抗体芯片技术在卵巢癌诊断中的应用进展

蛋白质组学相关技术的发展使得对复杂蛋白表达模式,蛋白间相互作用,翻译后修饰的大规模分析变为可能,其中的抗体芯片在生物学研究中尤其是在血清中筛选鉴定肿瘤标志物方面已表现出巨大的潜力。目前,抗体芯片常用的抗体仍然是单克隆抗体,但是高特异性,高亲和力并能利用现有数据库大规模生产的重组抗体是研究的趋势。卵巢癌致病的生物学机制至今不明,用抗体芯片来鉴定卵巢癌组织中的异常表达蛋白进而进行肿瘤的早期诊断及治疗监测是目前研究的热点。本文将对抗体芯片基本原理与分类以及在卵巢癌诊断中的应用做一简要综述。     

蛋白芯片的研究及其在生物毒素检测方面的应用

随着生物芯片技术的迅猛发展，DNA芯片已被应用于各种已知和未知的核酸序列表达的检测和研究中。虽然DNA芯片的技术已很完善，但这种以核酸为基础的芯片检测只能提供间接的信息。而我们要了解蛋白与蛋白之间，蛋白与DNA之间的相互作用，必须对蛋白质的功能进行更深入的研究。传统方法，如免疫亲和法、液相色谱及电泳分离技术等已成功地用于蛋白质的分析，     

蛋白质芯片-飞行质谱技术及其在临床医学中的应用

蛋白质组学研究是最终揭示生命现象本质的关键，如今该学科已步入生命科学研究的最前沿。与之相伴随着的生物高新技术发展催生了一项新型生物芯片技术，即蛋白质芯片飞行质谱技术——表面加强激光解析电离飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption／ionization—time of flight—mass spectra，SELDI-TOF—MS)。该技术将蛋白质芯片和质谱技术相结合，集样品分离、纯化、检测和数据分析为一体，具快速和高通量，成为目前蛋白质表达及蛋白质组学研究的有力工具。其可望为众多疾病的机理阐明及攻克提供理论依据和解决途径，在临床疾病诊断和防治方面发挥重要作用，显示了良好的发展前景和广泛的应用前景。本文对蛋白质芯片-飞行质谱技术的原理、特点及部分疾病的基础和临床研究等进行文献综述。     

PCR法检测乳腺癌患者血清抗p53蛋白抗体的研究

目的为乳腺癌诊断提供血清学新方法.方法用免疫-聚合酶链反应（immuno-polymerase chain reanon,PCR）法检测血清抗p53蛋白（一种抑癌基因）抗体,酶免疫组化方法检测组织p53蛋白表达.结果乳腺癌患者血清抗p53蛋白抗体阳性率为39.5%,而非癌患者和正常人血清抗p53蛋白抗体均为阴性,乳腺癌患者血清中抗p53蛋白抗体显著高于非癌患者和正常人（P＜0.01）.p53蛋白阳性表达的乳腺癌患者抗p53蛋白抗体阳性率为64.2%,明显高于p53蛋白阴性表达组,血清p53抗体测定与p53蛋白表达密切相关（P＜0.01）.结论检测血清抗p53蛋白抗体是检测组织p53蛋白理想的替代工具,抗p53蛋白抗体可以作为乳腺癌血清学诊断新标志,用于乳腺癌的普查和早期诊断.     

微流控芯片技术的研究进展

微流控芯片技术是指采用微细加工技术，在一块几平方厘米的芯片上制作出微通道网络结构和其他功能单元，把生物和化学等领域所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离和检测等基本操作单元集成或基本集成在尽可能小的操作平台上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的技术。它不仅使生物样品与试剂的消耗降低至纳升（nl）甚至皮升（pl）级，而且使分析速度大大提高，     

