长春新碱靶向缓释微球治疗鼠腺样囊性癌的研究

目的 制备连接有叶酸(FA)的长春新碱(VCR)纳米微球(NP),简称为FA-PLGA(VCR)-NP,观察其对体外培养的腺样囊性癌(ACC-2)细胞及裸鼠眼眶移植瘤的抑制作用.方法 实验研究.采用改良的复乳法制备FA-PLGA(VCR)-NP;四甲基偶氮唑盐比色法比较细胞生长抑制率,设VCR、长春新碱微球PLGA(VCR)-NP及FA-PLGA(VCR)-NP组,药物浓度分为0.05、0.25、0.50、1.00、5.00、10.00、30.00 mg/L,检测加药后第1、2、3、4、5天吸光度值;瘤细胞悬液接种法建立裸鼠腺样囊性癌眼眶移植瘤动物模型,分VCR、PLGA(VCR)-NP、FA-PLGA(VCR)-NP及对照组,观察给药后第1、7、14天,各组肿瘤体积抑制率、高效液相色谱法测定肿瘤内残余药物浓度,以及不同时间组织电镜和组织病理学观察.不同时间正常对照与空白微球A值比较采用t检验.考虑到药物、浓度、时间以及三者之间的交互作用,采用多因素方差分析法对比药物对ACC-2细胞增殖的影响.体积抑制率及药物残余浓度比较均采用单因素方差分析,多重比较采用LSD法.结果 FA-PLGA(VCR)-NP呈规则球形,平均粒径249.2 nm,载药率4.53%,体外释放时间达14 d;PLGA-NP与ACC-2细胞共培养5 d,细胞存活率达80%以上(t=1.952～3.285,P=0.081～0.190);FA-PLGA(VCR)-NP对ACC-2细胞的抑制率显著高于VCR,并呈时间和浓度依赖性(F=4.798～563.479,P=0.000～0.006);靶向微球附着于肿瘤细胞表面,这种识别可以被FA竞争性抑制;PLGA(VCR)-NP组和FA-PLGA(VCR)-NP组对裸鼠移植瘤的体积抑制率显著高于VCR组(P=0.029,0.016);FA-PLGA(VCR)-NP组高于PLGA(VCR)-NP组,但差异无统计学意义(P=0.376);给药后第1、7、14天肿瘤残留药物浓度存在差异,时间对浓度的影响具有统计学意义(P=0.000);透射电镜观察14 d肿瘤细胞内仍有高电子密度的纳米颗粒聚集,肿瘤细胞坏死明显,注射周围组织结构形态正常.结论 VCR靶向缓释微球具有稳定的载药率和体外释放行为,具有良好的靶向识别力,体外及体内实验证实具有优于原药的抗肿瘤能力.     

5-Fu纳米毫微粒的制备及体外对晶状体上皮细胞增生的抑制作用

目的制备5氟尿嘧啶(5fluorouracil,5Fu)聚乳酸纳米毫微粒并观察其表征及体外对兔晶状体上皮细胞的抑制作用。方法采用复乳法制备5Fu聚乳酸纳米毫微粒,观察毫微粒的大小、表面形态和结构,毫微粒载药率和体外药物释放曲线。取传3代晶状体上皮细胞进行对比试验,设5Fu纳米毫微粒、5Fu原药、空载纳米毫微粒组、空白对照组。设0.5～62.5mg·L-14个剂量组,作用24h、72h、120h、168h后光镜下观察细胞性状,MTT法检测抑制作用。结果(1)制备的5Fu纳米毫微粒平均粒径(191.000±0.202)nm;载药率为8.1%;首日药物突释率为38.3%,缓释时间20d;(2)5Fu纳米毫微粒和5Fu原药对兔晶状体上皮细胞均有抑制作用,并随时间和剂量的增加而增加。空载聚乳酸纳米毫微粒对细胞无抑制作用;(3)作用初期各剂量组5Fu纳米毫微粒的抑制作用低于或等于原药,随时间延长分别在不同时间点超过原药,差异有显著性。结论5Fu聚乳酸纳米毫微粒性状稳定,可长期释放药物,有效抑制兔晶状体上皮细胞的增生,随时间延长作用明显高于原药,可以作为靶向缓释药物载体。     

