潜伏活性的人可溶性TNFⅠ型受体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：采用基因工程技术，将转化生长因子B前体相关蛋白（LAP）通过基质金属蛋白酶（MMP）水解部位与人可溶性TNFI型受体（hsTNFRI）连接，构建pcDNA3，1／LAP-MMP-hs TNFRI融合蛋白真核表达载体，获得LAP-MMP-hsTNFRI融合蛋白。方法：将编码MMP水解部位氨基酸的正反义DNA序列退火形成互补双链后定向克隆插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），得到pcDNA3．1／MMP重组体；将TGF-β1的LAP段和hsTNFRI与MMP水解部位连接，获得pcDNA3．1／LAP-MMP-hsTNFRI真核表达载体。测序鉴定后，脂质体介导重组质粒转染COS-7细胞，通过RT-PCR检测融合基因的表达。结果：酶切及测序结果证实pcDNA3．1／LAP-MMP-hsTNFRI重组载体构建成功，转染后RT-PCR结果表明重组质粒在COS-7细胞中得到有效表达。结论：成功构建了融合蛋白真核表达载体pcDNA3，1／LAP-MMP-hsTNFRI，并获得融合基因的瞬时表达，为进一步研究融合蛋白在子宫内膜异位症中的靶向治疗奠定了实验基础。     

人乳腺珠蛋白基因真核表达载体的构建及其表达

[目的]构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础.[方法]利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序分析后,克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM.将重组载体用脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达.[结果]成功扩增hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达.[结论]hMAM基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据.     

单纯疱疹病毒Ⅱ型gD糖蛋白在真核细胞中的表达

目的：构建真核表达质粒pcDNA3／gD，并在体外COS-7细胞中进行表达。方法：体外PCR扩增出gD糖蛋白基因，克隆入真核表达质粒pcDNA3中。PCR、酶切和测序证实插入的gD基因正确后，转染COS-7细胞，用原位ELISA鉴定表达蛋白。结果：构建了pcDNA3／gD真核表达质粒，经原位ELISA证实，转染，COS-7细胞表达的gD蛋白能和gD单克隆抗体ID3和DL11结合，证明该蛋白具有天然gD蛋白的抗原性。结论：柯建的重组真核表达质粒pcDNA3／gD能够在COS-7细胞中表达。     

乙肝病毒preS1基因与截短C基因真核表达载体构建及表达

目的建立乙型肝炎病毒（HCV）preS1基因与截短C基因真核表达载体，并在CHO细胞中瞬时表达。方法PCR方法扩增HBV核心区羧基端部分缺失的基因片段和preS1全基因，克隆入真核表达载体pcDNA3．1（-）后测序鉴定，并通过脂质体瞬时转染CHO细胞。结果构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-Ct-preS1，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT—PCR证实pcDNA3．1（-）-Ct-preS1在CHO中表达截短的核心基因和preS1基因融合蛋白。结论成功构建preS1基因与截短C基因真核表达载体，可在CHO细胞中瞬时表达，为深入研究HBV基因免疫奠定了基础。     

hMAM与人HSP70融合基因真核表达载体的构建与表达

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)与人热休克蛋白70(hHSP70)融合基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,经酶切测序分析后,与人HSP70基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建了融合基因真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70。将重组载体电穿孔法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达。结果:成功扩增了人HSP70基因与hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM与人HSP70的融合基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM与人HSP70融合基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

