组织工程骨软骨复合组织构建研究进展

本文综述了近几年骨软骨组织工程研究进展。查阅近几年有关骨软骨组织工程的文献,于支架材料、信号因子、种子细胞及制备技术等方面加以总结分析。骨软骨组织工程根据仿生学理论与方法完成组织替代物的制备并对损伤或有缺陷组织进行修复,可有效恢复受损骨软骨组织的结构功能与力学特性,是一种具有长远意义的综合交叉学科。目前,骨软骨组织工程策略针对骨软骨损伤取得了一定的成果,但仍需进一步发展,最终为骨软骨损伤提供一种成熟的临床治疗方法。     

组织工程骨软骨复合组织构建研究进展

采用组织工程学方法构建骨软骨复合组织是在以往单独构建骨、软骨基础上发展而来的新的研究领域。本文综述了组织工程骨软骨复合组织构建概况、支架材料、种子细胞的选择等方面的最新研究进展。     

组织工程骨软骨复合体的研究进展及展望

随着材料科学、细胞生物学、力学生物学以及生物反应器技术的进步，采用组织工程的方法构建合适形状和大小的组织工程骨软骨复合体为骨软骨复合缺损的修复提供了新的希望。本文将对这一领域进行综述。     

组织工程化骨软骨复合体的构建

传统的治疗关节骨软骨损伤的方法包括自体、同种异体骨软骨柱移植、软骨清除，甚至关节假体置换等，在取得一定成功的同时，也出现了诸如供区继发性受损、免疫排斥、疾病传播及金属假体松动等不足，并且长期疗效不理想。组织工程技术的出现与发展为该类问题的解决提供了一个新途径。现就我们的理解并结合文献，对组织工程化骨软骨复合体的构建的有关方面做一综述。     

干细胞构建软骨组织工程研究进展

[背景]创伤后软骨的再生能力是很有限的,而目前处理小的软骨缺损的方法有以下几种:(1)姑息治疗,包括关节镜下的清理和冲洗;(2)修补治疗,骨髓刺激疗法,如微骨折术;(3)修复治疗,包括骨软骨的移植和自体软骨细胞的移植。大的缺损的处理,一般使用同种异体骨软骨移植,或全关节成形术。然而软骨缺损治疗的未来,要靠软骨再生技术所提供的生物医学解决方法。[目的]探讨近年来软骨组织工程的进展,总结干细胞及其他方面进步和发展方向。[方法]检索关于干细胞构建软骨组织工程的文章,在标题和摘要中以"stem cell、tissue engineering、cartilage、bioreactor"为检索词进行检索。最终选择45篇文献进行综述。[结果与结论]实验室和临床研究都已经验证了软骨组织工程治疗大的缺损的方法。再生的软骨可以来自于软骨细胞,多能干细胞和间充质干细胞。支架材料的来源包括蛋白质,碳水化合物,合成材料,复合高分子材料等。软骨诱导生长因子的应用可以加强软骨的形成。生物反应器的发明,能加强体外组织工程软骨的营养运输,提供所需的机械刺激。多学科研究方法的运用,使得临床运用软骨再造技术有希望变为现实。     

利用脂肪干细胞构建组织工程软骨修复兔膝关节软骨缺损

目的探讨以脂肪于细胞（ADSCs）复合脱细胞软骨基质支架构建组织工程软骨修复兔膝关节软骨缺损的效果。方法以人关节软骨脱细胞基质为支架，复合经诱导的兔ADSCs，体外分别经静态培养和生物反应器培养，构建组织工程软骨。对膝全厚关节缺损进行修复，并与单支架组、空白对照组比较，其中空白对照组12个关节，脱细胞软骨支架组16个关节，静态培养细胞支架组24个关节，生物反应器培养细胞支架组8个关节。分别于术后3、6个月对修复关节进行大体、组织学及免疫组化观察。结果实际完成观察的关节数为44个，其中空白对照组9个，脱细胞软骨支架组11个，静态培养细胞支架组18个，生物反应器培养细胞支架组6个。空白对照组全为纤维组织或纤维软骨样修复；单支架组5个关节为未成熟透明软骨，无成熟透明软骨形成；静态培养细胞支架组83．3％为透明软骨，其中3个关节为成熟透明软骨，12个关节为未成熟透明软骨；生物反应器培养细胞支架组100％为透明软骨，其中2个为成熟透明软骨，4个为未成熟透明软骨。Wakitani评分各组差异有统计学意义（P〈0．05）。结论ADSCs复合脱细胞软骨基质支架能良好地修复兔膝关节全厚软骨缺损，应用生物反应器技术有助于构建组织工程软骨，促进软骨缺损的修复。     

