Ad5F35-LMP2重组腺病毒免疫效果的研究

目的了解含有EB病毒潜伏膜蛋白2的非复制型重组腺病毒(Ad5F35-LMP2),免疫恒河猴的特异性细胞和体液免疫的效果。方法分别使用高剂量(1.5×1010TCID50/只)、中剂量(1.5×109TCID50/只)、低剂量(1.5×108TCID50/只)Ad5F35-LMP2重组腺病毒,同时设对照组(PBS4.0ml/只)。肌内注射免疫恒河猴,每个月一次,共免疫3次,第0、4、8、12周时使用Elispot方法检测猴外周血EBV-LMP2细胞毒性T细胞应答,同时应用免疫酶方法检测血清中LMP2抗体。结果3个剂量Ad5F35-LMP2腺病毒免疫恒河猴均可以诱导出有效的细胞免疫应答及一定的抗体应答,免疫应答水平的高低与病毒剂量的高低有一定的关系,较高剂量产生的细胞及体液免疫应答水平比低剂量的高。结论Ad5F35-LMP2非复制型重组腺病毒疫苗可以有效的诱导恒河猴产生EBV-LMP2特异性细胞和体液免疫反应。     

Ad5F35-LMP2重组腺病毒修饰DC体内特异性抗瘤作用的研究

目的 了解含有EB病毒潜伏膜蛋白2的非复制型重组腺病毒（Ad5F35-LMP2）修饰的DC能否在体内抑制肿瘤细胞生长.方法 人外周血单个核细胞在细胞因子IL-4、GM-CSF和TNF-a诱导下生成树突状细胞.将人的外周血单个核细胞移植入实验组SCID小鼠体内2次,再分别经两次DC与Ad5F35-LMP2-DC免疫SCID小鼠,然后用1×10^6的CNE-2肿瘤细胞接种SCID小鼠皮下,观察肿瘤生长情况.结果 Ad5F35-LMP2-DC组肿瘤的潜伏期明显延长,对照组和DC组小鼠1周左右就出现了肿瘤,而Ad5F35-LMP2-DC组则直到2周左右才出现肿瘤;且肿瘤体积最小,重量最轻,与DC组比Ad5F35-LMP2-DC疫苗组的肿瘤抑制率为64.75%.结论 Ad5F35-LMP2重组腺病毒疫苗修饰的DC在体内可以有效的抑制NPC肿瘤细胞CNE-2生长.     

Ad5F35-LMP2重组腺病毒修饰DC体外诱导特异性T细胞免疫的研究

目的 了解含有EB病毒潜伏膜蛋白2的非复制型重组腺病毒(AdSF35-LMP2)修饰的DC能否在体外诱导LMP2特异性细胞毒性T淋巴细胞免疫.方法 人外周血单个核细胞在细胞因子诱导下生成树突状细胞,Ad5F35-LMP2感染树突状细胞后激发同源的T细胞,MTT法检测其对T细胞的增殖作用,及激活的特异性CTL对表达LMP2的人CNE-2细胞的特异性杀伤效应.结果Ad5F35-LMP2能有效感染树突状细胞.其激活的特异性CTL对CNE-2细胞有特异性杀伤活性,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论 重组腺病毒Ad5F35-LMP2感染的DC可以有效的诱导产生EBV-LMP2特异性细胞毒效应.     

小鼠noggin基因的重组腺病毒构建与鉴定

目的：构建小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法：采用基因工程技术。经过2次亚克隆将 noggin 基因片段克隆至穿梭质粒 AdTrack-CMV 上,利用 pAdEasy-1系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染 293T 细胞包装、扩增。采用 PCR 方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白 GFP 报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果：酶切鉴定及 PCR 结果证明 noggin 基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达6．3×10~(10)pfu/ml。结论：应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体。     

人Wilms瘤基因1重组腺病毒Ad5/F35的制备及感染树突状细胞后的鉴定

目的构建人Wilms瘤基因1(WT1)重组腺病毒载体Ad5/F35并鉴定。方法运用不同病毒滴度的Ad5-EGFP和Ad5/F35-EGFP感染黑素瘤患者外周血树突状细胞(DC),用荧光显微镜检测EGFP的表达,选择对DC感染率高的腺病毒;同源重组构建Ad5/F35-WT1腺病毒载体,用免疫细胞化学和流式细胞术(FCM)检测WT1的表达。结果在相同滴度下,腺病毒载体Ad5/F35的感染优于Ad5;成功构建了Ad5/F35-WT1重组腺病毒,免疫细胞化学染色和FCM证实该病毒能有效介导WT1在DC中的表达。结论 Ad5/F35-WT1重组腺病毒能将WT1基因成功导入DC并有效表达。     

