急性白血病死亡相关蛋白激酶基因启动子的甲基化

目的 研究死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子甲基化和基因表达在初治急性白血病患者中的临床意义.方法 采用MSP方法和RT-PCR方法分别检测60例急性髓系白血病患者、55例急性淋巴细胞白血病患者和17例正常人DAPK基因的甲基化状态及其mRNA的表达,统计学分析各组之间的表达差异.结果 急性淋巴细胞白血病组的DAPK甲基化阳性率(29.1％)高于急性髓细胞白血病组(5％)和正常组(0％)(P＜0.0l25),但甲基化与急性淋巴细胞白血病组患者临床特征无关(P＞0.05).DAPK基因mRNA的表达水平以正常组最高,急性髓细胞白血病组次之,急性淋巴细胞白血病组最低(P=0.000).急性淋巴细胞白血病组患者DAPK mRNA表达与其启动子甲基化呈显著负相关(P＜0.05).结论 DAPK基因启动子在初治急性淋巴细胞白血病患者中甲基化率高于初治急性髓细胞白血病患者和正常人,但与患者临床特征无关.急性淋巴细胞白血病患者DAPK基因表达水平低或不表达可能与其甲基化有关.     

人食管鳞癌细胞株中RIZ1基因启动子区甲基化状态的研究

目的:探讨6种人食管鳞癌细胞株KYSE150,KYSE510,TE13,EC9706,CaEs17和EC109中RIZ1基因启动子区的甲基化状态;观察特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR对存在甲基化的细胞株RIZ1基因的转录调控作用及其对该细胞生长增殖的影响。方法:甲基化特异PCR(MSP)法检测6种人食管鳞癌细胞株中RIZ1基因启动子区的甲基化状态;实时定量PCR法检测5-Aza-CdR处理前后RIZ1基因启动子区CpG岛高度甲基化的人食管鳞癌细胞株TE13中RIZ1 mRNA表达量的变化;MTT法检测5-Aza-CdR对TE13细胞生长增殖的影响。结果:(1)6种人食管鳞癌细胞株中TE13,CaEs17,EC109三株细胞RIZ1基因启动子区存在甲基化;(2)5-Aza-CdR处理细胞株TE13后,RIZ1 mRNA表达量上调;(3)5-Aza-CdR能抑制TE13的生长增殖,并随时间的延长和浓度的增加抑制作用变明显。结论:启动子区CpG岛高度甲基化是人食管鳞癌细胞株TE13 RIZ1基因表达沉默的重要原因;5-Aza-CdR能使TE13 RIZ1 mRNA表达上调;并能抑制TE13细胞的生长增殖,并呈时间和浓度依赖性。     

白血病细胞雌激素受体α启动子CpG 岛甲基化状态的实验研究

目的 检测3种白血病细胞Jurkat、Molt-4、HL-60的雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)基因启动子ERα-A、ERα-B CpG岛甲基化状态,初步探讨ERα启动子区的甲基化状态以及与白血病发病机制的可能联系.方法 应用甲基化特异性PCR技术(MSP)检测3种白血病细胞株与正常人外周血单个核细胞ERα启动子区ERα-A 和ERα-B启动子区CpG岛甲基化状态.结果 白血病细胞株ERα-A 和ERα-B均出现甲基化条带,为全甲基化状态;正常人外周血单个核细胞ERα-A 和ERα-B CpG岛呈现非甲基化状态.结论 ERα基因启动子ERα-A 和ERα-B CpG岛的甲基化状态有可能成为白血病新的分子诊断标记物.     

急性髓细胞性白血病病人TCRζ链基因表达特点

目的 建立实时定量PCR方法检测TCRζ链表达水平的方法,了解急性髓细胞性白血病病人外周血TCRζ链基因表达水平.方法 采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量分析法检测31例急性髓细胞性白血病患者(M1型6例,M2型15例,M3型10例)和30例正常人外周血的单个核细胞的TCRζ链表达情况,以β2微球蛋白基因(Β2m)作为内参,根据相对定量公式2-△△α计算急性髓细胞性白血病患者与正常人TCRζ链表达差异倍数.结果 与正常人相比,急性髓细胞性白血病患者TCRζ链表达特点可以分为表达缺失(16%)、表达下降(26%)和表达上升(58%)三种情况.而三种不同亚型急性髓细胞性白血病之间的TCRζ链表达模式相似.结论 本研究成功建立了SYBR Green Ⅰ荧光实时定量PCR和相关定量分析TCRζ链表达水平技术,并首先报道了急性髓细胞性白血病病人TCRζ链表达水平的变化.     

