小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞

目的 建立小鼠胚胎干细胞(mESCs)分化为胰岛素分泌细胞的体外诱导体系。方法mESCs经拟胚体(EB)阶段,筛选出nestin阳性细胞,扩增培养后,用不同浓度烟碱对nestin阳性细胞进行诱导,观察诱导细胞的形态变化,并进行免疫组化染色、流式细胞仪分析和胰岛素分泌实验。结果 不同大小EB中nestin阳性细胞比例不同,直径为100μm大小EB中较多。nestin阳性细胞经烟碱诱导15d后,可形成分泌胰岛素的胰岛样细胞团,大部分细胞团胰岛素抗体检测为阳性。以10mmol/L烟碱诱导分化后得到的胰岛素分泌细胞较0mmol/L和5mmol/L多,这些细胞在不同浓度葡萄糖刺激下能分泌不同量胰岛素。结论10mmol/L烟碱诱导小鼠ESCs 15d,可获得较多胰岛素分泌细胞。     

胚胎干细胞R1诱导成胰岛素分泌细胞团的研究

目的 建立体外培养和扩增胚胎干细胞R1(ES-R1)的最佳条件;利用多种生长因子,优化培养条件,体外定向诱导ES-R1分化为胰岛素分泌细胞(IPCs).方法 以丝裂霉索-C处理的MEF为饲养层,培养液中加白血病抑制因子(LIF),ES-R1维持未分化状态并扩增,进行碱性磷酸酶染色.胚胎干细胞(ESCs)悬浮培养制成拟胚体(EBs),对培养至第4d的EBs开始定向诱导,依次加入无血清的ITS培养液,胰岛前体细胞增殖培养液和胰岛分化培养液,每种培养液内各培养6d,获得形态功能较成熟的IPCs.采用DTZ染色、免疫荧光染色、胰岛素刺激实验等方法对IPCs进行检测.结果 ESCs在饲养层细胞上呈克隆状生长,经碱性磷酸酶染色为阳性;EBs经3种诱导液诱导成三维立体的IPCs,IPCs被DTZ染成猩红色,胰岛素和胰高血糖素阳性表达,胰岛素刺激实验阳性.结论 ES-R1在体外培养时,用MEF做饲养层,培养液中添加一定浓度的LIF,可以最好地保持未分化状态并大量增殖.用分阶段添加不同生长因子的方法诱导ES-R1定向分化生成的IPCs在形态和功能上具有胰岛的特性.     

小鼠骨髓多能成体祖细胞的分离、培养及体外诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究

目的：探讨培养骨髓多能成体祖细胞的条件和生物学特性及其向胰岛素分泌细胞分化的可能性。 方法： 采用文献报道的条件培养液培养小鼠骨髓多能成体祖细胞，观察其细胞形态、生长情况、细胞表面标志及mRNA水平，检测其oct-4基因表达，并以含胰高糖素多肽-1的无血清培养液诱导分化细胞，基因水平检测与胰岛素分泌细胞有关的基因表达。 结果： 小鼠骨髓多能成体祖细胞类圆形，细胞核大，胞质少；细胞增殖能力尚可；细胞表面CD13+、CD44-、CD45-、MHCⅡ-；有oct-4基因表达；诱导分化后，可见与胰岛素分泌细胞有关的基因表达。 结论： 成功培养小鼠骨髓多能成体祖细胞，具有与文献报道类似的生物学特征；有被诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性。     