人肾系膜细胞Smad-7稳定表达细胞系的筛选及其拮抗TGF-β1作用

目的构建Smad-7基因真核表达载体并筛选获得其稳定表达细胞系，观察Smad-7拮抗TGF-β1对人肾系膜细胞（HMC）的影响。方法用PCR方法从胎肝cDNA文库扩增Smad-7编码序列，将其构入真核表达载体pcDNA3．1／myc-his-B（-），酶切及测序鉴定重组质粒。重组质粒转染HMC细胞，G418筛选获得Smad-7的稳定表达细胞克隆，运用Western Blotting验证目的基因表达。运用MTT和流式细胞术检测稳定表达Smad-7对TGF-β1诱导的拮抗作用。结果酶切和测序证实目的基因被克隆入表达载体，Western Blotting证实目的基因成功表达，获得稳定表达Smad-7的细胞克隆；Smad-7过表达可明显缓解TGF-β1对HMC细胞的生长抑制、细胞周期G1阻滞作用，并可降低TGF-β1对HMC细胞的凋亡诱导作用。结论成功构建Smad-7真核表达载体并获得其稳定表达细胞克隆，过表达Smad-7可拮抗TGF-β1对HMC细胞的影响。     

白细胞介素10基因克隆及其真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人白细胞介素10(hIL-10)基因,以构建真核表达载体,并检测其在COS-7细胞中的表达情况。方法从人全血标本中提取细胞总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增hIL-10基因,分别构建含hIL-10目的基因的克隆载体与表达载体,提取质粒,经酶切、PCR和DNA测序鉴定;重组表达载体pVAX1-hIL10转染COS-7细胞,观测hIL-10的瞬时表达情况。结果构建了重组克隆载体pMD18T-hIL10和真核表达载体pVAX1-hIL10,经酶切、PCR及测序鉴定正确,插入片段序列与GenBank已公布的hIL-10基因序列一致;pVAX1-hIL10可以有效地转染COS-7细胞,Western blot结果表明hIL-10在COS-7细胞中瞬时表达。结论成功克隆了hIL-10基因,构建的表达载体pVAX1-hIL10在COS-7细胞中瞬时表达hIL-10蛋白,为进一步研究其生物学功能和临床应用奠定了基础。     

人乳腺珠蛋白基因疫苗的构建及其免疫原性研究

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因重组质粒pcDNA3.1-hMAM,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序后克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM。将重组载体脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法和ELISA检测目的基因的表达。结果:成功扩增hMAM基因,酶切测序表明,重组质粒含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM基因疫苗构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1的构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的构建pcDNA3．1－RASSFl真核表达载体,并检测其对肝癌细胞系HepG2凋亡的影响。方法应用聚合酶链反应技术从人RASSFlcDNA中扩增出RASSF1基因后,以内切酶XhoI和EcoRI进行双酶切,将其克隆人用相同酶处理的载体pcDNA3．1;将重组质粒pcDNA3．1－RASSF1转染肝癌HepG2细胞,应用Westernblot法检测RASSF1的表达水平;用AnnexinV／PI法检测细胞的凋亡情况。结果酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3．1．RASSF1构建成功;Westernblot法结果表明转染pcDNA3．1-RASSF1后HepG2细胞中RASSFl表达升高;AnnexinV／PI法用流式细胞术检测凋亡,空白组、pcDNA3．1组和pcDNA3．1-RASSFl组HepG2细胞的凋亡率分别为（5．8±0．42）％、（7．48±0．68）％和（35．1±3．15）％。结论真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1构建成功;RASSF1蛋白在HepG2细胞中高表达,并促进细胞凋亡。     

单纯疱疹病毒II型gD糖蛋白在真核细胞中的表达

目的:构建真核表达质粒pcDNA3/gD,并在体外COS-7细胞中进行表达。方法:体外PCR扩增出gD糖蛋白基因,克隆入真核表达质粒pcDNA3中。PCR、酶切和测序证实插入的gD基因正确后,转染COS-7细胞,用原位ELISA鉴定表达蛋白。结果:构建了pcDNA3/gD真核表达质粒,经原位ELISA证实,转染COS-7细胞表达的gD蛋白能和gD单克隆抗体ID3和DL11结合,证明该蛋白具有天然gD蛋白的抗原性。结论:构建的重组真核表达质粒pcDNA3/gD能够在COS-7细胞中表达。     

卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒构建与表达

[目的]构建大鼠源卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒,进行表达。[方法]以卡氏肺孢子虫DNA为模板,应用PCR扩增MSG基因片段,连接至pGEM-T Easy载体,再克隆至PCDNA3.1( )载体。构建的重组表达质粒经酶切、PCR鉴定后转染至COS-7细胞,并进行大量增殖。RT-PCR验证转染基因的表达。[结果]重组表达质粒PCDNA3.1( )/MSG经酶切及PCR鉴定结果表明构建成功。RT-PCR结果显示MSG基因片段成功转染至COS-7细胞,并在其中进行基因表达。[结论]成功构建了PCDNA3.1( )/MSG重组质粒,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究打下基础。     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据。方法提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定。结果扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL。     

结核分支杆菌抗原ESAT-6真核表达质粒在COS-7中的表达

目的 探讨结核分支杆菌早期分泌性抗原靶ESAT—6基因真核表达重组质粒在真核细胞(COS—7)中的表达。方法 用LipofectAMINE^TM2000介导真核表达重组质粒pcDNA3．1( )—ESAT—6转染真核细胞COS—7，72h后，通过RT—PCR和Western Blotting试验鉴定ESAT—6基因在COS—7中的表达。结果 通过RT—PCR从转染了pcDNA3．1( )—ESAT—6的006—7中检测到目的基因mRNA的转录；Western Blotting试验鉴定在转染pcDNA3．1( )—ESAT—6的COS—7的细胞裂解上清液中有ESAT—6基因的表达蛋白。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ES—AT—6真核表达重组质粒能够在真核细胞COS—7中表达ESAT—6蛋白，为进一步研究其特性及为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下了基础。     

肿瘤转移抑制基因KiSS-1的克隆与真核表达载体的构建

目的克隆不含信号肽的人肿瘤转移抑制基因KiSS-1,构建KiSS-1基因的真核表达载体并鉴定。方法从正常人膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,将其克隆到真核表达栽体pcDNA3.1( ),构建真核表达质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1。结果经基因序列分析及PCR和酶切鉴定,证实目的基因片段已成功插入载体pcDNA3.1( )且序列正确。结论重组质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1构建成功,为下一步KiSS-1蛋白的表达和研究该蛋白的功能奠定了良好的基础。     

重组CKB真核表达载体的构建及其稳定转染NCI—H520细胞系的建立

目的构建pEGFP—N1－CKB真核表达载体并将其稳定转染到肺鳞癌细胞NCI—H520中,建立稳定转染的NCI—H520细胞系,为后续研究奠定基础。方法以人CKBcDNA文库为模板,用PCR扩增人CKBcDNA的编码区,并将扩增的cDNA片段与载体连接后亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肺鳞癌细胞系NCI—H520,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用Westernblot检测转染前后该细胞株CKB基因的表达。结果pEGFP—N1－CKB经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,真核表达载体构建成功;经Westernblot检测,重组质粒转染株中CKB基因的表达水平明显高于对照组,证实CKB基因已稳定转染到NCI-H520细胞中并得到表达。结论成功构建了pEGFP—N1－CKB真核表达质粒,建立了稳定表达CKB的NCI-H520细胞系,为进一步研究CKB的生物学功能奠定了基础。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组载体的构建及鉴定

目的以幽门螺杆菌外膜脂蛋白Lpp20为目的基因,构建H.pylori Lpp20基因的真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20,为H.pylori核酸疫苗的研制奠定实验基础。方法用Pri mer5.0软件分析GenBank中H.pylori外膜脂蛋白Lpp20基因序列,设计合成相应特异性引物,引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,以H.pylori26695株基因组为模板,PCR扩增Lpp20目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1( )-Lpp20;通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果以H.pylori26695株基因组DNA为模板扩增出特异的Lpp20基因片段,大小约为528bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为528bp的H.pylori Lpp20目的基因片段;并成功构建了pcD-NA3.1( )-Lpp20真核表达重组载体。