单克隆培养法分离、培养胶质瘤干细胞

目的 观察单克隆培养法从人脑胶质瘤细胞系SHG44中分离、培养肿瘤干细胞的结果.方法 取对数生长期SHG44细胞,用无血清培养基进行肿瘤干细胞的分离培养及单克隆培养,免疫荧光染色法对分化前后的肿瘤球行CD133、神经巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白质(GFAP)、小管蛋白3-Tubulin染色,MTT法检测肿瘤于细胞的增殖情况,流式细胞术检测CD133阳性细胞比例.结果 单克隆分离培养的细胞球表达CD133及Nestin干细胞标记物,分化后表达星形胶质细胞GFAP及神经元β-Tubulin标记物,细胞球生长约第5天增殖率达到峰值.结论 单克隆培养法可成功分离培养出胶质瘤干细胞,分化前后的细胞球可表达干细胞标记物、神经胶质细胞及神经元标记物,肿瘤球具有较强的增殖及分化能力,并含有一定数量的CD133阳性细胞.     

胶质瘤干细胞的内皮分化和管腔形成能力

目的探讨胶质瘤干细胞内皮分化和形成管腔的能力。方法以含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养U87人脑胶质母细胞瘤细胞,再用免疫磁珠法结合"悬浮克隆球形成法"分离胶质瘤干细胞,先行形态学观察,然后采用免疫荧光方法检测CD133、Nestin和GFAP表达,鉴定胶质瘤干细胞。将分离所得的胶质瘤干细胞在添加20μg/ml血管内皮生长因子(VEGF),1μg/ml FGF和2μg/ml胰岛素样生长因子(IGF)的10%DMEM培养基中诱导培养,分别取培养3 d和7 d的细胞进行Western印迹检测内皮特定蛋白的表达。同时将诱导培养7 d的细胞接种于涂有Matrigel的24孔板中,12 h和24 h后于倒置显微镜下观察并采集图像。结果免疫磁珠法结合"悬浮克隆球形成法"分离出的胶质瘤细胞团呈现明显的CD133和Nestin免疫荧光染色,但GFAP未显示荧光染色;Western印迹检测发现被诱导的胶质瘤干细胞随着时间延长,CD133的表达逐渐减弱直至消失,而CD31和v WF表达由弱到强;Matrigel结果显示被诱导7 d的胶质瘤干细胞明显形成了完整的管腔。结论胶质瘤干细胞在内皮细胞生长条件下,可以分化为内皮样细胞并且具有形成管腔的能力。     

盐酸法舒地尔对体外培养大鼠神经干细胞分化的影响

目的观察盐酸法舒地尔对体外培养神经干细胞（NSCs）分化的影响。方法体外分离培养NSCs,通过不同浓度的盐酸法舒地尔干预后,采用免疫细胞化学及流式细胞技术检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果分离培养的NSCs具有自我复制、增殖能力,可以表达Nestin;诱导分化后的细胞可以表达NSE和GFAP。免疫细胞化学染色提示,盐酸法舒地尔干预组NSE阳性细胞显著高于对照组（P〈0．05）,但是不同浓度盐酸法舒地尔之间元统计学差异（P〉0．05）。流式细胞仪检测结果显示,盐酸法舒地尔干预组NSE阳性细胞比例明显增加,与对照组相比有统计学差异（P〈0．05）。结论盐酸法舒地尔可以促进NSCs向神经细胞方向分化。     

高纯度神经胶质瘤干细胞的分离与鉴定

目的从人脑神经胶质瘤组织中培养鉴定并分离提取高纯度的神经胶质瘤干细胞,观察神经胶质瘤干细胞的生长活性,为神经胶质瘤的治疗提供新的途径。方法取术中的胶质瘤组织制成单细胞悬液,加入含有神经生长因子和双抗的无血清DMEM/F12培养液中培养、传代,进行免疫荧光染色检测,应用染色体核型检查及分析神经胶质瘤干细胞。最后用流式细胞仪检测经免疫磁珠分选系统分离提取的CD133~+神经胶质瘤干细胞的纯度。结果 (1)培养出神经胶质瘤干细胞,传代后仍能很快形成细胞球样结构,且形态与原代大致相同。(2)悬浮的细胞免疫荧光染色检测结果显示Nestin、CD133染色阳性,而培养皿底部贴壁的细胞Nestin、CD133染色均呈现阴性。(3)染色体核型检查结果显示胶质瘤干细胞球的细胞核染色体均为非整倍体,即异倍体,且其中有部分染色体呈现断裂现象,染色体上存在部分基因片段的缺失。染色体核型分析结果为:45XY,-10,del(5)(p15),del(16)(p;q)。(4)免疫磁珠分选系统分离出的CD133~+神经胶质瘤干细胞经过流式细胞仪测得纯度为(86.83±5.12)%。结论经过免疫荧光染色和染色体核型检查及分析最终鉴定为人脑神经胶质瘤干细胞,并且诱导分化成功,成功分离出高纯度的CD133~+神经胶质瘤干细胞。     

