五步蛇毒蛋白C激活剂在脓毒症大鼠早期适应性免疫应答中的作用

目的 探讨五步蛇毒蛋白C激活剂（PCA）在脓毒症大鼠早期适应性免疫应答中的作用。方法 采用SPF级SD大鼠78只,用随机数字表法分组：对照组（n=6,腹腔注射生理盐水）;通过腹腔注射脂多糖（LPS 10 mg/kg）复制脓毒症大鼠模型,模型组以LPS注射后4、6、8、12、16、24 h时的标本采集时间分为6组,6只/组;余36只大鼠于LPS注射30 min后使用药物干预,分为1-磷酸鞘氨醇受体1（S1PR1）激动剂SEW2871干预组（0.5 mg/kg,腹腔注射）和PCA干预组（0.1 mg/kg,腹腔注射）,各干预组以LPS注射后6、12、24 h时的标本采集时间分为3组,每组6只。采用ELISA法检测血浆IL-4、S1P、IL-12和IFN-γ水平,应用免疫荧光法检测肠系膜淋巴结S1PR1和CD103表达的变化。结果 与对照组比较,脓毒症大鼠在注射LPS后的24 h内,血浆S1P、IL-12、IL-4和IFN-γ水平明显增高（P<0.05）,LPS注射后6 h内IFN-γ/IL-4比值逐渐增高,之后逐渐降低;肠系膜淋巴结中S1PR1和CD103的表达明显增高（P<0.05）。SEW2871明显增加血浆S1P、IL-12和IFN-γ的浓度,降低血浆IL-4水平（P<0.05）,且明显减少淋巴结中S1PR1和CD103的表达（P<0.05）。蛇毒PCA干预后,血浆IL-4水平明显增高,淋巴结S1PR1表达显著增多（P<0.05）。结论 五步蛇毒PCA对维持脓毒症早期机体炎症和免疫反应的平衡具有调节作用,其机制可能与S1P-S1PR1通路有关。     

蛇毒蛋白C激活剂的研究进展

蛋白Ｃ（ＰｒｏｔｅｉｎＣ,ＰＣ）是一种血浆糖蛋白,为维生素Ｋ依赖性蛋白质,在血浆中以酶原形式存在。在内皮细胞表面凝血酶一血栓调节蛋白（ＴｈｒｏｍｂｉｎＴｈｒｏｍｄｒｉｄｕｌｉｎ,Ｔ－ＴＭ）复合物的作用下,它被激活为活化蛋白Ｃ（ＡｃｔｉｖａｔｅＰｒｏｔｅｉｎＣ,ＡＰＣ）,ＡＰＣ有催化蛋白水解作用,能快速而特异地降解血液凝血因子Ｖａ和Ⅷａ,抑制内、外源性凝血、从而产生强有力的抗凝效应。同时,ＡＰＣ也能中和组织型纤溶酶原活化物抑制物（ｔ－ＰＡＩ）,刺激血管内皮细胞释放组织型纤溶酶原激活物（ｔ－ＰＡ）,…     

蛇毒蛋白C激活物的初步研究

据报道 ,印度Ｋｌｅｉｎ等 (1986年 )率先从南美铜头蝮蛇 (ｓｏｕｔｈｅｒｎｃｏｐｐｅｒｈｅａｄｓｎａｋｅ -ＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎＣｃｏｎ ｔｏｒｔｒｉｘ)分离到一种蛋白酶 ,由于该酶能激活蛋白Ｃ(ＰｒｏｔｅｉｎＣ ,ＰＣ) .故Ｋｌｅｉｎ等把这种蛇毒蛋白酶称为蛋白Ｃ激活物 (ＰＣＡ .ｐｒｏｔｅｉｎＣａｃｔｉｖａｔｏｒ) [1] 。同年 ,瑞士Ｓｔｏｋｅｒ等也从这种南美铜头蝮蛇粗毒内分离、纯化到同样的ＰＣＡ ,并将它作为检测ＰＣ功能的试剂[2 ] 。在体内 ,蛋白Ｃ(ＰＣ)是一种维生素Ｋ依赖性蛋白质[3] 。在内皮细胞表面它能被凝血酶…     

发色底物测定法检测血浆蛋白C活性的实验研究

本研究从七种发色底物中筛选出二种发色底物:PenfchromA和PenfchromB,并采用蛇毒激活物Protac建立起特异、快速的人血浆蛋白C活性的比色测定新方法,用于临床标本的测定,取得满意效果。该方法试剂用量少,操作简便、迅速,结果稳定,适合于国内临床单位推广应用。     

