骨髓瘤细胞诱导破骨前体细胞分化的分子机制探讨

目的探讨人骨髓瘤细胞RPMI8226诱导破骨前体细胞分化的分子机制。方法采用RT-PCR和Western blot-ting法检测RPMI8226细胞能表达核因子κB受体活化因子配基(receptor activator of NF-κB Ligand,RANKL)蛋白和RANKL裂解酶(TACE、ADAM19)mRNA表达。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)细胞化学染色鉴定成熟破骨细胞。利用重组人RANKL蛋白(rhRANKL)、条件培养液和人抑制性RANKL单克隆抗体(RANKL mAb)参与培养,诱导RAW264.7细胞分化为成熟破骨细胞。结果 Western blotting法证实RPMI8226细胞表达跨膜型和可溶型RANKL(mRANKL,sRANKL)。RT-PCR法证明RPMI8226细胞表达RANKL、RANKL裂解酶和TRAP mRNA。TRAP染色观察RPMI8226细胞、MG-63细胞条件培养液与rhRANKL均能明显诱导RAW264.7细胞分化为TRAP阳性多核成熟破骨细胞。RT-PCR法证实此3组能刺激RAW264.7细胞上调TRAP mRNA表达。TRAP染色和TRAP mRNA表达中发现RANKL mAb能阻断RPMI8226细胞条件培养液和rhRANKL诱导的破骨前体细胞分化成熟作用。结论骨髓瘤RPMI8226细胞能表达RANKL,其条件培养液可能含sRANKL,能使RAW264.7细胞分化成TRAP阳性多核成熟破骨细胞。     

电离辐射对破骨细胞分化过程中RANK表达的影响及其致骨损伤的分子机制

目的：研究电离辐射对破骨细胞分化过程中核因子κB受体活化因子(RANK) mRNA和蛋白表达的影响,探讨辐射导致骨损伤的分子机制。方法：采用50 μg•L-1 核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞。RQW264.7细胞分为对照组(未处理)、RANKL处理组(50 μg•L-1RANKL处理)、照射处理组(2 Gy γ射线照射)、照射联合RANKL处理组(50　μg•L-1RANK处理+2 Gy γ射线照射)。采用抗酒石酸磷酸酶(TRAP）染色法检测各组破骨细胞的分化状态;采用PCR法检测各组细胞中RANK mRNA的表达水平;采用Western blotting法检测各组细胞中RANK蛋白的表达水平。 结果：RAW264.7细胞经过RANKL诱导7 d后,TRAP染色呈现阳性,表明已经成功分化成为破骨细胞。与对照组比较,RANKL处理组和照射处理组破骨细胞前体细胞中RANK mRNA和蛋白的表达水平上调（P<0.05）;与RANKL处理组比较,照射联合RANKL组破骨细胞前体细胞中RANK mRNA和蛋白表达水平降低（P<0.05）。结论：电离辐射可以促进破骨细胞前体细胞的增殖和成熟,增加其活性,但是对破骨细胞的增殖、成熟与活性却有一定的抑制作用。
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抗坏血酸抑制核因子κB受体活化子配体诱导RAW264.7细胞的分化和功能

目的研究抗坏血酸对核因子κB受体活化子配体(RANKL)诱导体外培养的破骨前体细胞RAW2647形成成熟多核破骨细胞的影响,探讨抗坏血酸在破骨前体细胞分化中的作用及机制。方法利用不同浓度的抗坏血酸与RANKL单独或共同处理RAW2647细胞,MTT法测定细胞增殖,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法观察TRAP阳性多核细胞,逆转录聚合酶链反应(RTPCR)测定破骨细胞表型基因和功能基因的表达,Western印迹方法检测碳酐酶Ⅱ基因蛋白表达,破骨细胞的骨吸收功能用骨吸收陷窝面积计数法分析。结果抗坏血酸和RANKL都抑制RAW2647细胞的增殖(P<005),但它们之间无协同作用。抗坏血酸本身不能诱导RAW2647细胞形成破骨细胞,但可抑制RANKL诱导的TRAP阳性多核破骨细胞形成(P<005)。抗坏血酸下调RANKL诱导的碳酐酶Ⅱ和RANK基因mRNA表达及碳酐酶Ⅱ基因蛋白表达,抑制骨吸收功能(P<005)。结论抗坏血酸能直接抑制RANKL诱导的破骨细胞形成和功能。     