肾癌干细胞的培养及鉴定

目的从肾癌细胞中获取肾癌干细胞。方法将肾癌细胞悬浮于含有表皮生长因子（EGF）和成纤维生长因子（bFGF）的无血清培养基中培养。用流式细胞仪检测其CD133及CD34。收集无血清培养7d后的细胞重新常规培养并观察其分化情况。结果悬浮培养2d后出现肾癌干细胞球,培养7d后表达CD133^＋,CD34^-的细胞占8．33％±1．26％,高于肾癌细胞中表达CD133^＋CD34^-的细胞（P〈0．05）,后者只占1．24％±0．36％。结论用无血清培养基和悬浮培养的方法可以从肾癌细胞中获取肾癌干细胞。     

生长因子分步诱导法在大鼠脂肪干细胞向神经细胞分化中的应用观察

目的：观察生长因子分步诱导法在大鼠脂肪干细胞（ADSCs）向神经细胞分化中的应用效果。方法取SD大鼠腹股沟及腹膜后脂肪,体外分离培养ADSCs,取消化、离心的第3代ADSCs,首先以DMEM／F12＋2％B27＋20 ng／mL EGF＋20 ng／mL bFGF的神经干细胞培养基诱导7 d,后以DMEM／F12＋1μmol／L RA神经诱导培养基诱导7 d。免疫荧光法鉴定分化后神经细胞特异标志物中神经细胞特异标志物巢蛋白（ Nestin ）、微管相关蛋白2（MAP2）、神经元核抗原抗体（NeuN）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。结果从大鼠脂肪组织中成功提取AD-SCs,其能够连续传代且稳定增殖;流式细胞检测显示CD34表达率为0．36％,CD73为99．17％,CD90为98．61％,CD105为96．20％。经生长因子诱导7 d后细胞聚集成球,Nestin高表达;14 d后MAP2、NeuN高表达,而GFAP低表达。结论 ADSCs能够稳定增殖传代,生长因子分步诱导可高效诱导ADSCs定向分化为神经细胞。     

抑癌基因PTEN和Ki-67抗原在人脑胶质瘤中的表达及意义

为探讨抑癌基因PTEN和Ki-67抗原表达与脑胶质瘤发生发展的关系，采用免疫组织化学法检测了82例人脑胶质瘤中PTEN和Ki-67的表达情况。结果显示，PTEN阳性染色定位于细胞浆，82例标本中，有48例（58．54％）PTEN呈阳性表达，高分化肿瘤（I级和Ⅱ级）的阳性表达率（75．61％）明显高于低分化（Ⅲ级和Ⅳ级）肿瘤（41．46％），P＜0．005。Ki-67呈明显核染色，各级胶质瘤均有表达，低分化肿瘤（75．61％）明显高于高分化肿瘤（24．39％），P＜0．005。PTEN与Ki-67表达呈负相关（P＜0．01）。认为PTEN突变或缺失在人脑胶质瘤的发生发展中起重要作用，Ki-67可作为反映胶质瘤细胞增殖潜能的指标。PTEN和Ki-67表达与肿瘤分化程度密切相关，联合检测PTEN和ki-67在胶质瘤中的表达，有助于对肿瘤细胞增殖能力、分化程度做出正确评价，指导临床治疗及估计患者预后。     

大鼠胰腺干细胞的分离纯化、鉴定及定向分化

目的 探讨大鼠胰腺干细胞体外分离、纯化的实验条件及其定向分化潜能.方法 应用胰腺原位灌注V型胶原酶消化大鼠胰腺组织,100目滤网滤过,Ficoll 400浓度梯度离心法分离胰腺干细胞,采用添加表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)的培养基行体外培养.运用荧光免疫染色法检测细胞表面CK-19、Pdx-1、Nestin、Insulin和Glucagon蛋白,计算阳性细胞率.双硫腙(DTZ)染色鉴定诱导分化后的细胞,光电酶标记法ELISA检测胰岛素分泌功能.结果 本实验获取的胰腺干细胞,体外培养可稳定传代培养8代以上.细胞表面CK-19、Pdx-1和Nestin蛋白均呈阳性,阳性细胞率分别为(88.6±6.2)%、(84.6±8.6)%和(81.3±7.5)%.诱导分化后细胞经DTZ染色呈棕红色.在高糖刺激下,培养上清液中胰岛素含量增高.结论本法可获取高纯度、多数量的胰腺干细胞,在人工诱导下可定向分化为具有胰岛素分泌功能的胰岛样细胞团,为临床胰岛移植获得足量细胞来源提供实验基础.     