模拟微重力培养在骨和软骨组织工程中的应用

骨和软骨组织工程主要致力于骨和软骨的形成和再生,通过建立细胞与生物材料的三维复合物,构建具有生物活性的组织,进而对受损的骨和软骨组织进行形态结构和功能的重建以求达到永久性替代.目前模拟微重力条件下骨和软骨组织工程的研究表明,微重力培养环境有利于细胞体外增殖和分化,并维持细胞的表型;有利于细胞和材料的三维立体复合;有利于构建的组织更接近于活体.因此微重力细胞培养为骨和软骨组织工程的研究开辟了新的道路.     

组织工程骨软骨复合物的构建与形态学观察

目的探讨采用组织工程技术构建骨软骨复合物的可行性。方法将骨髓基质细胞(BMSCs)成诱导软骨后接种于快速成形的三维支架材料聚乳酸／聚羟乙酸共聚物(PLGA)构建组织工程软骨，经成骨诱导的BMSCs接种于聚乳酸／聚羟乙酸共聚物／磷酸三钙(PLGA／TCP)构建组织工程骨，在体外分别培养2周后，将两种工程化组织及两者以无损伤线缝合形成的组织工程骨软复合体分别植入自体股部肌袋，术后8周取材，行组织学观察。结果术后组织学观察表明。组织工程软骨在体内可形成软骨组织组织工程骨在体内可形成骨组织，两者的复合体在体内可形成骨软骨复合物。结论以骨髓基质细胞为种子细胞、以快速成形的生物降解材料为支架体外构建的组织工程骨软骨复合物，可在体内形成骨软骨组织，有望用于骨软骨缺损的修复。     

三维培养骨软骨复合体融合研究

目的 探讨三维培养体系中构建骨软骨复合体的可行性.方法 取10周以内流产胚胎组织原代培养人胚胎干细胞,按1×1O7个/ml细胞数植入自制的微流控支架三维培养系统,分别用相应细胞因子诱导分化成骨细胞和软骨细胞.体外培养3 d后植入裸鼠体内,8周后取出标本进行组织学观察.结果 支架骨端孔隙率为45%,孔径为125～150 μm;软骨端孔隙率为85%,孔径150～250 μm.组织学检查显示再造组织形成了骨和软骨复合组织,但是两者之间仍有界限,完全融合失败.结论 三维培养骨软骨复合体,可成功再造出骨软骨复合组织,但是完全融合尚需增加支架软骨端的孔隙率和孔径,以及延长体内培养的时间.

Abstract：

Objective To explore the feasibility of construction of bone cartilage complex in the three-dimensional culture. Methods The abortive embryos within 10 weeks were obtained for primary culture of human embryonic stem cells (hESCs). The hESCs about 1 × 107/ml were implanted into microfluidic three-dimensional culture system. hESCs were induced to differentiate into osteoblasts and chondrocytes by cytokine respectively. After culture in vitrofor 3 days, the system was transplanted in nude mouse.Eight weeks after implantation, the specimens were harvested and examined histologically. Results In the microfluidic three-dimensional culture system, the porosity of bony part was 45%, and the aperture was 125-150 μm; the porosity of chondral part was 85%, and the aperture was 150-250 μm. In the newly formed tissue, it demonstrated the formation of bone cartilage complex tissue under the microscopy. However, there was still a boundary between the two tissues. The perfect fusion of bone and cartilage became failure. Conclusion In the experiment, bone cartilage complex tissue can be reconstructed in three-dimensional culture system, but the perfect fusion needs to increase the porosity and the aperture of chondral part, together with culture time elongation in vivo.     