细菌脂多糖对破骨细胞发育的抑制作用研究

目的:寻找调节破骨细胞分化成熟的途径.方法:采用细胞核因子-KB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)体外诱导骨髓单核细胞分化为成熟破骨细胞的培养方法,在培养体系中加入不同浓度细菌脂多糖(LPS),用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察成熟破骨细胞形成情况;实时定量RT-PCR检测LPS处理后破骨细胞前体表达核因子-κB受体活化因子(RANK)和M-CSF受体mRNA.结果:LPS不能刺激骨髓单核细胞形成TRAP阳性的破骨细胞;减少了RANKL诱导的TRAP阳性破骨细胞形成数量;0.2ng/ml和20ng/ml LPS降低了30％和90％RANKL诱导TRAP阳性细胞形成数量(与未加LPS组比较,均P＜0.01);降低破骨细胞前体表达RANK和M-CSFR mRNA.结论:LPS能够抑制RANKL诱导的破骨细胞分化成熟,抑制破骨细胞前体表达RANK和M-CSFR,能够阻断其向成熟分化.     

白细胞介素29抑制破骨细胞分化的研究

目的:新型细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-29具有抗病毒?抗肿瘤?免疫调节等作用,但其在破骨细胞分化中的作用尚未见报道?本研究探讨IL-29对核因子κB受体活化因子配基(receptor activation of nuclear-κB ligand,RANKL)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7(破骨前体细胞)向破骨细胞分化的作用?方法:流式检测IL-29特异性受体IL-28Rα在RAW264.7细胞表面的表达,CCK8法检测IL-29对RAW264.7细胞增殖的影响?不同浓度IL-29重组因子加入到RANKL诱导的RAW264.7向破骨细胞分化的体系中,5 d后通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测IL-29对破骨细胞数目的影响?实时荧光定量PCR检测IL-29对破骨细胞标志性基因TRAP?CTR?CTSK及相关基因TRAF6?RANK表达的影响?结果:IL-29呈剂量依赖性抑制RANKL诱导的RAW264.7中破骨细胞的形成,100 ng/mL IL-29可显著抑制破骨细胞的形成以及破骨细胞形成相关基因TRAP?CTR?CTSK?TRAF6?RANK的表达?结论:本研究首次证实IL-29可以抑制破骨细胞形成及其功能?     

促甲状腺激素对破骨细胞分化的影响

目的 探讨促甲状腺激素(TSH)对小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞诱导分化为破骨样细胞过程的影响.方法 体外培养小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞,以破骨细胞分化因子(RANKL)诱导分化,同时加用不同浓度TSH处理7d,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定并计数阳性细胞数量,采用Real-time PCR方法检测分化标志蛋白TRAP、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及组织蛋白酶K(Cathepsin K)的基因表达.结果 RAW264.7细胞可在RANKL诱导下分化为破骨样细胞,高表达TRAP、MMP-9和Cathepsin K基因,TSH可剂量依赖性抑制细胞分化并下调上述基因的表达.结论 TSH可抑制破骨细胞的分化,对于维持骨量可能具有重要作用.     

小鼠单核细胞RAW264．7的细胞生物学特征

目的观察小鼠单核／巨噬细胞RAW264．7的一般细胞生物学特征。方法用倒置相差显微镜观察细胞的形态特征，胎盘蓝染色细胞计数，绘制细胞生长曲线。半定量逆转录聚合酶链反应观察细胞3～2l天破骨细胞表型和功能基因表达谱变化。结果RAW264.7细胞形态以类圆形和不规则多边形为主，一般含l～2个核，有伪足，细胞胞体较小。细胞生长快，5～6天可汇合。RAW264．7细胞能表达成熟破骨细胞的表型标志基因如核因子KB受体活化子（RANK）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、基质金属蛋白酶9（MMP9）及骨吸收有关的功能基因如组织蛋白酶K（CaK）、整合素av（integrin av）等。RAW264。7细胞培养3～21天，上述基因的mRNA表达不随培养时间改变。结论RAW264．7具有破骨细胞特征性基因表达谱，是一种较好的破骨前体细胞模型。     