蝮蛇毒蛋白C激活物的纯化与抗血小板活性

目的　研究蝮蛇毒蛋白C激活物 (PCA)组分对兔血小板聚集性的影响。方法　借助DEAE Cellulose、SP SephadexC 5 0及SP SephadexG 75柱层析 ,以离子交换和凝胶过滤法从江浙蝮蛇 (AHV)粗毒中分离纯化PCA抗凝组分 ;SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)检测其纯度和分子量。比浊法测定血小板聚集率。结果　从AHV分离纯化的PCA抗凝组分经SDS PAGE电泳测定为单一区带 ,相对分子质量为 14 0 0 0左右 ,等电点 pH 4 .7;该PCA在体外对由诱聚剂ADP诱导的血小板聚集呈剂量依赖性的抑制作用 ,其IC50 为 12 5 μg/ml。PCA(1.0mg/kg) 体内给药可逆性抑制血小板聚集反应。结论　从蝮蛇毒中纯化的这种PCA抗凝组分可通过抑制血小板聚集而影响血凝过程。     

蝮蛇毒蛋白C激活物对大鼠心肌微血栓形成的抑制作用

目的:观察蝮蛇毒蛋白C激活物(PCA)对大鼠心肌微血栓形成的影响,并进一步探讨其抗凝机制。方法:取健康雄性SD大鼠48只,随机分为假手术(SH)组、微血栓(MI)组、MI+PCA组和PCA组,其中MI+PCA组又分为1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg三个剂量组,每组8只。以月桂酸钠复制大鼠心肌微血栓模型,测定并比较各组血浆中PAF、ET-1、vWF、MDA的含量及SOD的活性;心肌石蜡切片,常规HE染色,光镜观察;观察心肌梗死范围。结果:MI+PCA(3mg/kg)组及MI+PCA(6mg/kg)组大鼠血浆中PAF、ET-1、vWF、MDA的含量较MI组显著降低(P<0.05);病理亦显示MI+PCA(3mg/kg)组及MI+PCA(6mg/kg)组心肌无微血管血栓形成、无梗死;PCA组与SH组各指标无明显差异。结论:PCA可有效抑制微血栓形成,其除了可通过激活蛋白C系统抗凝外,保护血管内皮亦可能是其另一抗凝途径。     

五步蛇毒PCA在心肌缺血再灌注损伤诊断中的实验研究

目的:探讨五步蛇毒蛋白C激活剂(Protein C activator,PCA)在心肌缺血再灌注损伤诊断中的应用。方法:SD大鼠随机分成对照组(control,C组)和缺血再灌注损伤组(Ischemia reperfusion injury,IR组),每组15只。IR大鼠开胸结扎左冠状动脉前降支30 min后再灌注120 min,C组大鼠只穿线而不结扎左冠状动脉前降支;记录大鼠在体心电图及心肌组织学改变。留取血液以制备血浆,检测其活化部分凝血酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT);以发色底物法检测血浆蛋白质C(Protein C,PC)活性;酶联免疫吸附法检测血浆游离蛋白质S(plasma free protein S,FPS)的含量。结果:同C组相比,IR组大鼠心肌横纹模糊不清或消失,肌纤维及肌丝明显紊乱且心电图改变明显;IR组大鼠心脏再灌注60 min后血浆APTT明显缩短(P<0.05),血浆PC活性缺血期间明显下降,再灌注60 min明显回升,而再灌注120 min又再次下降(P<0.01);血浆FPS含量缺血期间明显减少,再灌注60 min升高,再灌注120 min又减少(P<0.05,P<0.01)。结论:以五步蛇毒PCA制备的血浆蛋白C活性检测试剂可较灵敏地反映心肌缺血再灌注损伤大鼠血浆蛋白C活性的变化。     

蝮蛇毒蛋白C激活物对败血症大鼠心脏血流动力学的作用研究

目的:研究蝮蛇毒蛋白C激活物(PCA)组分对败血症大鼠心脏血流动力学的影响。方法:取SD雄性大鼠24只随机分成对照组、PCA组、LPS组和LPS+PCA组四组,对照组尾静脉注射生理盐水,PCA组尾静脉注射蝮蛇毒蛋白C激活物,LPS组腹腔注射LPS(10 mg/kg,4 h)的方法建立败血症休克的实验动物模型,在建立败血症的实验动物模型的基础上,尾静脉注射PCA(0.4 mg/kg)为LPS+PCA组,每只大鼠均于药后30 min时运用Medlab生物信号采集处理系统记录平均动脉压(MAP)和左心室功能指标,并测定心肌中乳酸脱氢酶(LDH)活性、诱导性一氧化氮合酶(i NOS)活性及心肌病理切片。结果:PCA能明显减轻LPS诱导的心功能受损,并抑制心肌LDH的释放和i NOS活性的升高(P<0.05)。结论:PCA对败血症大鼠心脏血流动力学有明显的改善作用,其机制可能与通过保护血管内皮功能,改善微循环,稳定心肌酶活性和膜相结构等途径有关。     