构建重组腺病毒的新策略

重组腺病毒作为基因载体具有很多优越性，因此极大地引发了人们的研究兴趣．构建第一代和第二代腺病毒的方法各式各样，大体上可分为两类：一类是DNA直接在哺乳动物细胞内进行重组，另一类是先在细菌中构建好病毒DNA再转染哺乳动物细胞．而第三代腺病毒因缺失了大部分的病毒基因，构建时需要辅助病毒．几年前，腺病毒的构建还是一项耗时费力的工作，现在已经有了许多优化构建过程的新策略。     

汉滩病毒G1S0.7嵌合基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的在本室前期工作的基础上构建汉滩病毒M基因G1片段与S基因0.7kb片段嵌合基因的重组腺病毒。方法构建含有汉滩病毒G1S0.7嵌合基因的转移载体pShuttle-G1S0.7,然后通过特异性的酶切将嵌合基因与腺病毒DNA相连,电转化E.coli JM109,获得重组腺病毒Adeno-G1S0.7 DNA,转染HFX293细胞得到重组腺病毒。进一步对重组腺病毒的滴度和表达产物进行鉴定。结果构建的含G1S0.7嵌合基因的重组腺病毒,滴度可达10^13～10^15 PFU／L;该重组腺病毒感染Vero-E6细胞后,表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1的特异性单抗（mAb）所识别的融合蛋白。结论利用腺病毒表达系统,成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G1生物学活性的融合蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

乙型肝炎病毒X基因重组腺病毒的构建及在HepG2细胞中的表达

从携带有双拷贝乙肝病毒adw亚型全基因组的质粒pecob6获得X基因片段,将其亚克隆到AdEasy腺病毒系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,和骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd-X,PacI酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增,获得重组腺病毒Ad-X,Ad-X可感染HepG2细胞,Western-blot法检测到X蛋白的表达,重组腺病毒Ad-X构建成功,为进一步研究X蛋白的生物学功能奠定了基础。     

丙型肝炎病毒核心基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达

目的构建HCV C基因重组腺病毒，以期用于HCV C蛋白的功能研究。方法以含有丙肝病毒1b亚型核心基因的质粒pcDNA3.1／HCV-C为模板，PCR扩增HCV C基因，PCR产物双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上，与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组，获得重组腺病毒质粒pAd-C，PacⅠ酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装，获得重组腺病毒Ad-C，继之在293细胞内扩增，利用报告基因GFP监测病毒滴度和感染效率，Western blot检测HCV C蛋白的表达。结果PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒Ad-C构建成功。结论成功构建了重组腺病毒Ad-C，为进一步研究核心蛋白的生物学功能奠定了基础。     

重组腺病毒Ad5F35-IL-12感染不同单核-巨噬细胞的研究

目的 确定人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12在不同人单核-巨噬细胞中的表达.方法 将人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12分别感染人外周血单个核细胞、胸水巨噬细胞,以及THP-1和U937单核细胞株及其经佛波酯(PMA)诱导后生成的巨噬细胞;感染48 h后荧光显微镜观察对相应细胞的感染效率,RT-PCR检测IL-12双亚基p35和p40的mRNA表达情况,ELISA检测细胞培养上清中IL-12p70的分泌水平.结果 人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12可成功感染人外周血单个核细胞、胸水巨噬细胞以及THP-1和U937单核细胞株及其PMA诱导后生成的巨噬细胞,并分泌IL-12 p70蛋白,蛋白表达量从高至低依次是胸水巨噬细胞、PMA诱导后U937细胞、PMA诱导后THP-1细胞、U937细胞、外周血单个核细胞、THP-1细胞.结论 人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12可以感染不同的单核-巨噬细胞,并成功表达分泌IL-12 p70蛋白.     