结核分枝杆菌裂解物诱导破骨细胞及OPG／RANKL表达变化实验研究

目的探讨结核分枝杆菌超声裂解产物（Mt sonicate）体外诱导小鼠破骨细胞的形成及 OPG/RANKL表达变化与裂解物的浓度、时间的依赖性,研究结核杆菌引起骨破坏的相关机制。方法原代培养的 BALB/c小鼠骨髓基质细胞以高、中、低浓度的 Mt sonicate进行干预,在1、3、7、14 d进行 TRAP染色,观察破骨细胞的形成,并采用 Realtime RT-PCR检测各浓度、时间的骨保护素（OPG）/核因子Kappa B受体活化因子配基（RANKL）mR-NA表达。结果 Mt sonicate在体外可诱导小鼠骨髓基质细胞向破骨细胞的转化;破骨细胞数量与 Mt sonicate浓度在3、7 d时呈显著的正相关（3 d：r＝0．417,P ＜0．05;7 d：r＝0．463,P ＜0．05）;3个浓度干预下,破骨细胞数量在1～7 d逐渐增多,7～14 d则逐渐减少。7 d时,高、中、低浓度 Mt sonicate干预下 OPG/RANKL mRNA表达比分别为（1．35±0．11）、（7．38±1．15）、（9．85±1．26）。结论小鼠骨髓基质细胞向破骨细胞转化的实验中,存在结核分枝杆菌裂解物的浓度和时间依赖性,且与 OPG/RANKL mRNA的表达比呈负相关,破骨细胞形成时的数量与活性受到结核分枝杆菌的调控,其分子机制与 OPG/RANKL系统的变化密切相关。     

晚期糖基化终末产物对破骨细胞分化不同阶段的影响

目的 探究晚期糖基化终末产物（AGEs）对破骨细胞分化不同阶段的影响。方法 利用核因子κB受体活化因子配体（RANKL）于体外诱导小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞进行破骨细胞向分化,通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色确定破骨细胞分化的不同阶段,并将细胞随机分为对照组、分化早期阶段干预组、分化晚期阶段干预组;用CCK-8法检测AGEs作用下的细胞活性;破骨细胞向诱导完成后进行TRAP染色,以RT-PCR 检测RANK、NFATC-1、TRAF-6、TRAP、CTSK的mRNA表达,以Western blot检测CTSK及RANK的蛋白表达。结果 将Raw264.7细胞破骨细胞向分化的前3 d划分为细胞分化早期阶段,之后为细胞分化晚期阶段;100 mg/L的AGEs对Raw264.7细胞的生长无明显影响;早期阶段干预组及晚期阶段干预组的TRAP染色阳性细胞数量均多于对照组,早期阶段干预组与对照组的差异具有统计学意义（P<0.05）;早期阶段干预组及晚期阶段干预组的RANK、NFATC-1、TRAF-6、TRAP、CTSK的mRNA表达均多于对照组,早期阶段干预组与对照组的差异具有统计学意义（P< 0.05）;CTSK及RANK的蛋白表达趋势与相关mRNA表达变化趋势一致。结论 AGEs可能对破骨细胞分化的不同阶段产生不同影响,AGEs于破骨细胞分化早期阶段加入对其分化的促进作用比在晚期阶段加入更明显。     

