大鼠脑源性神经干细胞的分离培养

目的 探讨大鼠不同年龄组来源的神经干细胞体外培养和诱导分化的最佳条件。方法 分离12～15d大鼠胚胎、1～2d新生鼠的脑组织和成年大鼠脑的海马区和嗅球，在条件培养基(包含生长因子)中增殖培养，用神经干细胞的特异性单克隆抗体巢蛋白(nestin)鉴定克隆细胞；去除生长因子，降低血清浓度到2％后，诱导细胞分化，用神经细胞的特异性单克隆抗体鉴定分化细胞。结果 获得了大量可自我增殖并分化为3种神经细胞(神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞)的神经前体细胞。结论 在适当的分离培养条件下，可以获得大量的神经前体细胞，为神经干细胞的基础和临床研究提供细胞基础。     

新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究

研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法,为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。取新生SD大鼠的海马区脑组织,采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞,在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养;Accutase酶消化后传代培养,取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞,在无血清培养液中形成大量的神经球,部分神经球出现融合及贴壁分化现象,细胞呈典型NSCs 形态。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞。神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后,可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力,在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

大鼠脑组织细胞培养的形态学观察

为观察原代培养 SD大鼠大脑组织 ,包括神经干细胞在内的各种细胞的形态 ,取新生大鼠 ,无菌操作下取出整个大脑 ,制备成单细胞悬液 ,接种培养 ,免疫细胞化学鉴定各类细胞的同时用光镜和扫描电镜对不同阶段和种类的细胞进行形态学观察。结果显示 :在体外培养出神经元、胶质细胞和神经干细胞 ;神经细胞在体外的发育时程跟体内基本一致 ,神经干细胞在体外 2 0 d左右分化成熟 ,获取了神经细胞和干细胞体外培养的光镜和扫描电镜形态。结果提示 ,成体神经细胞体外分离、培养的条件关键点在于尽可能贴近自然 ,由此可保证细胞培养的质量 ,获得可靠的神经干细胞、神经元和胶质细胞。为各类神经细胞提供了形态学资料。     

新生大鼠神经干细胞的培养方法

神经干细胞研究是目前神经科学研究的热点 ,如何快速经济地培养出神经干细胞是每个研究者必须面对的问题。目前多数研究者采用胎鼠脑组织作为神经干细胞的组织来源 ,培养方法是加入EGF、bFGF的DMEM/F12无血清培养基。我们在进行新生大鼠神经干细胞分离和培养的过程中 ,发现应用无血清培养基 ,培养神经干细胞的速度较慢 ,数量也较少 ,需要较长周期才能达到研究要求。为此我们采用乳鼠为神经干细胞的组织来源 ,应用DMEM/F12 /N2为基础培养基 ,在此基础上添加不同成份 ,观察神经干细胞的生长情况。确定最佳的培养方法。1　材料1 1　Wis…     

无血清培养新生Wistar大鼠神经干细胞及免疫荧光鉴定

目的在无血清条件下,分离培养新生1d的Wistar大鼠神经干细胞,观察其生长及分化情况,并对其生物学特性进行鉴定。方法取新生1d的大鼠海马组织,机械分离法分离神经干细胞,加入含有表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、B27的DMEM/F12无血清培养基中培养、增殖。倒置显微镜下观察神经干细胞的增殖分化情况,采用免疫荧光染色鉴定其生物特性。结果从新生大鼠海马组织分离培养的神经干细胞在无血清培养基中不断增殖,免疫荧光染色显示巢蛋白呈阳性表达。诱导分化后,免疫荧光染色可见高分子量神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白和髓鞘碱性蛋白阳性表达细胞。结论无血清条件分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。     

新生大鼠海马神经干细胞的培养与传代

目的:探讨新生大鼠海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分离培养的条件和传代新方法。方法:从新生大鼠海马中分离细胞,采用无血清培养技术,在表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)和B27联合作用下使其不断增殖克隆。采用机械吹打和神经小球分离试剂盒两种不同方法进行传代,利用免疫荧光染色的方法对培养的细胞进行鉴定。结果:从新生大鼠海马分离的细胞群可不断增殖形成细胞克隆球,并能稳定传代,呈nestin阳性表达,且具有多向分化能力。采用神经小球分离试剂盒传代的细胞球比机械吹打传代的细胞球生长快,数量多,体积大,折光性好。结论:利用无血清技术和特定生长因子,可以使来源于新生大鼠海马的NSCs在体外扩增,利用大鼠神经小球分离试剂盒可以有效地进行传代,稳定高效地培养出神经干细胞。     

冬虫夏草含药血清诱导神经干细胞定向分化的影响

目的探讨冬虫夏草中含药血清诱导神经干细胞（NSCs）定向分化的作用。方法取新生24 h内的Wistar大鼠大脑海马区分离培养神经干细胞三代后,加入低、中、高剂量冬虫夏草含药血清与对照血清进行培养,观察其对神经干细胞影响,通过MTT检测神经细胞生长曲线和免疫组化法检测神经干细胞向神经元分化的情况。结果新生大鼠海马分离培养的神经克隆球,经免疫细胞化学染色检测为Nestin阳性细胞。神经干细胞贴壁分化的细胞呈NSE、GFAP阳性。冬虫夏草低、中剂量组诱导神经干细胞分化为神经元的阳性细胞明显高于对照组,且呈量效依赖关系,高剂量组与对照组没有明显差别。结论冬虫夏草含药血清可体外诱导神经干细胞向神经元方向分化,在一定范围内存在量效依赖关系。     

