健骨二仙丸含药血清对成骨细胞分化及Ⅰ型前胶原mRNA表达的影响

目的:在临床研究和动物实验的基础上,进一步探讨健骨二仙丸对成骨细胞分化的影响。方法:分离、培养人的原代成骨细胞,采用 PNPP 法、RIA 法、茜素红染色法以及定量 RT-PCR 之法分别检测碱性磷酸酶活性、骨钙素含量、矿化结节形成和Ⅰ型前胶原 mRNA 的表达,从而了解健骨二仙丸对成骨细胞分化的影响。结果:健骨二仙丸中、高剂量能显著增加碱性磷酸酶的活性及矿化结节形成的数量,促进成骨细胞骨钙素和Ⅰ型前胶原 mRNA 的表达(P<0.01,P<0.05),与雌激素(倍美力)组比较差异无显著性。结论:健骨二仙丸能有效促进成骨细胞的分化。     

健骨二仙丸提取物对大鼠体外培养成骨细胞增殖作用的研究

目的:探讨健骨二仙丸提取物对大鼠体外培养成骨细胞的作用效果及对成骨细胞增殖的作用机理。方法:采用新生大鼠颅骨进行成骨细胞分离,并在含10%的胎牛血清DMEM中进行体外培养,分别加入高、低剂量的健骨二仙丸提取物并与高、低剂量Premarin组、阴性组、Tamoxifen对照组、Tamoxifen阻断对照组进行对照,用MTT法进行成骨细胞增殖和活性检测。结果:在培养24h后,健骨二仙丸提取物对培养成骨细胞增殖有明显的促进作用,培养到48h促进作用更为明显,表现出一定的时间相关性,且其作用不能被Tamoxifen阻断或完全阻断。结论:健骨二仙丸提取物可促进成骨细胞增殖,且其对骨代谢的影响不通过或者主要不是通过雌激素样作用生效。     

健骨二仙丸对成骨细胞IGF-ImRNA表达的影响

目的:探讨健骨二仙丸含药血清调节成骨细胞增殖、分化以及防止成骨细胞凋亡的机制。方法:采用原代成骨细胞培养,定量 RT-RCR 和 Northern 印迹杂交等方法观察成骨细胞胰岛素样生长因子(in-sulin-like growth factor-1)IGF-ImRNA 的表达。结果:健骨二仙丸能显著增加成骨细胞 IGF-ImRNA 的表达。结论:健骨二仙丸促进成骨细胞 IGF-ImRNA 的表达,从而进一步促进成骨细胞的增殖、分化,改善成骨细胞功能,调节骨重建偶联。表明健骨二仙丸不仅能增加成骨细胞胶原蛋白的合成,而且能促进非胶原蛋白地表达。促进骨的形成是健骨二仙丸防治骨质疏松症的主要机制。     

健骨二仙丸对成骨细胞分化及IGF-ImRNA表达的影响

目的:在临床研究和动物实验的基础上,进一步探讨健骨二仙丸对成骨细胞分化的影响及其作用机制.方法:分离、培养人的原代成骨细胞,采用PNPP法、RIA法、茜素红染色法以及定量RT-PCR法分别检测碱性磷酸酶活性、骨钙素含量、矿化结节形成和I型前胶原mRNA的表达,从而了解健骨二仙丸对成骨细胞分化的影响.定量RT-PCR和Northern印迹杂交等方法交观察成骨细胞胰岛素样生长因子(insulin-likegrowth factor-I)IGF-I mRNA的表达.结果:健骨二仙丸中、高剂量能显著增加碱性磷酸酶的活性,及矿化结节形成的数量,促进成骨细胞骨钙素的释放(P＜0.01,P＜0.05),与雌激素(倍美力)组比较差异无显著性.显著增加成骨细胞Ⅰ型前胶原mRNA和IGF-I mRNA的表达.结论:健骨二仙丸促进成骨细胞IGF-I mR-NA的表达,从而进一步促进成骨细胞的增殖、分化,改善成骨细胞功能,调节骨重建偶联.表明健骨二仙丸不仅能增加成骨细胞胶原蛋白地合成,而且能促进非胶原蛋白地表达.促进骨的形成是健骨二仙丸作用的主要机制.     