大鼠骨髓间质干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞的实验研究

目的研究体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）横向分化为胰岛素分泌细胞的可能性,并了解该细胞是否具备分泌胰岛素和胰高血糖素的功能.方法从健康成年大鼠骨髓中分离BMSCs,通过传代对细胞进行纯化和扩增.采用两期诱导方案,用诱导液1使BMSCs向巢蛋白（nestin）阳性的祖细胞分化;用诱导液2使nestin阳性的祖细胞向胰岛素分泌细胞分化.用双硫腙染色鉴定胰岛素分泌细胞团;免疫细胞化学法检测诱导前后nestin、胰岛素及胰高血糖素蛋白的表达;采用放射免疫分析法检测葡萄糖刺激后上清中胰岛素的量.结果BMSCs经第一期诱导5d可分化成nestin阳性的祖细胞,双硫腙染色阳性.免疫细胞化学显示,经两期,诱导后的细胞表达胰岛素、胰高血糖素等激素.放射免疫分析结果显示,诱导后的细胞团可以分泌胰岛素,糖反应性较弱.结论健康成年大鼠骨髓间质干细胞在体外可以被诱导分化为胰岛样细胞团,且具有可重复性.     

胚胎干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞的研究进展

胰岛移植是治疗糖尿病的有效方法之一。胚体干细胞在体外定向分化为胰岛素分泌细胞为胰岛移植提供了足够的细胞来源。概述了近年来胚胎干细胞向胰腺细胞系的诱导分化所取得的进展。     

糖尿病患者血液细胞来源多能干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞

目的建立和鉴定1型糖尿病(T1DM)患者血液细胞来源诱导多能干细胞(iPSCs),研究其在体外诱导分化为胰岛素分泌细胞(IPCs)的潜能及对糖尿病小鼠的治疗效果。方法将表达OCT4、SOX2、LIN28、L-MYC和KLF4转录因子的oriP/EBNAl附加体电转染T1DM患者外周血红系祖细胞使其重编程获得iPSCs,通过形态、核型鉴定、碱性磷酸酶染色、RT-PCR和体外畸胎瘤实验检测其干细胞多能性。诱导iPSCs分化为IPCs,对其进行RT-PCR检测和葡萄糖刺激实验,并将其移植入C57BL/6J雄性糖尿病小鼠左肾包膜下,监测血糖、体质量和糖耐量变化。结果获得的iPSCs核型正常,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达干细胞多能性基因OCT4、SOX2、LIN28、L-MYC和KLF4,畸胎瘤实验可分化为三胚层细胞。获得的IPCs表达胰岛β细胞特异性基因PDX-1、INSULIN和NKX6.1,在葡萄糖刺激下分泌C肽。移植后,糖尿病小鼠血糖降低,体质量恢复,控糖能力增强。结论 T1DM患者血液细胞的iPSCs可诱导分化为IPCs,移植至1型糖尿病小鼠体内具有治疗作用。     

神经前体细胞不是胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的必经途径

探讨胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的途径,对胰腺组织工程的临床运用有重要意义。将胚胎干细胞在有小鼠胚胎成纤维细胞饲养层和白血病抑制因子的条件下培养扩增后,再将扩增后的胚胎干细胞不经过神经前体细胞阶段直接诱导为胰岛素分泌细胞,并与传统的多阶段诱导(经过神经前体细胞阶段)进行比较。结果发现,胚胎干细胞脱离饲养层细胞后,经过9~10d的分化诱导,可以分化为具有胰岛β-细胞特征的胰岛素分泌细胞。与传统的多阶段诱导方法相比,诱导过程简化,诱导时间缩短,所得到的胰岛素分泌细胞数量无明显差异。说明胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化存在多条途径。神经前体细胞阶段不是胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的必须途径。用传统的多阶段分化诱导法和直接诱导法都可以将胚胎干细胞诱导成胰岛素分泌细胞。     

胚胎干细胞向胰岛细胞诱导分化的研究

胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)因具有全能分化潜能而有望成为组织工程和细胞治疗中的重要种子细胞来源。如能将其诱导分化为能分泌胰岛素的细胞，将有助于解决胰岛素绝对或相对缺乏引起的糖尿病代谢失调状态。目前已有研究诱导分化出能分泌胰岛素的细胞，有的将之应用于糖尿病鼠模型并取得了可喜的效果。本对这一领域的研究现状进行综述。     