脐血单个核细胞体外向神经干细胞的诱导及Foxg1基因的表达

目的探讨人脐血单个核细胞（UBC-MNCs）体外向神经干细胞（NSCs）的诱导分化机制及NSCs中Foxg1基因表达的意义。方法从脐血中分离出UBC—MNCs,用含hEGF、bFGF和B27因子的Neurobasa1培养基联合诱导其向NSCs方向分化,观察NSCs形态学及增殖分化特点;免疫组化法检测培养细胞中神经细胞标志抗原Nestin、NSE、GFAP的表达情况,BrdU标记靶细胞;RT-PCR法检测分离后、培养3、6、9、12d细胞中Foxg1基因的表达。结果UBC—MNCs可定向诱导分化为神经元样细胞,表达Nestin、NSE、GFAP标记抗原。Foxg1 mRNA在诱导前细胞中低表达,诱导后逐渐升高（P〈0．05）,6d达高峰,之后逐渐下降（P〈0．05）。结论体外定向诱导培养可获得UBC-MNCs源性NSCs,Foxg1基因是NSCs增殖分化关键调控因子,脐血可成为NSCs的新来源。     

肝衰竭患者血清诱导脐血间充质干细胞表达白蛋白和甲胎蛋白的研究

目的：建立分离、纯化脐血间充质干细胞（HUMSCs）的方法,探讨肝衰竭患者血清对HUMSCs的诱导分化作用。方法：采用密度梯度离心和贴壁培养法相结合分离培养HUMSCs并鉴定,以舍重型肝病患者血清的低糖DMEM培养基诱导培养,不同时间点采用免疫组织化学方法（sP）检测甲胎蛋白（AFP）和白蛋白（Alb）的表达。结果：分离获得高纯度的HUMSCs,HUMSCs高表达CD44和CD29,不表达CD34,可以分化为脂肪细胞;SP结果表明,对照组HUMSCs不表达AFP和Alb,肝衰竭患者血清在培养7天时,大部分细胞呈AFP阳性表达（75．2±7．8）％,与对照组比较差异有显著性意义（P〈0．05）;诱导培养14天、21天和28天时AFP表达阳性率分别为（40．1±8．2）％、（10．4±3．5）％和（6．8±2．3）％;肝衰竭患者血清培养7天时仅少数细胞内可见Alb表达,表达阳性率为（9．8±2．7）％;培养14天、21天和28天,Alb表达阳性率分别为（25．4±5．2）％、（67．2±7．8）％和（83．4±7．9）％,与对照组比较差异有显著性意义（P〈0．05）。结论：密度梯度离心和贴壁培养法相结合是一种较好的分离纯化HUMSCs的方法;肝衰竭患者血清可以诱导HUMSCs表达AFP和Alb。     

大鼠骨髓Thy-1.1+干细胞诱导分化为肝干细胞样细胞的体外实验研究

目的：分离培养大鼠骨髓Thy-1．1^＋干细胞，探讨其肝分化条件及潜能。方法：分离大鼠骨髓细胞，Percoil密度梯度离心获取骨髓单个核细胞后免疫磁珠分选Thy-1．1^＋干细胞群，流式细胞术测定分选后细胞的纯度与表型。不同条件下诱导分化，用形态学观察、逆转录聚合酶链反应和免疫细胞化学法判定其所处的肝系分化阶段。结果：免疫磁珠分选Thy-1．1^＋细胞纯度达94．2％。Thy-1．1^＋细胞不表达CD34和c-kit；高表达β2微球蛋白和CD45；部分表达Flt-3。Thy-1．1^＋细胞在HGF／FGF-1／FGF-2诱导下呈多角形上皮状克隆样生长，诱导前后持续表达细胞角质素18，诱导过程中白蛋白的表达逐渐减少，甲胎球蛋白的表达逐渐增强。结论：免疫磁珠可有效分选Thy-1．1^＋细胞。Thy-1．1^＋细胞在HGF／FGF．1／FGF-2诱导下呈肝干细胞样细胞表现。     