免疫载药毫微粒对晶状体上皮细胞的体外抑制作用

目的制备免疫载药毫微粒HILE6-PLA(5-Fu)-NP,体外评价其表征、免疫学特性及对晶状体上皮细胞(LECs)增殖的抑制作用。方法将抗人LECs膜单克隆抗体HILE6与5-Fu聚乳酸毫微粒采用碳二亚胺法相连接制备免疫毫微粒。扫描电镜观察微粒形态;间接免疫荧光法评价其免疫特异性;建立LECs、角膜基质细胞培养模型,体外检测不同质量浓度免疫微粒和单纯载药微粒对细胞作用2h后的杀伤作用。结果免疫毫微粒保持对LECs的免疫特异性,对LECs具有很强的杀伤作用,明显高于同质量浓度毫微粒,62·5μg/ml作用2h抑制率可达到92·3%,撤药后观察时间延长到7d时的抑制作用高于或不低于3d时的效果。使用药物质量浓度<12·5μg/ml对角膜细胞相对较安全。结论该免疫毫微粒可有选择性的,长时间杀伤LECs,预防后囊混浊。     

靶向5-氟尿嘧啶纳米微球对体外培养的人晶状体上皮细胞作用的研究

目的评价靶向人晶状体上皮细胞免疫载药纳米微球HILE6-PLA（5-FU）-NP的免疫学特征及体外对靶细胞的特异性结合和杀伤作用.方法采用碳二亚胺法将5-氟尿嘧啶（5-FU）聚乳酸纳米微球PLA（5-FU）-NP与抗人晶状体上皮细胞单克隆抗体HILE6连接,制备免疫载药纳米微球.测定其中5-FU与HILE6物质的量之比;ELISA法检测连接后单克隆抗体HILE6的活性变化.设免疫纳米微球组、HILE6与载药纳米微球混合组、载药纳米微球组、空白对照组,MTT法检测对晶状体上皮细胞增殖的抑制作用.间接免疫荧光法观察单克隆抗体HILE6、免疫纳米微球和载药纳米微球对兔晶状体上皮细胞的附着、内化过程.结果免疫纳米微球中5-FU与HILE6物质的量之比约为1809：1,单克隆抗体HILE6保留免疫活性可达原抗体的84%.免疫纳米微球对晶状体上皮细胞作用2 h的半数抑制剂量IC50为5.0μg/ml,抑制作用较载药纳米微球组、单克隆抗体与微球混合组有明显提高.免疫纳米微球在30 min内可识别并附着于兔晶状体上皮细胞;2 h进入细胞质均匀分布;4 h后集中于细胞核区.结论免疫纳米微球HILE6-PLA（5-FU）-NP可携带大量药物,保持特异的免疫活性,在体外识别并进入晶状体上皮细胞有效抑制其增殖.     

人腺样囊性癌多药耐药细胞系的建立

目的:建立人腺样囊性癌耐药细胞系,为阐明腺样囊性癌的多药耐药机制及逆转尉药提供模型及研究依据.方法:以长春新碱(VCR)为诱导剂,通过浓度递增间断刺激法对人腺样囊性癌细胞系(ACC)进行体外诱导耐药,建立耐VCR的腺样囊性癌细胞系ACC/VCR.细胞计数法绘制细胞生长曲线,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞对化疗药物敏感性.结果:ACC经体外诱导后,ACC/VCR细胞对长春新碱(VCR)、阿霉素(ADM)和平阳霉素(PYM)的耐药性明显增强,具有交叉耐药,对环磷酰胺(CTX)、氟尿嘧啶(5-FU)和顺铂(DDP)耐药性无明显变化.耐药前后ACC细胞的生长曲线、群体倍增时间和光镜下的形态无明显改变.结论:VCR可诱导腺样囊性癌细胞产生多药耐药.     