小鼠iPSCs诱导分化为胰岛素分泌细胞及治疗糖尿病的实验研究

 目的: 利用3步法诱导方案,使小鼠诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)分化为胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells,IPCs),观察诱导效率和成熟度,并观察其对糖尿病小鼠治疗效果。方法: 本实验室通过piggyBac转座子将C57/C雄性小鼠来源胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)构建为小鼠iPSCs,利用3步法诱导方案分化为IPCs,观察细胞分化过程中的形态变化;RT-PCR和免疫荧光检测其胰岛β细胞发育相关基因和蛋白的表达;流式细胞术分析分化效率;葡萄糖刺激实验检测胰岛素和C肽分泌水平。将IPCs移植入C57/C雄性糖尿病小鼠模型左肾包膜下,监测血糖和血清中胰岛素含量28 d,观察逆转高糖血症的效果。结果: 建立的3步诱导方案可以将小鼠iPSCs诱导分化为IPCs,其表达胰岛β细胞的标志性基因(Pdx1、Ngn3、Pax6和Ins2)和蛋白(Pdx1、Nkx6.1和胰岛素),在葡萄糖刺激下可分泌胰岛素和C肽。流式细胞术结果表明诱导分化的效率达28%。移植后3 d糖尿病小鼠血糖即降低至接近正常水平,血清胰岛素含量明显升高,对葡萄糖的调控能力明显增强。病理学观察IPCs细胞移植28 d后仍存活。结论: 建立的3步诱导法可将iPSCs高效定向诱导分化为IPCs,明显缩短了诱导分化的时间,移植至近交系同性别小鼠体内可逆转糖尿病的高糖血症。     

比较体外不同条件诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的:比较体外不同分化条件下胚胎干细胞(ESC)分化为心肌细胞的分化比率。方法:用布法罗大鼠肝细胞(BRL)条件培养基抑制ESC分化及保持其增殖,以维甲酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)、转化生长因子β₁(TGF-β₁)及激活素-A(activin-A)为分化诱导剂,组合成6种分化培养基,采用悬滴悬浮、贴壁三步法诱导ESC分化为心肌细胞,比较各组分化比率。结果:6种分化条件均能使ESC分化为心肌细胞,其中以TGF-β₁(2 μg/L)、activin-A(20 μg/L)及20%胎牛血清(FCS)组成的分化培养基可以使高达92.80%±2.22%的ESC分化为心肌细胞,分化比率显著高于其它各组(P＜0.01)。结论:以BRL条件培养基培养,TGF-β₁、activin-A作分化诱导剂可作为一种理想的ESC体外分化体系。     

含人AGM区基质细胞培养体系定向诱导胚胎干细胞为造血干细胞的实验研究

目的： 体外模拟胚胎早期AGM区造血微环境，诱导胚胎干细胞（ESCs）分化为造血干细胞（HSCs）。方法：将小鼠E14 ESCs在含BMP-4及VEGF的半固体培养基中诱导为拟胚体（EB），分别于3、6、9、12、15 d时收获EB，流式细胞术检测Flk-1+细胞含量。取Flk-1+ 细胞处于高峰期的EB细胞，在人AGM区基质细胞饲养层上进一步诱导分化，并设无饲养层对照，分别于3、6、9、12 d时收获细胞计数、流式细胞术检测Sca-1+c-kit+ 细胞含量，并分析造血细胞集落形成能力。结果：诱导E14细胞形成EB过程中添加BMP4+VEGF的因子组Flk-1+细胞在第9 d达峰值（27.53%± 2.84％），与未添加因子组（8.77%± 1.12％）比较差异显著(P<0.05)。将培养9 d的EB细胞在hAGMS3、hAGMS4饲养层上进一步诱导分化，第6 d时Sca-1+c-kit+细胞达峰值，分别为7.31%±1.21％、7.62%±1.52％，其绝对数分别扩增(2.57±0.48)倍、(2.35±0.36)倍，与无饲养层组比较显著差异（P<0.05）。该分化阶段的Sca-1+c-kit+细胞具有形成各系造血细胞集落的能力。结论：人胚早期AGM区基质细胞能促进小鼠ESCs定向分化为HSCs，为研究ESCs分化为HSCs的分子机制提供了实验模型。     