联合应用蛋白质芯片技术和前列腺特异抗原早期诊断前列腺癌的研究

目的应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)蛋白质芯片技术探讨联合前列腺特异抗原(PSA)早期诊断前列腺癌的方法。方法以病理确诊的45例前列腺癌和45例良性前列腺增生患者血清为研究对象,采用SELDI蛋白质芯片技术检测血清的蛋白表达图谱,分析差异蛋白,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清PSA,对所得差异蛋白联合PSA进行分析。结果在前列腺癌和良性前列腺增生患者血清中检测到9个差异蛋白(P<0.01),前列腺癌患者差异蛋白7个高表达,2个低表达。联合相对分子质量3771.14和4481.59两个差异蛋白诊断前列腺癌,其敏感性为86.67%,特异性为88.89%。3771.14蛋白与血清PSA诊断前列腺癌具有很强的互补性。结论通过SELDI蛋白质芯片技术可以筛选出前列腺癌的潜在标志蛋白,多个差异蛋白联合检测可以提高前列腺癌诊断的敏感性和特异性;联合3771.14蛋白与血清PSA可以更好地早期诊断前列腺癌。     

一组miRNA/RNAi通路中关键蛋白-Argonaute系列多克隆抗体制备、鉴定及组织定位初步研究

目的制备一系列Argonaute（AGO）蛋白多克隆抗体,并鉴定其特异性及其在人类正常及肿瘤组织中的分布。方法合成特异性AGO多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白（KLH）作为载体构建多肽免疫原,致敏大白兔,制备系列兔抗人AGO多克隆抗体,然后用亲和层析法纯化抗体。用ELISA和Western方法进行抗体验证,并应用人组织芯片进行AGO的免疫组化研究。结果笔者制备了8个兔抗人AGO蛋白多克隆抗体,经ELISA及Western blot证实兔抗人AGO抗体可特异性识别AGO多肽,在人组织芯片中通过免疫组化染色显示该抗体在大多数正常及肿瘤组织上皮来源细胞胞浆中呈阳性染色,其中Piwils抗体还可使星状胶质细胞瘤、脑脊膜瘤及胃癌癌细胞染色。结论本项研究成功制备系列兔抗人AGO多克隆抗体,为进一步研究AGO在miRNA/RNAi通路中的作用及在人类疾病中的意义提供了有利工具。     

谷胱甘肽-S转移酶-中期因子融合蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和中期因子(MK)融合蛋白的原核表达质粒,并表达和纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR技术从人胃癌组织中扩增入MK编码序列,克隆入表达载体pGEX-1λT中,获得表达质粒pGEX-MK,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达,通过亲和层析纯化表达的GST-MK融合蛋白,并以重组蛋白免疫兔子.结果 成功构建了GST-MK融合蛋白的原核表达载体,经诱导表达纯化得到GST-MK融合蛋白.免疫兔子后取多抗血清以间接ELISA检测效价达1∶64 000,Western blotting分析显示多克隆抗血清对MK蛋白特异结合.结论 MK在大肠杆菌中成功表达及其多克隆抗体的获得,为研究MK生物功能奠定了基础.     

以CpG为佐剂的人IL-24多克隆抗体的制备

目的：采用在原核表达系统表达的人IL-24蛋白及人IL-24真核重组质粒免疫新西兰兔，制备兔抗人IL-24多克隆抗体。方法：利用IPTG诱导hIL-24在大肠杆菌中表达，纯化hIL-24重组蛋白，纯化后的蛋白经SDS—PAGE分析，同时提取hIL-24真核重组质粒，用以免疫新西兰兔，并以CpG为佐剂制备多克隆抗体。Western-blot鉴定抗体的特异性，ELISA法测定抗体效价。结果：人IL-24经IPTG诱导后可在大肠杆菌中大量表达，表达量占细菌总蛋白的30％，纯化后的蛋白纯度高；原核表达的重组蛋白和真核重组质粒免疫新西兰兔，通过抗体效价测定，获得了抗血清效价达1：640的多克隆抗体。结论：原核表达的hIL-24蛋白和hIL-24真核重组质粒均能刺激家兔产生抗体．其多克隆抗体的效价较高。     

信息

2006-18“绿色化学工艺生产富马酸，联产DL-苹果酸”科研项目国际领先；2006-19抗肿瘤基因工程单链抗体导向药物；2006-20转基因产品检测寡核苷酸芯片的制作方法及其应用。     

