白的表达水平,鉴定双基因联合转染的成骨分化效能。 【结果】 pELNS-BMP2、pELNS-BMP7、pELNS-BMP9、pELNS-wnt3a表达质粒构建成功。重组慢病毒pELNS-BMP2、pELNS-BMP7、pELNS-BMP9、pELNS-wnt3a构建成功,成功转染MC3T3-E1细胞;Runx2表达水平:BMP2>BMP9>BMP7;茜素红染色显示BMP-2钙结节数量最多。双基因联合转染MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染成功;蛋白质印迹与real-time PCR法显示三组联合转染Runx2表达水平比单独转染明显上升,且联合转染Runx2表达水平:BMP-2/wnt-3a>BMP-9/wnt-3a>BMP-7/wnt-3a; BGP表达与 ALP表达亦然。 【结论】 BMPs能促进间充质干细胞向成骨细胞分化, 其中BMP2成骨效果最好。而BMPs与wnt-3a的联合转染成骨效果高于单独转染,说明BMP通路与wnt通路有协同作用。其中BMP-2/wnt-3a双基因联合转染比另两种转染(BMP-7/wnt-3a和BMP-9/wnt-3a)成骨效能更高。这为组织工程骨重建研究提供了重要的理论依据和技术支持。     

MiR-133a调控BMP-2诱导的血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化的机制

目的研究MiR-133a调控BMP-2诱导的血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化的机制。方法采用BMP-2处理大鼠血管平滑肌细胞72h建立成骨样细胞分化模型。实验分组与细胞处理方法:1)空白对照组:采用溶媒处理血管平滑肌细胞72h;2)模型对照组:采用BMP-2处理血管平滑肌细胞72h;3)MiR-133a组:采用BMP-2处理MiR-133a转染的血管平滑肌细胞72h;4)MiR-NC组:采用BMP-2处理MiR-NC转染的血管平滑肌细胞72h。通过免疫荧光染色和细胞形态鉴定原代大鼠血管平滑肌细胞表型。检测大鼠血管平滑肌细胞内钙离子浓度、碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素(OC)水平、骨相关蛋白(Runx2、Osterix)表达及细胞凋亡情况。结果过表达MiR-133a能显著抑制BMP-2诱导的血管平滑肌细胞钙离子浓度、ALP活性及OC水平的增加(P<0.05),能显著抑制BMP-2诱导的血管平滑肌细胞Runx2、Osterix蛋白表达(P<0.05),同时能显著抑制BMP-2诱导的血管平滑肌细胞的凋亡(P<0.05)。结论 MiR-133a可以显著抑制BMP-2诱导的血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化,其机制可能是抑制BMP-2引起的骨相关蛋白的增加和阻碍BMP-2诱导的大鼠血管平滑肌细胞凋亡。     

TAT／LMP-3融合蛋白的制备及其诱导成骨活性的初步研究

目的：表达并纯化具有入胞转导能力并保持骨诱导活性的重组融合蛋白TAT／LMP-3,观察融合蛋白TAT／LMP-3对人骨髓间充质干细胞的入胞转导活性和诱导其成骨分化的效能．方法：采用基因工程技术构建原核表达载体pET43．1a—TAT／LMP-3和pET43．1a—LMP-3并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni—NTA树脂亲和层析柱纯化后进行初步鉴定,同时制备重组蛋白LMP-3的多克隆抗体．将融合蛋白与人骨髓间充质干细胞共孵育,Western Blot技术分析融合蛋白的入胞效应,检测成骨细胞标志性基因表达以分析重组蛋白对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响．结果：成功地构建了pET43．1a—TAT—LMP-3融合基因原核表达载体,获得了TAT／LMP-3的可溶性表达,纯化后融合蛋白TAT／LMP-3纯度大于90％．成功制备了TAT／LMP-3的兔源性多克隆抗体．Western Blot分析证实TAT—LMP-3融合蛋白能以浓度和时间依赖性的方式转导进入人骨髓间充质干细胞,同时,TAT／LMP-3能成功诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化．结论：成功进行了TAT／LMP-3融合蛋白的原核表达、纯化和鉴定,构建的TAT／LMP-3融合蛋白具有入胞转导能力同时保持了骨诱导活性,为其在脊柱融合的进一步应用奠定了实验基础．     

rhFGF4在大肠杆菌中的表达、纯化及其对高糖损伤的人脐静脉内皮细胞的保护作用

目的：制备、鉴定重组人成纤维细胞生长因子4（rhFGF4）蛋白,观察rhFGF4 对高糖损伤人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的保护作用及相关分子机制。方法：构建pET3d-hFGF4 重组质粒,利用大肠杆菌表达系统高效表达rhFGF4 蛋白。可溶性目的蛋白大多以包涵体的形式表达,制备方法为建立包涵体清洗、变性及肝素柱柱上复性与纯化。采用MTT法检测rhFGF4 蛋白促细胞增殖的生物学活性,建立细胞损伤模型并用Western blot技术检测NF-κB、JNK以及p38 蛋白的磷酸化表达。结果：成功构建重组质粒pET3d-hFGF4。SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定结果表明,rhFGF4 蛋白在大肠杆菌中成功高效表达。细胞实验证实rhFGF4蛋白通过阻止NF-κB、JNK以及p38的磷酸化来修复高糖诱导损伤的HUVEC并抑制其凋亡,降低其MDA、ROS含量。结论：本研究成功得到高纯度并具有生物学活性的rhFGF4蛋白,并证实其对高糖损伤的HUVEC的保护作用与改善氧化应激水平相关。     

γ-干扰素诱导蛋白-10融合蛋白的表达纯化及其生物学活性测定

目的 表达大鼠γ-干扰素诱导蛋白-10 (IP-10) 融合蛋白,并测定其生物学活性.方法 从大鼠脾细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法得到IP-10cDNA.双酶切将其插入pET-32 (a) +载体中.重组质粒pET-32a (+) -IP10经测序证实.将pET-32a (+) -IP10转化大肠杆菌BL21 (DE3) 中进行表达,目的蛋白经镍离子亲和层析柱纯化.微室跨膜迁移实验测定其生物学活性.结果 测序表明,所构建的重组质粒pET-32a (+) -IP10序列完全正确,诱导表达的蛋白的相对分子量同预期分子量相同,微室跨膜迁移实验测定出IP-10融合蛋白对激活的T淋巴细胞具有良好的趋化活性.结论 成功在大肠杆菌中表达了IP-10融合蛋白,并具有生物学活性.