健骨颗粒含药血清对成骨细胞增殖的影响

目的：探讨健骨颗粒含药血清对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响。方法：采用酶消化法培养SD大鼠成骨细胞,健骨颗粒含药血清干预,以生理盐水大鼠血清为对照,运用MTT法、流式细胞术检测成骨细胞增殖情况及细胞周期分布。结果：与同浓度生理盐水血清相比,20%健骨颗粒含药血清能明显促进体外培养成骨细胞增殖（P〈0.05）,明显降低G0/G1期细胞分数（P〈0.01或P〈0.05）,提高S期、G2/M期细胞分数和增殖指数（P〈0.01或P〈0.05）。结论：健骨颗粒含药血清能推进体外培养成骨细胞细胞周期,从而促进成骨细胞增殖。     

健骨二仙丸介导间充质干细胞的成骨细胞定向诱导及其成骨活性

目的:研究健骨二仙丸对间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)成骨细胞定向分化及其成骨活牲的影响.方法:采用标准Ficoll-Hypaque技术分离人脐血MSCs,以地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C为辅剂定向诱导成骨细胞,碱性磷酸酶、骨矿化结节、骨钙素及上清钙含量与Ⅰ型胶原作为成骨细胞鉴定与活性评价的指标.另以健骨二仙丸或健骨二仙丸合地寒米松、β-磷酸甘油与维生素C为辅剂诱导,用正常培养液作为空白对照,15 d后观测对比上述相关指标.结果:健骨二仙丸不能单独诱导MSCs向成骨细胞转化,对MSCs成骨细胞诱导前后的细胞形态无任何影响.定向成骨细胞诱导后,健骨二仙丸能显著提高其标志性产物碱性磷酸酶、骨矿化结节和上清钙、骨钙素以及Ⅰ型胶原的表达.结论:健骨二仙丸作为补肾益气药能促进MSCs成骨细胞定向转化,提高其成骨活性.     

骨疏康颗粒含药血清对成骨细胞增殖及细胞周期的影响

目的 探讨骨疏康颗粒含药血清对体外培养大鼠成骨细胞增殖及细胞周期分布的影响.方法 采用酶消化法进行大鼠成骨细胞培养,制备骨疏康颗粒含药血清干预成骨细胞,以生理盐水大鼠血清作对照,运用MTT法、流式细胞术检测成骨细胞增殖情况及细胞周期分布.结果 与同浓度生理盐水血清比较,骨疏康含药血清能不同程度地促进体外堵养成骨细胞增殖,其中以20%骨疏康含药血清促增殖作用最显著,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),且能明显降低G0/G1期细胞比例(P＜0.05),提高S期成骨细胞比例及增殖指数(P＜0.05).结论 骨疏康含药血清能加速成骨细胞周期,促进成骨细胞增殖.     

骨疏康颗粒含药血清对成骨细胞增殖及细胞周期的影响

目的探讨骨疏康颗粒含药血清对体外培养大鼠成骨细胞增殖及细胞周期分布的影响。方法采用酶消化法进行大鼠成骨细胞培养,制备骨疏康颗粒含药血清干预成骨细胞,以生理盐水大鼠血清作对照,运用MTT法、流式细胞术检测成骨细胞增殖情况及细胞周期分布。结果与同浓度生理盐水血清比较,骨疏康含药血清能不同程度地促进体外培养成骨细胞增殖,其中以20%骨疏康含药血清促增殖作用最显著,与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）,且能明显降低G0/G1期细胞比例（P〈0.05）,提高S期成骨细胞比例及增殖指数（P〈0.05）。结论骨疏康含药血清能加速成骨细胞周期,促进成骨细胞增殖。     