关节软骨组织工程支架的研究进展

目的对软骨组织工程支架材料的研究现状进行综述,并对其发展前景进行展望。方法广泛查阅近年来关节软骨组织工程支架的相关文献,并对多种天然生物支架材料和人工合成支架材料的相关实验及临床应用效果进行分析总结。结果软骨组织工程支架的设计对软骨组织损伤修复成功与否至关重要,理想的软骨支架可以引导并促进新生软骨组织的形成。目前所应用的支架材料均有其局限性。结论进一步深入研究软骨组织工程支架,对未来临床软骨损伤的修复具有重要意义。     

力学刺激联合诱导因子对组织工程软骨的影响

目的力学刺激与诱导因子是软骨组织工程中的重要诱导因素,研究力学刺激联合诱导因子对组织工程软骨的影响。方法 7日龄长枫杂交仔猪,体重3～6 kg,用于分离培养BMSCs,取第2代细胞以5×107个/mL密度接种于聚羟基乙酸-聚乳酸[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]支架上制备细胞-支架复合物。实验随机分为5组,A、B、C组分别对细胞-支架复合物采用软骨诱导培养液诱导、单纯力学加载、力学加载联合软骨诱导液培养处理,其中力学加载参数为1 Hz、0.5 MPa、4 h/d;D、E组分别为单纯细胞-支架复合物阴性对照和猪自体软骨阳性对照。4周后各组分别取材行大体观察、组织学检测及实时荧光定量PCR检测。结果 C组细胞-支架复合物厚度、弹性模量及最大值负荷均显著高于A、B组(P<0.05)。A、B、C组组织切片HE染色均可见有软骨陷窝形成,番红O染色提示支架复合物的细胞外基质中有大量蛋白聚糖(glycosaminoglycan,GAG)形成,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均显示阳性结果,其中A组染色深度强于B组,C组强于A、B组,且最接近E组;C组GAG含量显著高于A、B组(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测示,C组Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA表达量均显著高于A、B组,且A组各基因表达量均高于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论力学刺激联合软骨诱导因子能更好地促进细胞-支架复合物上的BMSCs产生更多胶原和GAG等细胞外基质,增强其力学特性,更有助于其向软骨细胞分化。     

组织工程骨-软骨复合组织种子细胞的获取与培养

目的:探索体外培养组织工程骨-软骨复合组织种子细胞的条件,并观察其部分生物学活性。方法:采用机械-酶消化法对3周龄新西兰大白兔耳软骨和关节软骨消化来获得软骨细胞,采用全骨髓贴壁法来获得骨髓间充质干细胞,对两种细胞进行原代和传代培养,通过倒置相差显微镜观察细胞形态、绘制生长曲线、免疫组化染色等对细胞进行生物学特性分析。结果:原代培养的软骨细胞以多角形或三角形为主,传代3次以后出现去分化。形态学和免疫组化显示细胞3代以内可以保持表型稳定,具有较强的增殖及分泌细胞外基质的能力,而且耳软骨及关节软骨细胞在实验中没有表现出明显的生物学差别。采用贴壁筛选法获得的BMSCs呈长梭形或多边形,生长曲线呈"S"形,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,细胞生长增殖能力旺盛。结论:体外分离培养的软骨细胞和骨髓间充质干细胞符合组织工程要求,能够作为骨-软骨复合组织的种子细胞。     

组织工程骨-软骨复合体修复犬股骨头负重区大面积骨软骨缺损的实验研究

目的 探讨采用犬股骨头负重区骨和天然软骨制备的骨-软骨双层支架复合成软骨诱导的骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)修复犬股骨头负重区大面积骨软骨缺损的疗效.方法 利用软骨细胞外基质作为软骨支架部分,犬股骨头负重区骨柱经脱细胞处理后作为骨支架部分,采用相分离技术制备骨-软骨双层支架.将成软骨诱导的BMSCs种植到双层支架上体外构建组织工程骨-软骨复合体,并以此修复犬股骨头负重区大面积骨软骨缺损(直径11 mm,高10 mm),第3、6个月时分别取材,行大体、X线片、组织学、Micro-CT和生物力学等检测.结果 X线片及大体观察:3个月时可见股骨头负重区出现轻度塌陷;6个月时出现严重塌陷,呈重度骨关节炎改变.组织学观察:第3、6个月时软骨缺损部分均以纤维组织或纤维软骨充填,周围软骨退变,骨缺损部分不同程度塌陷,与宿主骨质结合紧密.第3、6个月时骨软骨缺损的骨体积分数均低于正常股骨头,差异有统计学意义.6个月时重建软骨下骨的刚度明显低于正常股骨头,差异有统计学意义.结论 结构性骨-软骨双层支架复合成软骨诱导的BMSCs修复犬股骨头负重区骨软骨缺损效果不佳,易导致股骨头塌陷.