非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的定量检测

目的探讨非小细胞肺癌循环肿瘤细胞（CTCs）定量检测方法。方法CD45免疫磁珠阴性分选组20侧，CD326免疫磁珠阳性分选组25例，均为明确诊断的非小细胞肺癌患者。磁性分离富集后肺静脉与外周静脉血标本应用多参数流式细胞仪对CTCs进行定量检测。结果阴性分选由于只能去除CD45阳性细胞，回收目的细胞纯度低。阳性分选组中25例术中肺静脉血CTCs定量检测阳性率为64％（16／25），外周静脉血CTCs阳性率40％（10／25，P〈0．05）。结论免疫磁珠富集联合流式细胞分析检测CTCs的敏感性和特异性较高。     

大鼠胎血与骨髓间充质干细胞分化能力的体外研究

目的：比较大鼠胎血和骨髓中间充质干细胞（MSC）体外培养过程中的生长特性及体外诱导两者向神经元样细胞分化的异同。方法：采用标准Ficoll-hypague技术分离大鼠胎血骨髓的单个核细胞（MNC），收获MSC传代培养，流式细胞仪检测细胞的免疫表型。β-巯基乙醇、二甲基亚砜、叔丁基对羟基茴香醚诱导MSC向神经元分化，免疫细胞化学法检测其特异性标志巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果：2种MSC细胞形态、免疫表型无明显差异。定向诱导后，2种细胞均表达Nestin、NSE，但GFAP阴性。结论：大鼠胎血和骨髓MSC的细胞形态、生物学特性无明显差别；两者诱导分化为神经元碰细胞的能力无显著差异。胎血应是MSC的又一来源。     

FHIT蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达及临床意义

目的 探讨人脑胶质瘤组织脆性组胺三联体（FHIT）的表达及其临床意义。方法 应用免疫组织化学SP法，检测38例人脑胶质瘤组织（观察组;低度恶性13例。高度恶性25例）和8例正常脑组织（对照组）中FHIT蛋白的表达。结果 观察组FHIT蛋白表达率（47．4%）明显低于对照组（100％），P〈0．01；低度恶性者FHIT蛋白表达率（53．8％）明显高于高度恶化者（44．0％），P〈0．05。结论 FHIT的异常表达与人脑胶质瘤的发生、发展有关。     

胎脑神经干细胞的培养及鉴定

检测3个月胎龄人胎脑各个解剖部分神经巢蛋白（Nestin）的表达,分离神经干细胞进行培养,诱导其分化,利用免疫荧光细胞化学技术对培养的神经干细胞及分化细胞进行鉴定.结果 在人胎脑室管膜下区、海马、纹状体、丘脑、嗅球、皮层部位发现数量不等的Nestin阳性表达细胞,从海马和皮层组织分离培养得到的大量悬浮生长具有连续增殖能力的神经干细胞球,能够传代培养,表达神经干细胞的标志物Nestin,经诱导分化为神经元和胶质细胞.     

脂肪间充质干细胞向肝细胞横向分化的研究

目的探讨脂肪源性间充质干细胞（AMSC）向肝细胞横向分化的可能性。方法胶原酶消化脂肪组织,贴壁培养,体外扩增后以流式细胞仪鉴定其表面标志。取扩增3代的AMSC分为2组,诱导分化组在含有2％FBS的DMEM-F12培养基中加入肝细胞生长因子20 ng/ml和成纤维细胞生长因子4 10 ng/ml、1×ITS和地塞米松0．1μmol/L,培养14 d；空白对照组则不加任何细胞因子。RT-PCR检测诱导分化过程中肝细胞核因子1、GATA4等基因转录水平的变化。2周后,采用流式细胞术检测AFP和Alb阳性细胞在两组细胞中的比例,检测肝细胞特异性细胞角蛋白（CK） 18、CK19的表达。结果分离、培养的AMSC呈成纤维细胞样生长,可以稳定传代。流式细胞术检测结果显示第3代脂肪间充质干细胞高表达表面CD29、CD44；不表达CD34、CD45。RT-PCR检测诱导5、8、11、14 d的细胞,显示有肝细胞特异性转录因子GATA4和肝细胞核因子1A基因的表达,并随时间延长而逐渐增多。流式细胞术检测诱导14 d的细胞,发现30．0％的细胞表达Alb,17．8％细胞表达AFP,双阳性的细胞为6．9％；免疫荧光检测发现诱导细胞表达CK18、CK19。空白对照组脂肪间充质干细胞则未见上述各项变化。结论在低血清培养体系中,采用细胞因子联合诱导,显示脂肪间充质细胞在体外能定向分化为肝细胞样细胞。     