体外紫云英苷抑制小鼠BMM细胞向破骨分化

目的 研究紫云英苷对小鼠骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage, BMM)向破骨细胞分化的影响。方法 从C57BL/6小鼠的股骨与胫骨骨髓腔中提取小鼠BMM细胞,并使用含核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)和梯度浓度的紫云英苷(0、50、100、200μmol/L)的培养基培养5~7天,通过TRAP染色、共聚焦荧光染色与RT-PCR检测BMM细胞向破骨细胞分化的水平。结果 培养5~7天后,TRAP染色与F-actin环检测显示紫云英苷显著抑制了RANKL诱导下小鼠BMM细胞向破骨细胞的分化,且抑制效果与紫云英苷浓度相关,差异有统计学意义(P均<0.01),RT-PCR结果显示紫云英苷显著抑制了小鼠BMM细胞中破骨分化相关基因TRAP、CTSK、NFATc1的表达,差异有统计学意义(P均<0.01)。结论 紫云英苷能够有效抑制RANKL诱导下小鼠BMM细胞向破骨细胞的分化。     

杨梅苷抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞分化为破骨细胞的研究

目的探讨杨梅苷(Myricetin)对RANKL诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7向破骨细胞分化的影响。方法通过CCK-8法筛选出不同浓度(1.25mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L)杨梅苷对RAW264.7细胞的毒性作用。分别用50μg/L的RANKL、50μg/L RANKL+1.25mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L的杨梅苷诱导RAW264.7细胞5天。对形成的破骨细胞进行TRAP染色并计数,TRAP染色阳性且细胞核数目≥3个认为是成熟的破骨细胞。50μg/L的RANKL、50μg/L RANKL+1.25mg/L、10mg/L的杨梅苷培养RAW264.7细胞24小时,使用荧光实时定量PCR检测破骨细胞分化成熟相关基因C-Fos、NFATc1、Ctsk、TRAP的表达。结果 1.25mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L浓度的杨梅苷对RAW264.7细胞毒性较小,可作为后续实验的用药浓度。TRAP染色显示,1.25mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L浓度的杨梅苷可以抑制RANKL诱导的成熟破骨细胞的数目,且呈剂量依赖关系。RT-PCR结果显示,1.25mg/L、10mg/L的杨梅苷可以抑制破骨细胞分化相关基因C-Fos、NFATc1、Ctsk、TRAP的表达,且10mg/L的抑制作用比1.25mg/L更为显著。结论杨梅苷对RAW264.7细胞毒性较低,通过下调相关基因的表达抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞分化。杨梅苷可作为治疗骨质破坏相关疾病的潜在药物。     

破骨细胞钠氢转运蛋白集中于线粒体中表达

目的：把RAW264.7和人外周血CD14+ 诱导成破骨样细胞,检测破骨细胞在成熟过程中钠氢转运蛋白2（Na+-H+ An－tiporter 2,NHA2）的转录表达情况,并定位其表达位置。方法：细胞因子RANKL、M-CSF在体外诱导RAW264.7和人外周血CD14+细胞发育成破骨样细胞;RT-PCR检测NHA2在诱导过程中转录水平上所发生的变化;Western blot检测诱导前后此蛋白表达情况;细胞原位荧光染色对其表达进行细胞精确定位。结果：RAW264.7和人外周血CD14+ 细胞被RANKL、M-CSF诱导成破骨样细胞;RT-PCR结果显示NHA2随着破骨细胞的分化成熟转录水平不断加强;Western blot结果显示此蛋白只表达于成熟的破骨细胞中;细胞原位荧光染色结果显示这个蛋白主要表达于成熟破骨细胞的线粒体中。结论：NHA2作为盐离子载体主要表达于成熟破骨细胞的线粒体中,通过控制线粒体盐离子的代谢平衡来影响破骨细胞的发育分化     

Wnt3a对小鼠破骨细胞分化调控的影响

目的 探讨Wnt3a对小鼠破骨细胞分化调控的影响.方法 将细胞分为4组:阴性对照组(即空白组)、实验对照组(感染Ad-GFP组)、阳性对照组(50 ng/ml RANKL诱导组)、实验组(感染Ad-Wnt3a组).分别给予处理因素后常规细胞培养6d,通过酒石酸抗酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞的分化成熟情况;Western blot检测TRAP、Cathepsin K蛋白的表达;分别于处理因素后3、6、9d提取细胞总RNA,荧光定量Real time (RT-PCR)检测核因子κB受体(RANK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K(Cathepsin K)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因的表达.结果 TRAP染色显示50 ng/mL RANKL诱导组能成功诱导RAW 264.7成多核(核≥10),空白组和Ad-GFP组有少量多核细胞(3≤核≤5),Ad-Wnt3a组为单核有个别双核;Western blot检测显示Ad-Wnt3a组TRAP、Cathepsin K蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P＜ 0.05);RT-PCR检测Ad-Wnt3a组能下调RANK、TRAP、Cathepsin K、MMP-9基因的表达.结论 Wnt3a能抑制RAW264.7分化成成熟的破骨细胞.     