关于温度影响酶活性因素实验流程的再设计

酶活性的大小受多方面因素影响，其中温度是影响酶活性的重要因素之一，也是中专生化实验中验证影响酶活性因素的主要定性实验之一。笔者根据多年的实验教学经验对实验流程进行再设计，同时通过进一步实验，验证出酶的另一性质，收到了良好的教学效果。     

Purification and characterization of anti-clotting protein component （ACPF-7221） from venom of Agkistrodon acutus

Background Snake venom contains a number of components with different pharmacological and biological activities, especially in cancer therapy, and has increasingly become a research focus. This study was designed to isolate and purify a novel anti-clotting protein component from the venom of Agkistrodon acutus, and to explore its physico-chemical properties and biological activity. Methods The venom of Agkistrodon was isolated and purified by ion-exchange chromatography on diethylaminoethyl （DEAE）-Sepharose Fast Flow, molecular sieve filtration through Sephadex G75, SP-Sepharose Fast Flow and molecular sieve filtration through Sephadex G50. We detected the activated partial thromboplastin time （APTT） of the eluant to select the anti-clotting protein component of interest. The molecular weight was determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamid gel electrphoresis （SDS-PAGE） and liquid chromatography. Its protein content was detected by bicinchoninic acid （BCA）. Results SDS-PAGE vertical gel electrophoresis showed that the anticoagulant factor is a tripolymer composed of three proteins whose molecular weights are 25 KDa, 30 KDa and 50 KDa. The factor contains about 65% percent protein. Conclusions A novel anti-clotting protein component was purified by ion-exchange chromatography and molecular sieve filtration from the venom of Agkistrodon acutus and was found to be composed of three kinds of proteins.     

尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入Hela细胞的影响

目的：观察刚地弓形虫速殖子在来源于安徽省南部地区的尖吻蝮蛇蛇毒的作用下侵入Hela细胞的数量，探讨尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入Hela细胞的作用。方法：以不同浓度尖吻蝮蛇毒加入分孔培养的细胞中，于不同时间观察感染弓形虫速殖子细胞的数量。结果：尖吻蝮蛇蛇毒对弓形虫速殖子侵入细胞有明显的促进作用，弓形虫速殖子在蛇毒的作用下在同一时间内对宿主细胞侵入的数量均高于对照组(P＜0．05——P＜0．01)，但不同剂量的尖吻蝮蛇毒对弓形虫速殖子侵入细胞的作用差异无显著性(P＞0．05)。5．0μg/ml和0．25μg/ml的剂量分别比对照组平均提高了125．49％和81．37％。结论：尖吻蝮蛇毒可以明显增加弓形虫速殖子对宿主细胞的感染率。     

尖吻蝮蛇毒小分子多肽对人胃癌细胞株SGC-7901的抑制作用

目的探讨尖吻蝮蛇毒小肽对体外培养的人胃癌SGC-7901细胞株的增殖抑制作用及作用机制。方法用MTT法观察尖吻蝮蛇毒小肽对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响；采用光镜、电镜观察细胞形态及超微结构变化；荧光染色法测定和观察尖吻蝮蛇毒小肽对SGC-7901细胞凋亡影响；采用结晶紫染色法测定尖吻蝮蛇毒小肽对SGC-7901与FN黏附作用的影响。结果MTT显示尖吻蝮蛇毒小肽呈剂量与时间依赖性抑制人胃癌SGC-7901细胞株的增殖，电镜观察给药组细胞出现明显凋亡，荧光显微镜下可见细胞形态发生改变，尖吻蝮蛇毒小肽对SGC-7901细胞在FN基质上的黏附有一定的抑制作用，并呈浓度依赖关系。结论尖吻蝮蛇毒小肽对体外培养的人胃癌SGC-7901细胞株有较显著的抑制作用，该作用与诱导细胞凋亡和抑制细胞和细胞外基质黏附的能力有关。     