脑胶质瘤干细胞的体外培养与生物学特性观察

目的体外培养人脑胶质瘤干细胞并观察其生物学特性。方法应用无血清培养技术,从手术中获取的人脑胶质瘤组织培养得到肿瘤干细胞,诱导其分化后与原肿瘤组织细胞进行比较。应用细胞免疫荧光技术鉴定肿瘤干细胞表面标志物。结果分别在间变性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中培养得到悬浮生长的肿瘤干细胞球,其能在体外自我更新、增殖,形成新的克隆性细胞球,保持连续稳定的传代,能表达神经干细胞表面标志物CD 133。在含血清培养基中能够分化为与原肿瘤组织相似的贴壁生长的细胞。结论人脑胶质瘤中存在一定量的肿瘤干细胞,能够自我更新增殖、诱导分化、表达干细胞标志物CD 133。为探讨脑胶质瘤的发病机制奠定了基础。     

两种细胞因子诱导人骨髓多能成体祖细胞向肝样细胞分化的作用

本实验用免疫磁性分离（MACS）方法分选骨髓间充质干细胞（MSCs）亚群MAPCs，用成纤维细胞生长因子-4（FGF-4）及肝细胞生长因子（HGF）诱导其向肝细胞方向分化，并采用不同方法鉴定了细胞分化能力。     

替莫唑胺通过Notch1信号通路对胶质瘤干细胞分化、增殖、凋亡影响的研究

目的研究替莫唑胺对胶质瘤U251干细胞分化、增殖、凋亡的影响及作用机制。方法培养U251胶质瘤细胞,用磁细胞分选法分选出U251干细胞。用0、100、500μmol、1 mmol替莫唑胺分别处理对数期的U251干细胞24、48、72、96h,MTT检测各个处理对U251细胞增殖的影响;用含血清培养基诱导U251干细胞分化,分别加入0、500μmol替莫唑胺处理72 h,提取分化前及两组替莫唑胺处理后干细胞总蛋白,Western-blot检测干细胞标记物CD133及分化标记物MAP2、GFAP、MBP蛋白表达情况;分别利用0、500μmol替莫唑胺处理U251干细胞72 h,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;提取0、500μmol替莫唑胺处理72 h后的U251干细胞总蛋白,Western-blot检测Notch1信号通路关键蛋白表达情况。结果替莫唑胺处理抑制U251干细胞增殖,与0μmol替莫唑胺处理相比差异显著(P0.01),500μmol替莫唑胺处理72 h差异最显著。U251细胞分化后,CD133蛋白表达量降低,MAP2、GFAP、MBP蛋白表达量升高,与分化前相比差异显著(P0.01),与0μmol处理相比,500μmol替莫唑胺处理后CD133、MAP2、GFAP、MBP蛋白表达差异显著(P0.01)。500μmol替莫唑胺处理72 h后U251干细胞凋亡明显增加,与0μmol处理相比差异显著(P0.01)。500μmol替莫唑胺处理72 h后Notch1通路关键蛋白Notch1、CBF-1、HES-1表达明显下降,与0μmol处理相比具有显著性差异(P0.01)。结论替莫唑胺可能通过抑制Notch1信号通路抑制胶质瘤U251干细胞增殖,促进U251干细胞分化及凋亡。     

PTEN和EGFR蛋白在人脑胶质瘤中的表达及意义

目的探讨磷酸酶和张力蛋白类似物（PTEN）和表皮生长因子受体（EGFR）在人脑胶质瘤发病中的作用。方法采用SP免疫组化法检测208例人脑胶质瘤组织（胶质瘤组）和10例正常脑组织（对照组）中PTEN和EGFR蛋白表达情况。结果胶质瘤组PTEN蛋白表达阳性率显著低于对照组,且低分化者显著低于高分化者（P均〈0.05）;胶质瘤组EGFR蛋白表达阳性率显著高于对照组,且低分化者〉高分化者〉对照组（P均〈0.05）。结论 PTEN及EGFR均与胶质瘤发生及恶性程度密切相关;检测两者表达情况可为脑胶质瘤的临床诊治及预后判断提供依据。