蛋白芯片筛查卵巢癌与正常卵巢组织间的差异表达蛋白

目的采用蛋白抗体芯片筛选上皮性卵巢癌的差异表达蛋白。方法选取7例卵巢上皮性癌混合样品及其配对的正常卵巢组织混合样品,经Cy3和Cy5双色荧光标记后与含有512种已知蛋白质的单克隆抗体芯片杂交,根据杂交荧光信号强度计算内源标准化信噪比（INR）,以INR〉2.0或〈0.7为临界值,筛查出卵巢癌与正常卵巢组织间的差异表达蛋白群。结果发现31种卵巢癌与正常卵巢组织间明显差异表达的蛋白质,多数参与了细胞的转录、增殖、信号传导和凋亡等过程,其中17种为高表达,14种为低表达。结论卵巢癌的发生是一系列分子变化积累的结果,涉及到多个分子和信号通路的异常改变。     

抗BSA抗体检测鼠胰岛B肿瘤细胞提取物

目的：检测鼠胰岛B肿瘤细胞（rat insulinoma，RIN）株的蛋白提取物是否和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）有共同的抗原决定簇。方法：从经过无血清培养的RIN细胞中提取蛋白质，用Western Blotting方法，用BSA抗体检测提取物中能和该抗体结合的蛋白质。结果：从提取物中检测出了能和BSA抗体结合的相对分子质量为63000的蛋白质。结论：RIN细胞中含有与BSA有共同的抗原决定簇的蛋白质。     

血清蛋白质谱模型的建立及在乳腺癌诊断中的应用

目的建立健康女性人群、乳腺癌患者血清蛋白质谱模型，并探讨对乳腺癌诊断的临床意义。方法应用表面加强激光解析电离化飞行时间质谱（SELDI—TOF—MS）技术，以弱阳离子交换芯片（CM10）结合血清蛋白质，分析60例乳腺癌患者、60例健康对照女性的血清样本，得到其蛋白质谱，用BioMarker Pattern软件分析蛋白质谱图，建立分类树模型并进行盲筛验证。结果乳腺癌患者与健康对照女性比较，筛选出12个差异蛋白质峰（P〈0．001），其中6个标志蛋白呈高表达，6个标志蛋白呈低表达。BioMarker Pattern软件在设定条件下自动选取3个标志蛋白用于建立乳腺癌诊断的分类树模型，此模型灵敏度为91.90％，特异度为81．25％。结论利用SELDI—TOF—MS技术可筛选出乳腺癌患者和健康对照女性血清蛋白质谱存在的差异蛋白质峰，可作为乳腺癌检测、随访监测的指标。     

基因芯片技术在医药学研究中的应用

基因芯片又称DNA芯片或DNA微阵列,属于生物芯片的一种.生物芯片是根据生物分子间特异相互作用的原理,将生化分析过程集成于芯片表面,从而实现对多肽、蛋白质及其他生物成分的高通量快速检测.因此,该技术一经问世,就受到了广泛关注,在医学领域的应用也取得了重要进展.     

以乙肝病毒核心抗原HBcAg为载体的utrophin抗体的制备

目的构建以乙肝病毒HBc为载体的带有utrophin的两个B细胞表位多肽的融合表达质粒pHBc-2UB,表达出融合蛋白并纯化,通过免疫新西兰大白兔获得抗utrophin的抗体。方法通过DNAstarⅡ模拟出utrophin的两个显著优势的B表位。用PCR法合成片段插入HBcAg序列的78位,将该合成片段克隆至pET28a载体中,构建重组表达质粒,表达出融合蛋白HBc-2UB,纯化后免疫新西兰白兔。再将该合成片段克隆至pGEX4T-2载体中,构建重组表达质粒,表达出融合蛋白GST-2UB,用于检测两个表位的抗体。结果测序结果表明重组质粒构建成功,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白表达正确,ELISA检测到高滴度抗体。结论以HBc呈现utrophin的B表位被成功表达和纯化,获得高滴度的与两个B表位结合的抗体,为utrophin检测和DMD治疗药物研究打下了基础。     