弹性蛋白酶特异性抑制因子elafin基因重组腺病毒载体的构建、鉴定与表达

目的：构建elafin基因高效表达重组腺病毒载体Ad-elafin。方法：抽提人肺总RNA进行逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）扩增elafin基因，PCR产物双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上；在BJ5183细菌内与pAdEasy-1同源重组，筛选阳性克隆，酶切、PCR及测序鉴定；PacⅠ酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装，获得腺病毒载体Ad-elafin；继之在293细胞内扩增，利用报告基因GFP监测病毒滴度和感染效率，Western blot检测elafin蛋白的表达，ELISA鉴定elafin蛋白对弹性蛋白酶活性拮抗作用。结果：酶切、PCR、蛋白表达测定及拮抗弹性蛋白酶活性初步鉴定证实弹性蛋白酶特异性抑制因子elafin基因重组腺病毒载体Ad-elafin构建成功。结论：成功构建了重组腺病毒载体Ad-elafin，为进一步深入研究慢性阻塞性肺疾病的发病机制奠定了技术基础。     

人呼吸道合胞病毒融合糖蛋白非复制型重组腺病毒的构建和表达

目的 构建含有A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,RSV)融合糖蛋白(Fusion glycoprotein,F)基因的非复制型第一代重组腺病毒(First generation odenovirns vector,FGAd),并研究F基因在重组腺病毒中的表达.方法 利用限制性内切酶Xho Ⅰ和HindⅢ从质粒pGEM3zf-F中切下目的 基因F,克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,再与pAdeaRy-1在大肠埃希菌BJ5183中进行同源重组,鉴定正确后,用脂质体法转染293细胞,Western Blot鉴定目的 基因表达.结果 获得了表达RSV F基因的非复制型重组腺病毒FGAd/F,Western Blot检测到F基因的表达.结论 获得一株可表达A亚型BSV F的非复制型重组腺病毒FGAd/F,可用于体内研究观察其免疫效果及免疫保护作用.     

TR基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 :构建含人硫氧还蛋白还原酶 (TR)基因的重组腺病毒载体 ,探讨TR的抗氧化功能与神经退行性疾病的相关性。方法 :从重组质粒pGEM TR上用内切酶切下编码 5 0 0个氨基酸的全长TRcDNA片段 ,并连接穿梭质粒pShuttle,再双酶切pShuttle TR。将带有CMV启动子的目的片段 ,插入E1、E3缺失的Adeno X病毒DNA中 ,以Adeno TRDNA通过脂质体转染HEK2 93细胞 ,获得重组腺病毒Adeno TR进行PCR鉴定及病毒滴度测定。用重组腺病毒感染CV1细胞 ,通过免疫荧光染色与Westernblot分别检测重组腺病毒感染的细胞上和裂解液中TR蛋白的表达。结果 :重组腺病毒Adeno TR的病毒滴度为 4 .4× 10 11pfu/L。PCR、荧光显微镜证实 ,以及Westernbolt分析 ,在相对分子质量 (Mr)约 5 5 0 0 0处均出现特异性条带。结论 :成功地构建了重组腺病毒载体 ,并能介导外源基因TR表达 ,为进一步研究TR的功能及其与疾病的相关性奠定了基础。     

大鼠Toll样受体2基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建特异性抑制大鼠TLR2基因的重组腺病毒载体,并在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中进行功能鉴定。方法:体外合成3对大鼠siTLR2的双链DNA序列,经退火定向克隆到穿梭质粒pSES-HUS中获得pSES-HUS-siTLR2质粒,Pme I线性化后在BJ5183细菌中与pAdEasy-1骨架质粒进行同源重组获得pAd-siTLR2质粒,脂质体转染HEK293细胞,包装获得Ad-siTLR2腺病毒颗粒,继而感染PC12细胞,通过Real-time PCR和Western blot方法检测3对siRNA对TLR2基因的抑制效率。结果:PCR凝胶电泳和测序结果均证实目的基因正确克隆到腺病毒载体中;Real-time PCR和Western blot结果显示:携带siTLR2的病毒颗粒能够在mRNA和蛋白水平有效抑制PC12细胞中TLR2的表达。结论:成功构建了Ad-siTLR2重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,转染PC12细胞后能有效抑制TLR2基因的表达,为进一步研究TLR2在不同疾病中的免疫调节机制奠定重要基础。     

1人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体.方法 以pUCm-TLR4质粒为模板,运用PCR技术扩增TLR4胞外区目的 基因片段,片段回收后经酶切连接穿梭质粒pAdTrack-CMV上,获得重组腺病毒质粒pAdTrack-CMV-TLR4.通过Kpn Ⅰ和HindⅢ双酶切,测序鉴定后,将鉴定正确的质粒经PmeⅠ酶切线性化后,转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态细菌BJ5183中,进行同源重组,卡那抗性筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR技术,Western blot等方法鉴定重组腺病毒,并进行病毒滴度测定.结果 人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体构建正确,病毒滴度为3.2×109pfu/mL.结论 成功构建了人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体,为下一步实验奠定基础.