Abstract：

Objective To investigate the effects of the novel scaffold on repairing large,high-loadbearing osteochondral defects of femoral head in a canine model.Methods The biphasic scaffolds were fabricated using cartilage extracellular matrix (ECM)-derived scaffold (cartilage layer) and acellular bone matrix (bone layer) by phase separation technique.Articular high-load-bearing osteochondral defects with a diameter of 11-mm and the depth of 10-mm were created in femoral heads.The defects were treated with constructs of a biphasic scaffold seeded with chondrogenically induced bone marrow-derived mesenehymal stem cells (BMSCs).The outcomes were evaluated for gross morphology,histological,biomechanical and micro-CT analysis at the third and sixth month after implantation.Results The gross and X-ray results showed femoral head slightly collapsed at the third month and severely collapse at the sixth month.Histological analysis showed cartilage defects were repaired with fibrous tissue or fibrocartilage with severe osteoarthritis and the varied degrees of the collapse of femoral heads were presented.Micro-CT showed that the values of bone volume fraction in defect area were always lower than those of the normal area in the femoral heads.Biomechanical analysis showed rigidity of the subchondral bone in defect area was significantly lower than that in normal area in the femoral heads at the sixth month.Conclusion The ECM-derived,integrated biphasic scaffold seeded with chondrogenically induced BMSCs could not successfully repair the large high-load-bearing osteochondral defects of the femoral head.     

组织工程骨对羊节段性骨缺损的修复

目的探讨自体骨髓间充质干细胞(MSCs)复合生物活性陶瓷材料β磷酸三钙(TCP)修复羊跖骨节段性缺损的能力。方法将24只成年中国美利奴绵羊随机分成3组，制备单侧跖骨21mm长节段性缺损，缺损分别采用相应方法修复：材料 细胞组，缺损区植入β-TCP MSCs复合体(n=10)；单纯材料组，缺损区植入单纯β—TCP(n=10)；空白组，缺损区不作处理(n=4)。术后1、3和6月处死动物并取材，做大体形态学、组织学、X线检查。结果术后6月检查结果显示，在材料 细胞组，骨生成能力明显强于单纯材料组；而空白组仅在骨折断面处生成少量松质骨，骨缺损不能修复。结论生物活性陶瓷β—TCP与MSCs结合能明显提高骨生成速度，在修复长骨干节段性缺损方面具有潜在的临床应用价值。     

软骨细胞和骨髓间质干细胞混合培养构建组织工程软骨的实验研究

目的 探讨软骨细胞和骨髓间质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)混合培养对构建组织工程软骨的影响,并确定两者的最佳比例.方法 体外分离培养兔(1月龄)关节软骨细胞和BMSCs,按不同比例(软骨细胞和BMSCs的浓度比为:4:1、2:1、1:1、1:2、1:4及单纯软骨细胞)混合培养一代.以4×107/ml的细胞终浓度接种40μl于聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA:4mm×4mm×2mm),静态培养2 d,然后移至周期性压力场(压力0～200 kPa,频率:0.1 Hz,时间:8 h/d)培养3周.收获组织工程软骨行大体观察,组织切片,定量检测糖胺聚糖(glyeosaminoglycans,GAGs)含量、DNA含量及Ⅱ型胶原染色面积.结果 软骨细胞和BMSCs混合培养组与单纯软骨细胞组相比,体积较大,表面光滑,有弹性,有光泽.组织学检查显示混合培养组结构致密,细胞外基质分布更均匀,其中软骨细胞和BMSCs的浓度比为2:1组可见软骨陷窝.混合培养组的Ⅱ型胶原染色面积、GAGs含量、DNA含量高于单纯软骨细胞组,其中软骨细胞和BMSCs的浓度比为2:1组含量最高,与其他比例混合组比较,差异有统计学意义.结论 软骨细胞和BMSCs混合培养能提高组织工程软骨的质量,其中以软骨细胞和BMSCs的浓度比为2:1最佳.     