蝮蛇毒PCA抗血栓形成的实验研究

目的：探讨皖南产蝮蛇毒（AHV）蛋白质C激活物（Protein C Activator,PCA）组分抗血栓效应。方法：家兔40只,随机分为4组,每组10只,颈总动脉取l ml注入血栓形成仪4个（硅化）聚乙烯管中,各管中分别含50、30、10μl（0.6216 mg/ml）蝮蛇毒PCA组分及50μl生理盐水,37℃条件下以16 r/min在恒流泵上旋转制备血栓;SD大鼠60只,随机分为假手术（SH）组、心肌梗死模型（MI）组（月桂酸钠左心室注入造模）、PCA干预组（MI＋PCA组分为0.5 mg/kg、2 mg/kg、8 mg/kg 3个剂量组）、阳性对照组（阿司匹林5mg/kg）,每组10只,各实验组动物均于术后3 h颈总动脉取血,按同样方法制备血栓;血液离心,分离血浆检测凝血功能。结果：蝮蛇毒PCA组分大、中、小3剂量组与对照组相比较,血栓的干、湿重量及长度均比对照组减轻（P〈0.05）;MI＋PCA组（2 mg/kg、8 mg/kg）与MI组比较,血栓的干、湿重量长度均有明显差异（P〈0.05）,与阳性对照组无差异（P〉0.05）;MI＋PCA组（2 mg/kg、8 mg/kg）与MI组比较,PT、APTT均明显增高（P〈0.05）,FIB显著降低（P〈0.05）,TT差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：AHV粗毒中分离纯化的PCA组分可明显干预血栓的形成,其可能通过PCA激活蛋白质C（Protein C）改变凝血功能。     

尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序

目的 测定Agacutin两个相近亚基的N端15个氨基酸残基序列,酶分子的2个亚基需拆分以获得亚基单肽链并测序.方法 通过生物化学方法获得高纯化Agacutin,经SDS-PAGE电泳分离、亚基胶条回收及PVDF膜电转移技术等方法制备了可供鉴定和测序的单亚基样品,后者通过Edman降解法,测定了亚基N端15个氨基酸残基序列.结果 大亚基(16 kDa)的序列为:DCSSGWSSYEEHQYY,小亚基(15kDa)序列为DSSGWSSYEGHEYYV.结论 测序结果经NCBI数据库检索发现,Agacutin为新的蛇毒类凝血酶.     

蛇毒激肽原酶对大鼠脑缺血再灌注的作用及机制

目的：探讨蛇毒激肽原酶对脑缺血再灌注大鼠的缺血区脑组织的保护作用及机制．方法：将实验动物随机分为假手术组、生理盐水对照组和治疗组．治疗组在大鼠脑缺血再灌注后8h,腹腔注射蛇毒激肽原酶17．5U／（kg·d）,连续注射3d．于术后第3日行神经功能缺失评分（NSS）,然后处死大鼠行梗死体积（TTC染色）的计算、缺血区的病理改变（HE染色）的检查以及缺血区神经细胞情况（尼氏染色）的检查,同时检测缺血区NSE,GFAP及vWF的免疫组化情况．结果：在大鼠脑缺血再灌注后8h,给予蛇毒激肽原酶治疗能明显降低大鼠的神经功能缺损,使大鼠的梗死体积变小,病理改变明显减轻,缺血区的尼氏染色结果得到明显的改善．治疗组脑缺血区的NSE,GFAP及vWF免疫组化的阳性细胞增多,与生理盐水对照组比较有明显差异（P〈0．05）．结论：蛇毒激肽原酶对脑缺血再灌注大鼠的缺血区脑组织有保护作用;促进缺血区神经细胞的再生以及神经胶质细胞、血管内皮细胞增生为其重要机制之一．     

蝮蛇蛇毒PCA对实验性心肌梗死大鼠血凝状态的影响

目的:探讨蝮蛇蛇毒蛋白C激活剂(PCA)对心肌梗死发生后血液凝固性的影响及其机制。方法:SD大鼠24只,随机分为对照组、心肌梗死模型组和PCA实验组。动物麻醉后,从心尖部向左心室注射月桂酸钠(1.0mg/kg)复制心肌梗死(AMI)模型。实验组大鼠于造模前由舌下静脉注射PCA(1.0mg/kg)预处理,由Medlab生物信号采集系统监测心电变化。于造模后30min从颈总动脉取血样2ml,以TEG5000型血栓弹力仪测量各样本血液的凝血时间、血凝块形成时间、Alpha角度、凝血最大幅度和凝血指数等参数。结果:模型组大鼠血样的R值较对照组明显缩短(P<0.01),CI值>+3.0,而Alpha角度变化不大;LY30%值明显增大,但小于7.5%。PCA实验组大鼠血样的R值较模型组明显延长,MA值减小(P<0.05),LY30%、A值、CI值明显减少(P<0.01)。结论:心肌梗死大鼠血液表现显著高凝状态,蛇毒PCA组分的预处理可以减轻这一过程。