脑组织提取液促进体外培养神经干细胞增殖

目的： 寻找特异性的具有促神经干细胞分裂增殖作用的物质，为神经系统发育研究和神经系统疾病包括脑退行性疾病的治疗研究提供新资料。 方法： 制备新生鼠的前脑、中脑、后脑及小脑组织提取液，体外培养新生鼠神经干细胞，观察神经球的生长情况，采用MTT细胞活性检测法和特异性蛋白质免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞的增殖能力。 结果： 中脑和小脑的提取液加入后有大量神经球生成，神经干细胞的特异性蛋白nestin免疫细胞化学染色呈阳性。 结论： 中脑和小脑的提取液可促进体外培养的神经干细胞增殖分裂，且呈一定量效关系。     

新生小鼠海马、嗅球及皮质神经干细胞的分离培养及鉴定

背景:从体外分离培养出高纯度、生物学性能均一的神经干细胞,建立起一套完整的神经干细胞培养体系,是进行神经干细胞研究的基础。目的:建立新生小鼠海马、嗅球、皮质组织神经干细胞的分离培养体系,并对其生物学特性进行分析。方法:分离新生昆明小鼠海马、嗅球、皮质组织,采用机械分离和胰酶消化法提取原代神经干细胞。采用无血清培养技术、机械吹打和酶消化法进行传代培养神经干细胞。以体积分数为10%的胎牛血清诱导分化神经干细胞。对神经干细胞及其分化产物行CD133、巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色鉴定。结果与结论:从新生小鼠海马、嗅球、皮质可提取出具有自我更新和多向分化能力的神经干细胞,经巢蛋白、CD133免疫荧光染色检测呈阳性;神经干细胞经胎牛血清诱导后可分化为β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞,并证实染色阳性细胞为神经元和星形胶质细胞。该实验建立了一套神经干细胞体外分离培养、纯化、鉴定、诱导分化方案,为后续神经干细胞研究的顺利进行奠定了实验基础。     

新生大鼠视网膜神经干细胞的分离培养与诱导分化

目的 初步探讨新生大鼠视网膜神经干细胞的诱导分化。方法 从新生大鼠视网膜分离具有自我更新能力的细胞克隆，传代。用脑源性神经营养因子(BDNF)与血清单独或联合培养诱导其分化，采用免疫细胞化学及免疫荧光化学技术对分化前后的细胞进行鉴定。结果 分离获得的细胞具有连续克隆的能力，表达nestin。分化后细胞分别表达多种神经元及神经胶质细胞的特异性标志物；BDNF与血清联合作用可使细胞向神经元分化的比例提高。结论 新生大鼠视网膜内存在具有自我更新与多分化潜能特性的神经干细胞，BDNF作为辅助诱导剂，可促进其存活、分化、成熟，并可能诱导其向神经元方向分化。     

新生大鼠神经干细胞的分离培养与观察

目的 建立神经干细胞的分离，培养及分化鉴定技术；观察神经干细胞生长，增殖及分化的特点，方法 分离新生SD大鼠脑室下区的组织，经消化及机械吹打后，采用原代贴壁及传代悬浮的方法，培养获得细胞克隆。应用免疫细胞化学方法及透射电镜检测技术，鉴定神经干细胞和分化的神经细胞，结果 从新生SD大鼠脑室下区分离的组织，经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具增殖的能力，原代和传代细胞抗原-nestin呈阳性，分化后的细胞可表达神经元，星形角质细胞和少突角质细胞的特异性抗原。结论 用此方法分离的细胞具有自我更新和分化潜能，有很强的增殖能力，是属于中枢神经系统的干细胞。     

大鼠胚胎脑组织神经干细胞的培养和鉴定

目的探讨从不同胎龄的大鼠脑组织中分离,培养神经干细胞(NSC)并对其鉴定,了解生物特性。方法通过采用机械分离和消化分离相结合的方法分离不同胎龄大鼠脑NSC。在无血清DMEM/F12(含20ng/m lbFGF,20ng/m lEGF及B27辅助培养液)中培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测作细胞鉴定。结果从不同胎龄的胎鼠脑组织中成功培养出神经干细胞,胎龄为12.5天的胎鼠提取的神经干细胞集落最多,在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖,形成悬浮生长的呈巢素蛋白(nestin)阳性的神经球;用血清诱导分化为大量表达NSE阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞。结论胎龄为12.5天胎鼠大脑皮质培养出的神经干细胞数量最多,可分化为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞。     

JNK信号转导通路对神经干细胞增殖的影响

目的 探讨JNK信号转导通路对新生大鼠海马神经干细胞增殖的影响.方法 采用无血清培养技术体外培养新生大鼠海马神经干细胞,传至第4代,大多数克隆球直径约为200 μm时,进行单细胞克隆培养,单细胞克隆形成的克隆球进行传代.将培养细胞随机分为2组,对照组采用神经干细胞培养液进行培养,实验组中在神经干细胞培养液的基础上添加不...     