毛乳头细胞促进组织工程皮肤血管化的实验研究

目的探讨毛乳头细胞对表皮干细胞与同种异体脱细胞真皮基质构建的组织工程皮肤血管化的影响。方法取门诊包皮环切术患者皮肤,用于表皮细胞培养;取孕19、20周引产胎儿头部皮肤,用于毛乳头细胞培养;患者及家属均知情同意。以中性蛋白酶联合胰蛋白酶消化、分离表皮细胞,IV型胶原黏附法分选表皮于细胞;以Ⅰ型胶原酶消化法分离毛乳头,常规成纤维细胞培养液培养。以同种异体脱细胞真皮基质为支架,在真皮基质的真皮乳头侧种植毛乳头细胞,基底膜侧种植表皮干细胞构建实验组组织工程皮肤替代物;对照组组织工程皮肤替代物不种植毛乳头细胞。取6～8周龄BALB/C-nu裸鼠60只,随机分成实验组和对照组（n=30）;实验动物背部制造1 cm×1 cm大小全层皮肤缺损模型,将两组组织工程皮肤替代物移植修复创面,2周后观察移植皮肤成活率。术后2、4周,取移植皮肤替代物标本,行HE及免疫组织化学染色,观察移植皮肤替代物CD31表达水平,并计算两组标本血管密度。结果Ⅳ型胶原分选后表皮细胞同时表达角蛋白19、β₁整合素,提示为表皮干细胞。由毛乳头培养出的细胞表达α平滑肌肌动蛋白,提示为毛乳头细胞。动物移植术后2周,实验组移植皮肤成活率为93.3%（28/30）,对照组为80.0%（24/30）,比较差异有统计学意义（χ²=2.31,P=-0.00）。HE染色观察示实验组表皮层达12层,表皮细胞体积较大;对照组表皮层达4～6层,表皮细胞体积较小。实验组术后2、4周,血管密度分别为（38.56±2.49）个/mm2和（49.12±2.39）个/mm²,对照组分别为（25.16±3.73）个/mm²和（36.26±3.24）个/mm²,两组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。结论毛乳头细胞可促进移植皮肤替代物血管形成,利于表皮层重建,提高组织工程皮肤移植成活率。     

小口径组织工程血管体外构建的研究

目的 探讨间充质干细胞体外构建组织工程血管的可行性.方法 将体外培养扩增的犬骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞,接种于ε-己内酯/L-丙交酯(PCLA)支架上,将其置于生物反应器内,在搏动性力学(100±20/55±20)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)刺激条件下培养.3 d后行血管组织学检测.结果 血管支架拉伸强度6.1 MPa;骨髓间充质干细胞成功定向分化为平滑肌样细胞和内皮样细胞;血管腔内表面完全为细胞覆盖,表面的细胞沿液体流动的方向分布;种植的部分细胞已经渗透入血管壁内.结论 骨髓间充质干细胞可作为种子细胞,与PCLA支架在生物反应器内构建组织工程血管.     

组织工程骨一软骨复合组织体内异位移植的研究

目的：本实验构建组织工程骨软骨复合组织并采用异体异位移植方式,探讨外来因素对移植物的影响,为进一步研究奠定基础。方法：制备明胶一硫酸软骨素一透明质酸及明胶一陶瓷化骨多孔复合支架,复合软骨细胞和骨髓间充质干细胞,将上述组织按照体外培养时间不同分为4纽,植入裸鼠皮下,观察复合组织形成情况。结果：各实验纽在观察期内裸鼠背部均无感染,复合组织表面完整薄层纤维层下可见类似透明样软骨组织,体积均出现不同程度的收缩。HE染色各实验组均可发现,在软骨层和骨层,分别可见成软骨细胞、软骨细胞、骨细胞及相应的细胞外基质,且可以观察到类似正常结构的潮线出现,交界区软骨组织出现骨化,在组织外围,出现了不同程度向纤维样组织转变的现象。结论：经过体外短时间的诱导使得细胞具有分化趋势后,早期植入体内有助于组织工程骨一软骨复合组织的形成。