Avastin-壳聚糖纳米粒的制备

目的以壳聚糖(chitosan,CS)为药物载体,制备Avastin-CS纳米粒(Avastin-CS-NP),并对其体外释药特性进行初步研究。方法采用离子胶凝法合成Avastin-CS-NP,用马尔文激光粒径分析仪测试纳米粒径及其分布,透射电镜观察纳米粒形态,用Micro-BCA法对所制得的纳米粒包封率、载药量进行测定,观察Avastin-CS-NP体外释放曲线,对其体外稳定性进行初步考察。结果本研究所制得的Avastin-CS-NP,外观形态呈圆形或类圆形,大小较均匀,粒度分布较窄,平均粒径为88.9nm;纳米制剂的包封率、载药量分别为83.4%和10.4%;体外累积释药实验表明,前8h释药达25.70%,有突释效应,随后逐渐缓慢,96h内共释放80%～90%,具有良好的体外稳定性。结论该纳米制剂具有较好的物理性能与体外缓释特性。     

三氧化二砷对腺样囊性癌ACC-2细胞MDM2基因表达的影响

目的：研究三氧化二砷(arsenic trioxide,As₂O₃)对腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)中ACC-2细胞增殖、凋亡的影响,并从基因和蛋白水平分析其对ACC-2细胞中MDM2基因表达的影响, 从而探讨As₂O₃诱导ACC-2细胞凋亡的具体机制。

方法：体外培养ACC-2细胞,分为实验组和对照组,向培养至指数生长期的ACC-2细胞加入不同浓度(2、4、6、8μmol/L)的含As₂O₃的细胞培养液作为实验组,对照组给予等量的细胞培养液,加入As₂O₃后分别培养不同时间。倒置显微镜下密切观察各时间点不同浓度As₂O₃对ACC-2细胞的生长抑制作用和细胞凋亡的形态变化,应用荧光定量RT-PCR和免疫细胞化学技术检测MDM2基因(24、48h)和蛋白(24、48、72h)的表达变化。

结果：经As₂O₃处理后ACC-2细胞体积缩小变圆,核质固缩,悬浮凋亡细胞增多,存活细胞数量明显减少。RT-PCR及免疫细胞化学结果一致显示,ACC-2细胞随着药物浓度的增加及作用时间的延长,MDM2表达明显减少,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),不同浓度不同时间各组两两比较差异有统计学意义(P<0.05),MDM2蛋白表达量与浓度及时间呈显著负相关性(r<-0.7,P<0.05),即呈浓度和时间依赖性。

结论：As₂O₃对ACC-2细胞具有生长抑制和诱导凋亡的作用,且As₂O₃能够下调腺样囊性癌ACC-2细胞中癌基因MDM2 mRNA及蛋白的表达,可能是其诱导腺样囊性癌ACC-2细胞凋亡的机制。     

胶质源性神经营养因子对体外培养的人腺样囊性癌细胞增生和迁移的影响

背景 嗜神经侵袭是泪腺腺样囊性癌(ACC)有别于其他泪腺肿瘤最重要的生物学特征,胶质源性神经营养因子(GDNF)在涎腺ACC嗜神经侵袭中发挥了重要的作用,但GDNF对ACC细胞生物学功能的调控作用尚需进一步探讨. 目的 研究GDNF对体外培养的人ACC-2细胞增生和迁移能力的影响,为进一步明确ACC的神经侵袭机制提供实验依据. 方法 将ACC-2细胞系在含质量分数10％胎牛血清(FBS)、100 U/ml(商品单位)青霉素、0.1 g/L链霉素的RPMI-1640培养液中进行常规培养和传代,取对数生长期的ACC-2细胞制成单细胞悬液以2×104个/ml的密度接种于96孔板中,实验组加入终质量浓度分别为20、60、80、100、120 μg/L的GDNF,对照组为仅含10％ FBS的RPMI-1640培养液.细胞培养48 h后,用免疫组织化学法检测ACC-2细胞中GDNF蛋白的表达,MTT法检测不同质量浓度GDNF作用不同时间后人ACC-2细胞的吸光度(A570)值;用Transwell小室法检测不同质量浓度GDNF作用不同时间后迁移的ACC-2细胞数目.结果 免疫组织化学法检测表明,GDNF可在ACC-2细胞的细胞质中表达.标准培养48 h后,随着GDNF质量浓度的提高,ACC-2细胞A570值明显增加,各组间的差异有统计学意义(F=3.336,P=0.026).与对照组比较,各质量浓度GDNF组ACC-2细胞A570值均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05).80 μg/L GDNF作用后,随着培养时间的延长,ACC-2细胞A570值逐渐增加,差异有统计学意义(F时间=39.979,P=0.000),各时间点GDNF组间ACC-2细胞A570值均明显高于对照组,组间总体比较的差异有统计学意义(F组别=13.212,P=0.003).GDNF作用细胞30 h后,随着GDNF质量浓度的增加,ACC-2细胞迁移数量明显增加,差异有统计学意义(F=144.886,P=0.000).用100 μg/L GDNF培养24、30、40 h,随着培养时间的延长,ACC-2细胞系迁移数量明显增加,且各时间点GDNF组细胞迁移数均明显多于对照组,差异均有统计学意义(F时何=46.747,P=0.000;F组别=63.786,P=0.000). 结论 GDNF可以促进体外培养的人ACC-2细胞的增生和迁移能力,并且分别具有剂量和时间依赖性.     