Lnc-AK077216基于OPG/RANKL/RANK通路对破骨细胞分化成熟的调控作用

目的 基于骨保护蛋白（OPG）/细胞核因子κB受体活化因子配体（RANKL）/细胞核因子κB受体活化因子（RANK）通路探究Lnc-AK077216对破骨细胞（OC）分化成熟的调控作用。方法 取对数生长期RAW264.7小鼠单核巨噬细胞,采用脂质体转染法将Lnc-AK077216-shRNA、Control-shRNA转染至RAW264.7细胞,分别设为转染组、空载组。另取未作处理细胞设为对照组。采用荧光显微镜观察转染率,并采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）测定转染后Lnc-AK077216 mRNA相对表达量;抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测诱导分化7 d后的OC数及阳性染色面积;采用qRT-PCR检测诱导分化培养3 d后各组OPG、RANKL、RANK mRNA相对表达量;采用Western blotting检测诱导分化培养3 d后各组OPG、RANKL、RANK蛋白相对表达量。结果 转染48 h后,荧光显微镜显示转染效率> 70％;转染48 h后转染组Lnc-AK077216 mRNA相对表达量低于对照组和空载组（P <0.05）;诱导分化前RAW264.7细胞多呈圆形且形态规则,诱导分化7 d后经TRAP染色,可观察到呈阳性的多核巨细胞,细胞有伪足、突起,且体积较大,表明生成OC;转染组OC数少于对照组和空载组（P <0.05）,阳性染色面积小于对照组和空载组（P <0.05）;转染组OPG mRNA和蛋白相对表达量高于对照组和空载组（P <0.05）,RANKL、RANK mRNA和蛋白相对表达量均低于对照组和空载组（P <0.05）。结论 敲低Lnc-AK077216可抑制RAW264.7细胞向OC分化,其调控机制可能与上调OPG mRNA和蛋白表达,下调RANKL、RANK mRNA和蛋白表达有关。     

新橙皮苷对破骨细胞分化影响的实验研究

目的探讨新橙皮苷对破骨细胞凋亡率、细胞活力以及分化的影响。方法分别在RAW264. 7细胞及小鼠骨髓巨噬细胞中加入核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)以及新橙皮苷进行培养分化,对RAW264. 7细胞进行细胞凋亡实验,对小鼠骨髓巨噬细胞进行细胞活力实验以及破骨细胞分化的时间依赖性实验。结果随着新橙皮苷浓度的增加,各组健康细胞率均保持于90%以上的高水平,而坏死率和凋亡率均维持在低水平。以0μM组为对照,各浓度组药物对细胞活力均无影响(P 0. 05)。第1、3、5、7天加入10μM的新橙皮苷均对破骨细胞形成有抑制作用(P 0. 01),其中第5天加入的新橙皮苷对破骨细胞形成的抑制作用最为显著(P 0. 001)。结论新橙皮苷对破骨细胞的凋亡率以及活力无影响,对其分化具有时间依赖性抑制作用。     

重组RANK蛋白抑制破骨细胞活性的实验研究

目的研究重组RANK蛋白在体外实验中对破骨细胞的抑制作用。方法成骨细胞与RAW264.7细胞以4∶1比例混合培养6d,以抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色鉴定后,加入3种浓度（10-4g/L、10-5g/L、10-6g/L）重组RANK蛋白,并设空白对照。3d后观察破骨细胞数目和形态,计数骨磨片吸收陷窝。结果混合培养6d后,体系中可见成熟破骨细胞出现。加重组RANK蛋白3d后,与对照组相比,各药物组TRAP阳性细胞个数、骨磨片吸收陷窝计数均明显减少。结论体外实验中重组RANK蛋白可以显著抑制破骨细胞活性及吸收功能。     