人孤雌胚胎干细胞与正常胚胎干细胞分化能力的比较

目的 比较人类孤雌胚胎干细胞(pESCs)系与正常胚胎干细胞(nESCs)系的分化能力,探讨pESCs是否和nESCs一样具有多向分化潜能.方法 将pESCs和nESCs分别注射到重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内形成畸胎瘤,瘤体组织切片和HE染色后进行组织学分析;将pESCs和nESCs体外悬浮培养形成拟胚体(EB),利用RT-PCR检测3个胚层主要器官以及滋养层细胞发育关键基因的表达;将pESCs和nESCs定向诱导分化为滋养层细胞,通过流式细胞仪测定人绒毛膜促性腺激素-β(hCG-β)阳性细胞比例以及通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行hCG-β的定量分析.结果 在体内生长和体外培养过程中,pESCs和nESCs均能够向3个胚层的细胞类型分化.在SCID小鼠体内可形成畸胎瘤,有神经上皮、软骨、腺上皮等3个胚层的衍生物产生;pESCs和nESCs来源的EB在体外自发分化5~21d后,均检测到3个胚层主要器官以及滋养层细胞发育关键基因的表达;pESCs定向分化为滋养细胞后,可以检测到hCG-β的表达,但其阳性细胞比例和分泌量均低于nESCs.结论 pESCs具有向3个胚层以及滋养层细胞分化的能力,但是向滋养层细胞分化的能力仍低于nESCs.     

丁酸钠、激活素A和地塞米松诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰腺外分泌细胞

目的： 探讨丁酸钠、激活素A （activin A）和地塞米松诱导小鼠胚胎干细胞（ES细胞）分化为胰腺外分泌细胞的可行性,并对诱导作用进行比较。方法： 小鼠 ES细胞悬浮培养为拟胚体后,以不同浓度的丁酸钠（1 mmol/L,2 mmol/L,3 mmol/L）诱导分化,通过RT-PCR检测不同时点胰腺特异性外分泌基因的表达水平,确定丁酸钠诱导ES细胞向胰腺外分泌细胞分化的最佳浓度和作用时间。进一步单独或联合应用丁酸钠、activin A、地塞米松诱导ES细胞分化,并通过细胞形态学变化、RT-PCR和免疫荧光检测观察不同诱导方案对胰腺外分泌基因和蛋白表达的影响,确定最佳诱导方案。结果：1 mmol/L丁酸钠能明显促进胰腺外分泌基因amylase、chymotrypsinogen、elastase1、elastase2和carboxypeptidase的表达,随着丁酸钠浓度的增加,丁酸钠的诱导作用逐渐减弱;1 mmol/L丁酸钠诱导第3 d后可检测到amylase、chymotrypsinogen、elastase1、elastase2和carboxypeptidase的表达,在第5 d外分泌基因mRNA表达水平达到高峰,随后逐渐下降。与自发对照组相比,单独应用丁酸钠、activin A、地塞米松诱导ES细胞分化,均能提高amylase、chymotrypsinogen、elastase1、elastase2和carboxypeptidase的表达水平。但联合应用丁酸钠、activin A、地塞米松诱导后,ES细胞形态更为均一,上述胰腺外分泌基因的表达进一步增强;免疫荧光结果显示amylase表达为阳性。结论： 低浓度的丁酸钠、activin A以及地塞米松均可以诱导小鼠ES细胞胰腺外分泌基因的表达,多种诱导因子的联合作用能明显提高胰腺外分泌细胞的诱导效率。     