白血病细胞雌激素受体多个启动子甲基化的实验研究

目的检测白血病细胞雌激素受体（estrogen receptors,ER）基因启动子区CpG岛甲基化状态情况,探讨雌激素受体基因多个启动子区包括ERα（ERα-A,-B and-C）和ERβ甲基化与其表达异常的联系。方法应用RT—PCR检测6种白血病细胞株以5′-杂氮-2-脱氧胞苷（5′-Aza-Dc）去甲基化前后ER基因表达活性并应用甲基化特异性PCR技术（methylation specific PCR,MSP）检测10例正常人白细胞和6种白血病细胞株以5′-Aza-Dc去甲基化前后ER基因甲基化状态。结果ER各启动子在白血病细胞株中均出现甲基化或半甲基化带,但只有ERα-A基因表达沉默而且在正常人白细胞中呈未甲基化状态,在以5′-Aza-Dc处理细胞株后ERα-A基因表达恢复。结论白血病细胞的雌激素受体基因启动子区存在高甲基化现象并导致其基因表达沉默,可能为白血病的致病机制分析提供了一个新的方向,提示ERα-A基因启动子CPG岛的甲基化有可能成为白血病的新的参考标记物。     

白血病细胞雄激素受体基因启动子甲基化状态的研究

目的 检测白血病细胞雄激素受体基因启动子区CpG岛甲基化状态情况,初步探讨雄激素受体基因启动子区甲基化与白血病发病机制的可能联系.方法 应用甲基化特异性PCR技术(methylation specific PCR, MSP)检测3种白血病细胞株及15例患者骨髓标本雄激素受体基因甲基化状态.结果 白血病细胞株均出现甲基化和非甲基化带,呈部分甲基化状态,而作为对照的正常人白细胞均只出现非甲基化带.15例白血病患者全部检出甲基化状态. 结论 白血病细胞的雄激素受体基因启动子区存在高甲基化现象,可能为白血病的致病机制分析提供了一个新的方向,提示AR基因启动子CPG岛的甲基化有可能成为白血病的新的参考标记物.     

急性髓细胞白血病PRDX2基因表达及其甲基化研究

收集2010年6月至2011年6月我院血液科急性髓细胞白血病(AML)住院患者55例及对照组40例,采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)及甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法探讨PRDX2基因表达及PRDX2基因启动子区甲基化状态与基因表达缺失之间的关系,结果表明,PRDX2在AML患者中表达下降,其失表达与其启动子区甲基化有关,这一改变可能参与了疾病的进程,检测其表达情况在AML的诊治中可能具有一定的作用。     

SFRP5在白血病细胞中基因甲基化状态及蛋白表达分析

目的检测白血病患者标本及细胞系中分泌型卷曲相关蛋白5(SFRP5)基因启动子区域的甲基化状态及蛋白表达情况。方法甲基化特异性PCR(MSP)检测白血病患者及细胞系中SFRP5基因启动子区甲基化状态,亚硫酸盐测序PCR(BSP)方法检测KG1a细胞中SFRP5基因甲基化状态,Western blot方法检测SFRP5蛋白在白血病患者及细胞系中的表达。结果 12例白血病患者标本中有7例发生了SFRP5基因甲基化,6例正常对照标本均未发生SFRP5基因甲基化。4种白血病细胞系(HL-60、Raji、U937、KG1a)中均发生SFRP5基因甲基化。KG1a细胞中SFRP5基因启动子区-394 bp到+99 bp位点的CpG总甲基化频率为82.5%。白血病患者标本中有7例存在SFRP5蛋白表达,6例正常标本存在SFRP5蛋白表达,4种白血病细胞系中未检测到SFRP5蛋白表达。使用去甲基化试剂DAC处理4种白血病细胞系,结果均恢复SFRP5蛋白表达。结论白血病细胞中存在SFRP5基因启动子区甲基化,并导致SFRP5蛋白表达缺失或下调。     

应用焦磷酸测序法检测MEG3基因在急性髓系白血病中的甲基化状态

目的检测MEG3基因启动子区在急性髓系白血病(AML)患者骨髓细胞中的甲基化状态,并探讨其在AML中的临床意义。方法以54例初诊AML患者骨髓细胞标本为研究对象,11例缺铁性贫血患者骨髓细胞标本、10例健康人外周血标本为对照。常规提取DNA并用亚硫酸氢盐处理。然后用PCR扩增目标序列,采用焦磷酸测序法检测MEG3基因甲基化状态。结果 (1)MEG3基因的高甲基化状态与AML患者的年龄、性别、白细胞总数、血红蛋白量、血小板计数等指标及临床分型间均未发现显著相关性。(2)AML患者低甲基化5例,高甲基化49例,高甲基化的比例为90.7%(49/54);缺铁性贫血患者对照组低甲基化6例,高甲基化5例,高甲基化的比例为45.5%(5/11);而在正常人对照组低甲基化10例,无高甲基化者,高甲基化的比例为0%;AML患者甲基化状态明显高于另外两组,差异有统计学意义(P<0.05),缺铁性贫血患者对照组与正常人对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 MEG3基因启动子区的异常甲基化与急性髓系白血病的发生有关,对诊断、评价AML有一定意义。     