不同浓度熊果酸对破骨细胞增殖分化的作用及其意义

目的：研究熊果酸（UA）对破骨细胞（OC）增殖分化的影响,探讨其在正畸力致牙根吸收过程中的作用以及与OC间的关系。方法：对小鼠单核/巨噬系细胞RAW264.7进行OC诱导,采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法及骨吸收陷窝观察鉴定诱导是否成功。采用CCK-8法选取对RAW264.7无细胞生物毒性适宜浓度的UA,观察其对RAW264.7增殖分化的影响。实验组在培养液中加入梯度浓度为1.0、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0μmol·L^-1 UA,对照组不加UA。结果：TRAP染色及骨吸收陷窝观察,诱导培养RAW264.7细胞5 d后,可见TRAP染色阳性细胞;扫描电镜下吸收陷窝呈圆形和椭圆形等,底壁较粗糙,边界较清晰。表明RAW264.7细胞成功向OC分化。CCK-8检测,高浓度UA（>10.0μmol·L^-1）显著抑制OC的增殖;适宜浓度UA（5.0μmol·L^-1）既在生物安全浓度范围内,又抑制OC的增殖;低浓度UA（< 2.5μmol·L^-1）无作用。结论：RANKL可诱导RAW264.7细胞分化成熟。UA与OC增殖分化有关联,其在适宜浓度（5.0μmol·L^-1）时对OC增殖有抑制作用,且呈时间依赖性。     

银杏叶提取物对破骨细胞分化和骨吸收的作用及其机制

目的：探讨不同浓度银杏叶提取物（GBE）对破骨胞分化和骨吸收的作用,并阐明其作用机制。方法：体外培养RAW264.7细胞,采用核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和不同浓度GBE处理细胞,分为空白对照组（0μg·L^-1 RANKL）、RANKL组（100 μg·L^-1RANKL）和RANKL+75mg·L^-1 GBE和RANKL+150 mg·L^-1 GBE组。抗酒石酸酸性染色（TRAP）法观察各组破骨细胞的形态及数量,骨吸收陷窝面积评估GBE对破骨细胞骨吸收能力的影响,流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期,RT-PCR法检测RAW264.7细胞中破骨细胞相关基因活化T细胞核因子c1（NFATc1）、树突状细胞特异性跨膜蛋白（DC-STAMP）、组织蛋白酶K （Cathepsin K）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、P27和细胞周期蛋白D1（Cyclin-D1）的表达水平。结果：与空白对照组比较,RANKL组破骨细胞的数量明显增加（P < 0.05）;与RANKL组比较,RANKL+75 mg·L^-1 GBE和RANKL+150 mg·L^-1 GBE组破骨细胞数量明显降低（P < 0.05）。与空白对照组比较,RANKL组骨片中骨吸收陷窝面积明显升高（P < 0.05）;与RANKL组比较,RANKL+75 mg·L^-1 GBE和RANKL+150 mg·L^-1 GBE组骨片中骨吸收陷窝面积明显降低（P < 0.05）。与空白对照组比较,75和150 mg·L^-1 GBE组RAW264.7细胞凋亡率升高（P < 0.05）,RAW264.7细胞中Bcl-2基因表达水平明显降低（P < 0.05）,Bax基因表达水平明显升高（P < 0.05）。与RANKL组比较,RANKL+75 mg·L^-1 GBE和RANKL+150 mg·L^-1 GBE组RAW264.7细胞G₀-G₁期阻滞明显缩短（P < 0.05）;RAW264.7细胞中P27基因表达水平明显降低（P < 0.05）,Cyclin-D1基因表达水平明显升高（P < 0.05）。与空白对照组比较,RANKL组RAW264.7细胞中破骨细胞相关基因NFATc1、DC-STAMP、Cathepsin K和MMP-9表达水平明显升高（P < 0.05）;与RANKL组比较,RANKL+75 mg·L^-1 GBE和RANKL+150 mg·L^-1 GBE组RAW264.7细胞中破骨细胞相关基因NFATc1、DC-STAMP、Cathepsin K和MMP-9表达水平明显降低（P < 0.05）。结论：GBE可抑制破骨细胞分化和骨吸收能力,其机制可能与促进RAW264.7细胞凋亡、缩短RANKL诱导的RAW264.7细胞的G₀-G₁期有关。     