高效亲和色谱法检测细胞培养上清中的抗体融合蛋白质

目的建立高效亲和色谱检测抗体融合蛋白质的方法,用于抗体及抗体融合蛋白质生产的过程控制。方法正压匀浆法装填rProtein A Sepharose,用不同pH值缓冲液分步洗脱。结果在25~1 000μg/mL浓度范围内,重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFR-Fc)浓度和峰面积显著相关,r=0.999 6;回收率范围为91%~99%,对表达TNFR-Fc的CHO工程细胞的不同培养阶段的3份上清分别进行3次重复测定,RSD在2%以内。结论该方法适用于抗体及抗体融合蛋白质生产的过程控制。     

低密度蛋白质芯片在医药研究中的应用

蛋白质芯片技术日趋成熟,研究重点已由对整个蛋白质组的观察,转变为对具有重要功能的蛋白质的研究。低密度蛋白质芯片技术的建立为这一研究转变提供了有力工具,具有交叉影响小,信号强度高,结果准确性好的特点。文章综述了低密度蛋白质芯片在疾病诊断和监控,药物发现和检测,分子相互作用和信号通路等医药研究中的应用。     

NHERF-1介导雌激素调节PTEN蛋白表达的研究

目的：研究雌激素调节PTEN蛋白表达的分子机制。方法：利用蛋白质芯片筛选PTEN的结合蛋白，发现了NHERF-1与PTEN的相互作用；应用GST pull-down、over-lay和免疫共沉淀等方法确认了其二者的相互作用。通过瞬时转染、免疫印迹分析、RT-PCR、RNAi以及蛋白降解速度检测等方法检测NHERF-1对细胞内PTEN稳定性的影响。结果：发现了PTEN与NHERF-1的相互作用，该相互作用是通过PTEN羧基末端与NHERF-1的第一个PDZ结构域相结合而实现的。将PTEN羧基末端的4个氨基酸分别突变为丙氨酸，都会明显抑制二者的结合。利用免疫共沉淀确认了细胞内完整的PTEN与NHERF-1蛋白分子的相互作用。发现NHERF-1的表达可以提高细胞内PTEN的蛋白表达量，而其mRNA表达水平没有增加。利用环己酮抑制新蛋白合成后，检测到NHERF-1的表达可以抑制PTEN蛋白的降解速度；RNAi抑制内源性NHERF-1的表达导致IYFEN的蛋白表达量显著下降。雌激素可以明显增高NHERF-1与PTEN的蛋白表达，RNAi干扰NHERF-1表达后，雌激素不再调节PTEN的蛋白的表达。结论：PTEN与NHERF-1可以特异结合。NHERF-1与PTEN结合显著提高PTEN蛋白的稳定性；雌激素并不直接调节PTEN蛋白的表达而是通过诱导NHERF-1的表达，引起PTEN蛋白稳定性的增强而导致PTEN蛋白含量的提高。     

人源抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达

目的：探讨抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母(P．Pastoris)中的表达以及初步的纯化、活性鉴定方法。方法：用PCR将目的蛋白基因从质粒PGEM7Zf( )-HBScFv-IL-2上扩增出来，再亚克隆到酵母表达载体pPICZaA中，转化P．Pastoris宿主菌GS 115，菌落：PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定转化子，重组酵母经甲醇诱导后，通过SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定表达产物；再通过亲和层析法纯化目的蛋白；用间接ELISA实验鉴定其活性。结果：表达的重组蛋白分子质量约为44ku，表达量可达12％；纯化后凝胶成像分析目的蛋白的纯度达到95％；重组融合蛋白能与HBsAg、鼠抗IL-2单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建了抗HBsAg单链抗体与IL-2融合蛋白酵母表达工程菌，并初步建立了对目的蛋白的纯化及活性鉴定方法。     

2005-A-150 专家提出肿瘤细胞免疫分析新方法

“肿瘤细胞免疫分析新技术”先后受到国家自然科学基金等资助，目前取得重大进展：建立了肿瘤细胞免疫分析新技术及流动注射化学发光免疫分析新方法，并研制成功6种新型电化学免疫传感器件与检测芯片。尤其是新型免疫传感器性能稳定，样品用量少，免疫反应一步完成，无需分离洗涤步骤，已成功用于临床病人血清中AFP、CEA、CAl99和CAl25等含量的快速检测；而发展的一次性免疫芯片对肿瘤标志物的检测方便、快速、价格低廉，可使原先的检测成本成倍降低。