急性髓系白血病病人CDH13基因甲基化状态检测及其临床意义

目的:检测急性髓系白血病(AML)病人CDH13基因甲基化状态,探讨其与病人临床特征及预后的相关性.方法:用甲基化特异性PCR法分别检测34例AML病人(AML组)和22例非恶性肿瘤的缺铁性贫血病人(对照组)骨髓标本中CDH13基因启动子甲基化状态,用半定量反转录PCR法检测2组标本中CDH13 mRNA相对含量.AML组病人随访2年,统计总体生存时间.结果:AML组标本CDH13基因甲基化阳性率为61.76%,高于对照组的27.27%(P<0.05);AML组CDH13mRNA相对含量为0.355 ± 0.109,明显低于对照组的0.745 ± 0.271(P<0.01).不同性别、年龄以及临床分型AML病人的CDH13基因甲基化差异均无统计学意义(P>0.05).Kaplan-Meier生存曲线分析显示,CDH13基因甲基化阳性的AML病人总体生存时间为(12.4 ± 3.3)个月,明显短于甲基化阴性病人的(18.6 ± 4.1)个月(P<0.01).结论:AML病人中存在CDH13基因甲基化现象,检测CDH13基因表达水平有助于判断AML病人预后.     

无毛基因及其突变后引起的免疫学改变

无毛小鼠(hairless mice)是一种皮肤毛发结构表型性状发生遗传突变的小鼠,表现为被毛缺失或逐渐消失,包括有不同基因突变引起的多种类型,最早于1924年在伦敦的一家饲养场中偶然发现,当时认为是由野生型的Musmusculus突变所致。无毛小鼠不同于课鼠(nude mice,指一种先天性无胸腺无毛的裸体     

卡介苗ERP基因置换型打靶载体的构建

目的：构建ERP基因打靶载体。方法：卡介前菌体外培养,扩增ERP基因两侧序列．连接载体与目的片段．筛选阳性克降并鉴定。结果：PCR扩增捕入片段大小与预期相符．鉴定证实PCR产物及插入片段为所需目的基因片段。结论：成功构建了用于卡介苗菌基因打靶的置换型载体,为今后构建ERP基因敲除株的卡介苗突变株的研究奠定基础。     

A new gene ontology-based measure for the functional similarity of gene products

Background Although biomedical ontologies have standardized the representation of gene products across species and databases,a method for determining the functional similarities of gene products has no...     

PBL教学法在基因诊断及基因治疗教学中的应用?

分子生物学是现代医学的重要组成部分,其中基因诊断和基因治疗在临床医学中的应用越来越广泛。在这两个专题的教学中,如何帮助学生综合平衡分子生物学基础知识和前沿进展并加以灵活应用显得尤为重要。文章以遗传病“苯丙酮尿症”为典型案例,采用以问题为导向的教学方法( problem-based learning,PBL),综合了基因学、遗传学、氨基酸代谢、基因诊断、基因治疗等各章节的相关知识。通过结合具体案例,培养锻炼了学生自主思考和解决临床问题的能力,充分调动其学习积极性,同时对基因诊断和基因治疗等前沿技术加以掌握。     

Pax-8基因抑制后心肌细胞中UCP2的表达

目的 建立Pax-8基因敲除模型及Pax -8基因的体外干扰实验,探索心肌细胞中Pax-8基因抑制后解偶联蛋白2(uncouplingprotein 2,UCP2)基因表达的变化.方法 Pax-8基因敲除纯合子小鼠(Pax-8 KO-/-)为实验组,Pax-8基因敲除小鼠杂合子(Pax -8 KO+/-)和野生型(Pax-8KO+/+)为对照组;同时在体外实验的大鼠心肌细胞株中,加入Pax -8基因的小干扰RNA(Pax-8siRNA)为实验组,非特异性siRNA(NC siRNA)组和空白组为对照组.采用RT-PCR和Westernblotting技术测定UCP2的mRNA和蛋白质表达.结果 在Pax-8基因敲除动物模型中,与Pax-8基因敲除小鼠杂合子组和野生型组相比,实验组Pax-8基因敲除小鼠纯合子心脏组织UCP2的mRNA和蛋白表达均上调( P<0.05),而对照组之间差异无统计学意义(P>0.05);在体外干扰实验中的结果显示,与NC siRNA组和空白对照组比较,Pax-8siRNA组UCP2的mRNA表达和蛋白表达均上调(P<0.05),而NC siRNA组与空白对照组间差异无统计学意义(P>0.05).结论 Pax-8基因被抑制后,心肌细胞凋亡增加,UCP2基因表达上调,提示UCP2参与了心肌细胞凋亡的调控.     