载5-氟尿嘧啶聚乳酸纳米微粒对人眼球筋膜囊成纤维细胞抑制作用的研究

目的 探讨载5-氟尿嘧啶(5-FU)聚乳酸纳米微粒(5-FU-PLA-NPs)对体外培养的人眼球筋膜囊成纤维细胞的抑制作用.方法 为实验研究.噻唑蓝(MTT)比色法检测不同剂量(0.1、1.0、10.0、100.0和1000.0 mg/L)的空载聚乳酸纳米微粒(PLA-NPs)在不同时间点(48和72 h)对人眼球筋膜囊成纤维细胞增殖的影响,MTT比色法检测不同剂最(0.1、1.0、10.0、100.0和1000.0 mg/L)5-FU纳米药物和5-FU原药在1～7 d内共7个时间点对成纤维细胞生长的抑制作用,计算并比较两者在7个时间点对成纤维细胞的抑制率.RT-PCR分别检测剂量为100.0 mg/L的5-FU纳米药物和5-FU原药作用成纤维细胞1、5、7 d后Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的表达情况.对同一天各浓度A值的比较用单因素方差分析,同一天相同浓度5-FU原药组A值与5-Fu-PLA-NPs组A值的比较用两独立样本t检验分析,采用单因素方差分析分别比较不同时间点各组COI3的相对A值.结果 空载聚乳酸纳米微粒对成纤维细胞的增殖没有影响.载5-FU纳米微粒和5-FU原药均抑制成纤维细胞的增殖,并使Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的表达水平降低,该抑制作用具有时间和剂量依赖性.作用初期各剂量组5-FU纳米微粒的抑制作用低于原药,随时间延长抑制作用超过原药,差异有统计学意义(P<0.05).结论 聚乳酸(PEA)具有良好的生物相容性与安全性,可作为眼部用药的载体.载5-FU聚乳酸纳米微粒具有一定的缓释功能,可长期释放药物,随着作用时间的延长,5-FU纳米药物对成纤维细胞的抑制作用超过原药,其可作为靶向缓释药物载体.(中华眼科杂志,2009,45:26-31)     

载汉防己甲素壳聚糖纳米微球的制备及其对人翼状胬肉细胞增殖的抑制作用

目的　通过制备新型载汉防己甲素的壳聚糖纳米微球,研究其对于人翼状胬肉细胞增殖的抑制作用。方法　化学合成新型壳聚糖衍生物 （deoxycholic acid-modified chitosan,DAMC）,与汉防己甲素作用合成载药纳米微球,并检测其性能。载药纳米微球作用体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞第1天、3天、5天后,采用CCK-8法检测人翼状胬肉成纤维细胞的活性。结果　通过化学反应成功获得脱氧胆酸基团接枝的DAMC,可包载汉防己甲素药物,两者形成的载药纳米微球载药量较高,可高达76%。粒径50~500 nm,Zeta电位始终保持正电位。体外药物释放实验显示载药纳米微球缓释汉防己甲素可达48 h。细胞活性实验显示Tet组第1天、3天、5天细胞活性分别为（60.70±2.30）%、（50.22±2.35）%、（21.99±2.07）%,而Tet/DAMC组分别为（79.77±2.09）%、（63.24±2.83）%、（40.28±1.19）%,含10×10^-6 mol·L^-1汉防己甲素的载药纳米微球具有抑制人翼状胬肉成纤维细胞的作用,且细胞毒性较原药明显降低。结论　载药纳米微球具有缓释药物的作用,对人翼状胬肉成纤维细胞的增殖具有明显的抑制作用,且细胞毒性较原药明显降低,有望提高汉防己甲素防治翼状胬肉复发的效果。