六味地黄丸、金匮肾气丸及健骨二仙丸含药血清对BMSCs成脂、成骨细胞分化相关基因的影响

目的研究补肾方药对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的前脂肪细胞向成骨分化的影响。方法采用全骨髓贴壁法培养BMSCs,用经典化学方法诱导BMSCs为前脂肪细胞,用六味地黄丸、金匮肾气丸和健骨二仙丸含药血清(含量浓度均为10%,分别代表补肾阴、补肾阳和补肾填精方药),干预前脂肪细胞成骨分化过程;采用反转录-实时荧光定量PCR技术(RT-real time qPCR),分别于第6、12和18天,检测成骨分化相关基因RUNX2、ALP、BGP、BMP2、BMP4、SPP1和IGF1 mRNA,及成脂分化相关基因LPL、FABP4和PPARγ mRNA表达水平。结果对于成骨分化相关基因,与对照组比较,第6天各组基因表达无显著变化(2.0>Ratio>0.5);第12天,金匮肾气丸组IGF1和RUNX2 mRNA表达升高较为显著,相对表达量(Ratio)分别为2.97和1.81;第18天,各组IGF1 mRNA表达均显著上升,六味地黄丸组、金匮肾气丸组和健骨二仙丸组Ratio值分别为3.74、12.60和8.35;各组SPP1 mRNA表达也显著升高,Ratio值分别为2.94、3.18和2.62。对于成脂分化相关基因,第6天,六味地黄丸组和金匮肾气丸组FABP4mRNA表达显著下降(Ratio分别为0.47和0.40),其他基因表达均下调,但不显著;第12天和第18天,成脂分化基因表达变化均无显著变化(2.0>Ratio>0.5)。结论成骨分化相关基因在补肾方药作用较晚时间出现表达上调的变化,而成脂分化相关基因在补肾方药作用较早时间即出现表达下调的改变,并且提示补肾阳法促进成骨分化、抑制成脂分化作用更为显著。     

健骨二仙丸提取物对大鼠体外培养成骨细胞PKC和Bag-1的影响

目的:探讨健骨二仙丸提取物对大鼠体外培养成骨细胞的作用机理。方法:采用新生大鼠颅骨进行成骨细胞分离,并在含10%的胎牛血清DMEM中进行体外培养,分别加入高、低剂量的健骨二仙丸提取物并与高、低剂量Premarin组、阴性组、Tamoxifen对照组、Tamoxifen阻断对照组进行对照,用Western免疫印迹检测蛋白激酶C、抗凋亡蛋白Bag-1表达。结果:健骨二仙丸提取物能明显提高体外成骨细胞PKC的表达量和抗凋亡蛋白Bag-1的表达量。结论:健骨二仙丸提取物可促进成骨细胞增殖并明显提高PKC和抗凋亡蛋白Bag-1的表达量是其防治骨质疏松的机理之一。     

克瘤丸对结肠癌细胞HT-29细胞凋亡及细胞周期的影响

目的 观察克瘤丸对人结肠癌细胞生长的影响及其作用机制.方法 将4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml浓度克瘤丸作用于HT-29细胞24～48h后,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测克瘤丸对HT-29细胞增殖的影响,AnnexinV单染法检测克瘤丸对HT-29细胞凋亡的影响,流式细胞仪检测细胞周期的分布情况. 结果 与对照组比较,浓度为4、2、1、0.5mg/ml克瘤丸作用HT-29细胞48h,OD值、48h抑制率差异均有统计学意义(P＜0.01);4、2、1mg/ml浓度克瘤丸作用HT-29细胞48h,OD值、48h抑制率均明显优于0.25mg/ml及0.5mg/ml浓度克瘤丸(P＜0.01).与1mg/ml浓度比较,2mg/ml、4mg/ml组凋亡率差异有统计学意义(P＜0.05).4mg/ml时G0/G1期前出现明显的亚二倍体区,与1mg/ml、2mg/ml组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 克瘤丸对人结肠癌细胞HT-29的增殖具有抑制作用并能够引起该细胞的凋亡.     