蛇床子素对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响及其机制

目的探讨蛇床子素(OST)对小鼠单核细胞RAW264. 7细胞系向破骨细胞分化的影响及相关机制。方法通过使用RAW264. 7细胞系体外诱导培养破骨细胞;将RAW264. 7细胞系分为阴性组、对照组及OST组。以核因子κB受体活化因子配基(RANKL)诱导细胞分化,OST组以高、中、低浓度(100、10、1μmol/L)根据实验要求干预细胞系相应时间;采用CCK-8法筛选无细胞毒性的药物浓度组;通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法测定阳性细胞数和融合指数;通过测定骨吸收板上溶解坑面积和培养液中的荧光强度评估OST对骨吸收功能的影响;使用荧光素酶报告基因法观察OST对RAW264. 7细胞系中活化T细胞核因子(NFAT)和核因子κB(NF-κB)表达的影响;应用q-PCR法检测OST对RAW264. 7细胞系中相关破骨基因活化T细胞核因子1(NFATc1)、组织蛋白酶K(CTSK)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、TRAP、干扰素β3(INTE-BETAβ3)、酪氨酸激酶(c-Src)表达的影响;应用Western Blot技术检测OST对RAW264. 7细胞系中NF-κB信号通路上相关蛋白膜p65、IκB、p-IκB、核p65表达的影响。结果通过CCK-8法筛选出1μmol/L和10μmol/L 2组药物浓度; OST组中的TRAP阳性细胞数和融合指数较对照组明显减少(P 0. 05),且中浓度组的抑制效果更明显(P 0. 05); OST组的骨吸收相对面积和荧光强度较对照组均受到明显抑制(P 0. 05),且中浓度组的抑制效果更明显(P 0. 05); OST可以明显抑制转录因子NFAT和NF-κB的启动(P 0. 05); OST可以抑制NFATc1等破骨相关基因的表达,除了Integrin-BETA3、c-Src外,2个浓度组组间比较差异均有统计学意义(P 0. 05);与对照组相比,OST可明显抑制细胞膜中p-IκB蛋白的表达(P 0. 05),促进IκB、p65的表达(P 0. 05),同时也抑制了细胞核中p65的蛋白表达(P 0. 05)。结论 OST可通过抑制NF-κB信号通路的表达而引起NFATc1等相关转录因子的下调来抑制破骨细胞的分化。     

内源性甲状旁腺激素对体外诱导培养破骨细胞的影响

目的:研究内源性甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)对于体外诱导培养破骨细胞的影响?方法:取8周龄PTH+/+和PTH-/- 小鼠各16只,分离培养小鼠股骨全骨髓细胞,在含有10 ng/ml 巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的培养皿中培养24 h,收集未贴壁细胞,即得破骨细胞前体,利用M-CSF和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)刺激形成破骨细胞?根据加入不同RANKL浓度分为低浓度(50 ng/ml)和高浓度(100 ng/ml)组?于诱导第6天?第9天进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,观察破骨细胞形态并计数40或100倍视野内TRAP阳性细胞数量?结果:M-CSF和RANKL能够在体外诱导小鼠全骨髓细胞形成TRAP阳性的破骨细胞?诱导第9天进行TRAP染色,同一个视野中形成的TRAP阳性破骨细胞数量较诱导第6天减少,但是破骨细胞体积和细胞核数量增多?相同浓度RANKL刺激下,PTH+/+与PTH-/-组破骨细胞数量未见明显统计学差异?不同浓度RANKL刺激下,高浓度组破骨细胞数量明显多于低浓度组细胞数量?结论:内源性PTH对于体外M-CSF和RANKL诱导骨髓培养的破骨细胞数量没有影响,与低浓度组相比,高浓度RANKL能够进一步促进破骨细胞数量增加?