神经干细胞培养及其影响因素

背景：神经干细胞移植治疗是中枢神经系统损伤性、难治性疾病研究的热点。如何有效提高神经干细胞存活率、克隆形成率将是其应用的重要基础和前提。 目的：探讨影响神经干细胞培养质量的可能因素,为神经干细胞的基础和临床应用研究提供参考。 方法：①神经干细胞分离和培养：分离出生24 h内SD大鼠的大脑,剪碎离心后以1×10⁸ L^-1的浓度接种,经含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基预培养4 h后改用无血清条件培养基(DMEM/F12,碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27)培养,2 d或3 d换液1次,6 d时传代。②神经干细胞鉴定：倒置显微镜下观察细胞形态及生物学特性;免疫组化检测第3代细胞神经巢蛋白表达和诱导分化后神经元特异性烯醇化酶和神经胶质酸性蛋白的表达。 结果与结论：出生24 h的新生大鼠可获得足量的神经干细胞;血清预培养可提高神经干细胞的增殖和存活率;免疫组化结合血清诱导分化可对培养的神经干细胞进行定性鉴定。取材时间、细胞接种密度、传代时间、细胞因子、血清等多种因素都将影响神经干细胞的培养质量。     

大鼠脑的神经干细胞的体外培养、增殖和分化

采用无血清培养基分离和培养大鼠脑的神经干细胞,并通过免疫荧光细胞化学技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向分化潜能的鉴定。鉴定结果表明,所分离培养的细胞为大鼠神经干细胞,具有神经干细胞的特征,并可在体外大量增殖和较长期培养,可经诱导分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞,是进行诱导分化的良好细胞模型。本文讨论了神经干细胞传代培养中应予以注意的问题和对策。     

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景：神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。 目的：观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。 方法：从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。 结果与结论：从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。     

ERK信号转导通路对新生大鼠海马神经干细胞增殖的影响

目的 探讨细胞外信号调解激酶(ERK)信号转导通路在新生大鼠海马神经干细胞增殖中的作用.方法 体外培养新生大鼠海马神经干细胞,传至第4代后进行单细胞克降培养并传代.将培养细胞分为2组,对照组采用神经干细胞培养液进行培养,实验组中在神经干细胞培养液的基础上添加不同浓度的ERK通路抑制剂U0126,Western Blot...     

离体培养海马神经干细胞中自噬现象的观察

目的:观察离体培养海马神经干细胞中自噬现象。方法:分离新生1 d大鼠海马组织,培养、扩增和传代,鉴定后取培养7 d的细胞,用RT-PCR法检测自噬特异性蛋白LC3和Bclin1的mRNA表达,Western Blot检测LC3和Bclin1的蛋白表达,透射电子显微镜观察神经干细胞中的自噬体的超微结构。结果:分离培养的神经干细胞呈Nestin免疫荧光阳性,且能分化为β-Ⅲtubulin~+的神经细胞和GFAP~+的胶质细胞;RT-PCR和Western Blot分别检测出神经干细胞有LC3、Bclin1的mRNA和蛋白表达;电镜下观察到神经干细胞胞质内有自噬体和自噬溶酶体。结论:正常离体培养的大鼠海马神经干细胞存在自噬现象,提示自噬可能对神经干细胞正常生理功能的维持有重要作用。     

兴奋性氨基酸抑制胎鼠神经干细胞的增殖

目的：研究兴奋性氨基酸对体外培养胎鼠神经干细胞（NSCs）增殖的影响。 方法:体外分离、培养与鉴定SD胚胎大鼠脑室下带(SVZ)神经干细胞，利用MTT比色法测定兴奋性氨基酸N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）和谷氨酸（Glu）对细胞增殖的作用。 结果:成功分离出具有胚胎源性的神经干细胞，NMDA和Glu均能导致神经干细胞的增殖活性下降。 结论:培养的SVZ区域细胞具有自我更新和多分化潜能，是中枢神经系统干细胞，兴奋性氨基酸能有效地抑制神经干细胞的增殖。     

大鼠骨骼肌植块诱导脊髓神经干细胞向运动神经元样细胞的分化

目的:分离大鼠胚胎的脊髓神经于细胞进行体外培养,探讨骨骼肌植块诱导其向运动神经元样细胞分化.方法:应用无血清培养技术分离培养脊髓神经干细胞,通过5-溴-2-脱氧尿苷标记、免疫荧光染色检测细胞增殖、分化情况;通过与骨骼肌植块共培养观察神经干细胞向运动神经无样细胞的分化情况.结果:大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;诱导分化后结果显示.骨骼肌植块组有7.87%的细胞呈胆碱乙酰基转移酶阳性.与10%胎牛血清组(0.94%)比较具有统计学意义.结论:从大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,骨骼肌植块可诱导脊髓神经干细胞分化为运动神经元样细胞.