鳖甲煎丸对人肾小球系膜细胞干预作用的研究

目的:探讨中药鳖甲煎丸药物血清对人肾小球系膜细胞(MCs)增殖和凋亡作用的影响。方法:应用细胞培养技术,进行人MCs培养,采取血清药理学方法,制备鳖甲煎丸药物血清,利用脂多糖(LPS)为刺激因子,将培养的MCs分为空白对照组(简称空白组);鳖甲煎组;脂多糖组;脂多糖鳖甲煎组(简称脂甲组)。应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞仪检测MCs增殖、凋亡和细胞周期。结果:LPS刺激后,增殖指数明显提高,与空白组比较有明显差异(P<0.01);鳖甲煎丸药物血清能明显抑制人MCs增殖(P<0.01),并且使多数MCs阻滞在G0/G1期,能诱导人MCs发生凋亡。结论:抑制MCs增殖和促进凋亡可能是鳖甲煎丸延缓慢性肾脏疾病进展的部分作用机制。     

泽泻醇-B-乙酸酯对结直肠癌HCT116细胞增殖和周期的影响

目的:研究泽泻提取物泽泻醇-B-乙酸酯对人结直肠癌细胞株HCT116生长的影响。方法:采用不同浓度的泽泻醇-B-乙酸酯分别作用于大肠癌HCT116细胞24、48、72小时后,应用MTT(四氮甲基唑蓝)测定细胞生长抑制效应,流式细胞仪(FCM)检测细胞周期变化。结果:泽泻醇-B-乙酸酯能显著抑制HCT116细胞增殖,且在一定的浓度范围内呈时间和浓度依赖性。FCM检测结果显示随着作用时间的延长或者药物剂量的增加,G_0/G_1期的细胞显著增加,使细胞发生G_1期阻滞,进入S期、M期的比例降低,细胞增殖受抑。结论:泽泻醇-B-乙酸酯能以时间和浓度依赖的方式抑制HCT116细胞生长;泽泻醇-B-乙酸酯将细胞阻止在G_0/G_1期,进入S期、M期的比例降低,从而通过影响细胞周期进程来抑制细胞增殖。     

华蟾素注射液联合放疗对食管癌细胞增殖与周期的影响

目的:观察华蟾素注射液对食管癌细胞ECA109增殖的抑制作用,分析华蟾素联合X射线照射对细胞周期的影响,探讨华蟾素注射液与放疗联合效应的机制。方法:实验分空白组、华蟾素组、放疗组、华蟾素+放疗组,作用食管癌ECA109细胞48 h后,应用噻唑蓝(MTT)比色法检测华蟾素注射液对ECA109细胞增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测细胞周期的变化,反转录-PCR(RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)检测各组泛素连接酶(RNF2),p16和周期蛋白依赖性激酶(CDK4)mRNA和蛋白表达。结果:华蟾素可显著抑制食管癌ECA109细胞的增殖,且呈浓度和时间依赖性。与空白组比较,各药物组中DNA合成前期(G0/G1期)细胞比例明显升高(P0.05),S期细胞比例明显下降(P0.05)。与空白组比较,华蟾素+放疗组中RNF2 mRNA和蛋白明显降低(P0.05),且各药物组均能促进p16 mRNA和蛋白表达(P0.05),抑制CDK4 mRNA和蛋白水平(P0.05)。结论:华蟾素注射液能有效抑制人食管癌ECA109细胞增殖,并将细胞阻滞于G0/G1期,机制可能与降低RNF2,CDK4水平,上调p16基因水平相关。     