多重耐药耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的红霉素耐药基因和PVL基因检测

目的 了解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌红霉素耐药基因和杀白细胞毒素基因的检出情况。 方法 收集MRSA 45株,采用聚合酶链式反应对45株MRSA的红霉素耐药基因ermA/B/C和杀白细胞毒素基因PVL进行检测。 结果 45株MRSA中有33株检出红霉素耐药基因,的检出率为73.3％;有12株检出杀白细胞毒素基因,检出率为26.7%。结论 多重耐药的MRSA中红霉素耐药基因ermA/B/C检出率较高,是MRSA对大环内酯类抗生素耐药的主要机制;杀白细胞毒素基因PVL检出率较高,是MRSA的重要致病因子。     

略论基因污染

在掌握了嫁接、杂交方法改造生命的手段后，人类进一步学会了应用基因技术改造生命。基因工程的飞速发展，不但为人类创造了巨大的利益，同时也埋下了无穷的隐患。一方面基因技术的生物安全性并未解决，一方面由于人类的急功近利甚至是见利忘义，造成基因污染的发生。目前基因污染已经在世界许多国家和地区发生，并且有进一步蔓延的趋势，防微杜渐，应该采取相关措施控制基因污染，以免给当代人和子孙后代造成难以挽回的灾难性后果。     

ALK-3、Pax-8基因抑制后大鼠心肌细胞中Smad1/5/8的表达

目的：抑制大鼠胚胎心肌细胞株中ALK-3、Pax-8基因的表达后,探索Smad1/5/8在其中所起的作用。方法：将H9C2（2-1）大鼠胚胎心肌细胞分为4组：针对Pax-8基因的小干扰RNA（Pax-8siRNA）组、ALK-3基因的小干扰RNA（ALK-3siRNA）组、阴性对照（NCsiRNA）组和空白对照组。前3组分别给予相应siRNA（5.0μL）和Lipofectamine2000（5.0μL）配制成的siRNA-脂质体复合物溶液,空白对照组给予等量的细胞培养基。采用qRT-PCR测定Pax-8和ALK-3的mRNA表达,Westernblot法检测磷酸化Smad1/5/8（p-Smad1/5/8）和半胱天冬酶（Caspase）-3表达。结果：与NCsiRNA组和空白对照组比较,Pax-8siRNA组的Pax-8mRNA表达分别下调50%（P＜0.05）和54%（P＜0.05）,ALK-3siRNA组的ALK-3mRNA表达分别下调49%（P＜0.05）和53%（P＜0.05）,而NCsiRNA组与空白对照组间差异无统计意义（P＞0.05）。与NCsiRNA组和空白对照组比较,ALK-3siRNA组p-Smad1/5/8的蛋白表达量分别下调58%（P＜0.05）和55%（P＜0.05）,Pax-8siRNA组p-Smad1/5/8的蛋白表达量差异无统计意义（P＞0.05）。NCsiRNA组与空白对照组间差异无统计意义（P＞0.05）。与NCsiRNA组和空白对照组比较,Pax-8siRNA组Caspase-3蛋白表达量分别上调76%（P＜0.05）和81%（P＜0.05）,ALK-3siRNA组Caspase-3的蛋白表达量分别上调135%（P＜0.05）和140%（P＜0.05）,而NCsiRNA组与空白对照组间差异无统计意义（P＞0.05）。结论：在大鼠胚胎心肌细胞株中对基因ALK-3、Pax-8干扰后能引起细胞凋亡蛋白Caspase-3明显增多,并且在ALK-3siRNA组发现Smad1/5/8蛋白磷酸化减少,而Pax-8siRNA组中未发现Smad1/5/8磷酸化减少,提示Smad1/5/8在基因ALK-3被干扰后引起细胞凋亡蛋白Caspase-3增多中起重要作用。     

RECK基因的研究进展

RECK基因是近年发现的新型基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂，研究表明，其可在转录后水平抑制多种MMP的表达，抑制肿瘤血管形成，从而抑制肿瘤的侵袭及转移。作者就RECK基因的研究进展作一综述。