菊藻丸含药血清对人激素非依赖性前列腺癌细胞增殖和周期的影响

目的探讨含菊藻丸大鼠血清对人激素非依赖性前列腺癌细胞系PC-3增殖和细胞周期的影响。方法以3种不同质量浓度的菊藻丸水剂对成年雄性去势SD大鼠灌胃。另以等量生理盐水灌胃进行对照。末次灌胃后于60～90min时间段内取下腔静脉血制成血清,用以体外培养PC-3;用MTT法测定培养4、24、48、72h的细胞存活率,用流式细胞仪测定培养48h的细胞周期分布。结果高、中剂量的含药血清可抑制PC-3细胞的生长,且抑制作用随时间的延长而增强,低剂量无明显抑制作用。含药血清高剂量组G1-G0期细胞比例低于中、低剂量组,G2/M期细胞比例高于中、低剂量组。结论含菊藻丸血清能抑制PC-3细胞增殖,可用于动物实验进一步明确体内有无抗肿瘤作用;不同质量浓度含药血清对细胞周期影响不同,机制有待研究。     

汉黄芩素对人肺腺癌SPC-A-1细胞增殖和周期的影响

目的:研究汉黄芩素对人肺腺癌SPC-A-1细胞增殖和周期的影响。方法:以不同浓度的汉黄芩素作用于SPC-A-1细胞,检测细胞抑制率、凋亡及细胞周期。结果:MTT法测得汉黄芩素的IC50为24.7 mg.L-1,能够明显抑制SPC-A-1细胞的集落形成能力。汉黄芩素作用于SPC-A-1细胞后,荧光倒置显微镜下观察到细胞凋亡的形态学改变。Annexin V-FITC/PI双标法证实汉黄芩素可以诱导SPC-A-1细胞凋亡,并具有剂量依赖性。流式细胞仪结果显示,不同浓度汉黄芩素使SPC-A-1细胞周期出现显著的变化,10,20 mg.L-1汉黄芩素可将周期阻滞在G0/G1期,30,40 mg.L-1汉黄芩素则使细胞周期堆积在S期,并且随着给药剂量的增加,凋亡峰显著升高。结论:汉黄芩素能明显抑制SPC-A-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,并对细胞G0/G1和S期具有阻滞效应,具有抗肿瘤作用。     

二仙汤及其药物血清对GT1-7细胞增殖及胰岛素样生长因子-1 mRNA的影响

目的 GT1-7细胞株是促性腺激素释放激素(GnRH)神经内分泌细胞株,本实验观察补肾方二仙汤及其温肾、滋阴两个拆方药物血清对 GT1-7细胞株增殖及胰岛素样生长因子-1(IGF-I)mRNA 的影响。方法运用 Northern blot 方法观察 IGF-I mRNA 水平的变化;用 MTT 法观察 GT1-7细胞增殖情况。结果 (1)二仙汤及其温肾、滋阴两个拆方药物血清都能增加 IGF-I mRNA 的表达,其中以滋阴组作用最显著;(2)全方组和滋阴组药物血清能促进 GT1-7细胞增殖,而温肾组无明显变化。结论补肾方二仙汤可能通过作用于 IGF-I 的mRNA 水平而影响 GT1-7细胞的增殖和 GnRH 释放,温肾组和滋阴组作用于该细胞的机制可能有所不同。     

髓清丸对内皮细胞增殖影响的血清药理学研究

目的研究中药复方髓清丸是否对内皮细胞的增殖有影响。方法采用血清药理学方法,以含髓清丸药物兔血清,体外培养观察内皮细胞系 ECV304的增殖、细胞周期及 DNA 含量等细胞学指标变化。结果与正常胎牛血清对照组和兔血清对照组比较,含髓清丸低、高剂量组的活细胞百分率、活细胞浓度均降低(P<0.05,P<0.01);含髓清丸血清低、高剂量组的培养液孵育的内皮细胞 OD 值呈不同程度的降低(P<0.01),高剂量组细胞毒活性>20%;髓清丸高、低剂量组内皮细胞 G_1期百分率均明显高于胎牛血清和正常兔血清组(P<0.01),而 S 期和 G_2期百分率也均较胎牛血清组和正常兔血清组有减低趋势。结论髓清丸体外有一定的抑制内皮细胞增殖的活性。