曲古抑菌素A促进小鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞

 目的： 观察曲古抑菌素A(TSA)诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的适宜浓度。方法: C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞系体外培养。实验分为5组：对照组（DMSO,A组)和TSA干预组（25 nmol/L,B组;50 nmol/L,C组;100 nmol/L,D组;200 nmol/L,E组）。各组分两阶段用相应的培养基培养10 d后进行检测。双硫腙染色鉴定各组的胰岛素分泌细胞,结果进行半定量分析。免疫荧光染色鉴定各组的胰岛素分泌,比较各组胰岛素平均荧光强度。酶联免疫吸附试验检测各组胰岛素分泌细胞胰岛素的分泌量。结果: TSA作用10 d能够诱导C57BL/6 小鼠骨髓间充质干细胞分化成为胰岛素分泌细胞并分泌胰岛素。 B组胰岛素染色阳性面积、阳性率、胰岛素染色积分吸光度以及胰岛素平均荧光强度显著高于其它干预组,差异有统计学意义（均P<0.05）。 随着各干预组TSA浓度的升高,胰岛素的分泌量减少。B组胰岛素含量显著高于其它干预组,差异有统计学意义（均P<0.05）。结论：TSA处理10 d能诱导C57BL/6 小鼠骨髓间充质干细胞分化成为胰岛素分泌细胞,并且25 nmol/L为TSA的适宜浓度。     

体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的初步研究

目的：5-氮胞苷作为分化诱导剂，初步探讨其单独或联合全反式维甲酸应用时对小鼠胚胎干细胞（mESC）分化为心肌细胞的影响，旨在建立一种体外诱导mESC分化为心肌细胞的实验方法。方法： 采用 MTT法确定5-氮胞苷的非细胞毒性参考剂量。设计不同条件培养基（5-氮胞苷单独或配伍全反式维甲酸应用）对mESC 进行诱导分化，并通过免疫组化技术及RT-PCR方法等对分化细胞进行鉴定。结果： 5-氮胞苷的非细胞毒性参考剂量为8 μmol/L，能够诱导mESC分化为心肌合胞体（与阴性对照组比较，P<0.01），诱导分化率可达50%。配伍全反式维甲酸持续诱导的结果等同于单独应用全反式维甲酸的作用效果（P>0.05）：即对ESC向心肌细胞的诱导分化没有促进作用。结论：5-氮胞苷能够诱导mESC分化为心肌合胞体，从而得以建立一种体外诱导mESC分化为心肌细胞的方法。     

胚胎干细胞定向分化为垂体样细胞的研究

目的探讨胚胎干细胞定向分化为垂体细胞的潜能。方法129小鼠E14胚胎干细胞与人羊膜共培养4d,定向诱导其分化为上皮样干细胞克隆,取成年129小鼠新鲜垂体,用生长有上皮样干细胞克隆的人羊膜将其包裹,无菌手术下移植入129小鼠双侧背部皮下,术后4周取材,对移植后细胞的分化情况进行形态学观察。结果129小鼠E14胚胎干细胞与人羊膜共培养4d后,在人羊膜上皮面形成上皮样干细胞集落,表达高水平的β1整合素、CK15和CK19,移植物在小鼠皮下生长4周后体积明显增大,苏木精-伊红染色表明,人羊膜表面有垂体样细胞形成。结论胚胎干细胞在适当的条件下有分化为垂体样细胞的潜能。     

胚胎干细胞直接向神经细胞诱导分化的实验研究

目的:探讨不经拟胚体(EB)培养阶段，应用维甲酸(RA)在体外直接将胚胎干细胞(ESC)诱导分化为神经细胞的可行性和效果。 方法:ESC消化后分为A、B、C、D 4组，A、B组进行EB培养后，A组用RA进行诱导分化，B组不添加RA使其自由分化,C、D组不经EB培养阶段，C组直接用RA诱导分化，D组自由分化。倒置相差显微镜及扫描电镜观察细胞形态变化，免疫细胞化学及流式细胞术观察各组第 9 d 分化细胞微管相关蛋白-2(MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。 结果:A、C组诱导分化的神经样细胞逐渐增多，并形成密集的神经网络样结构，9 d 时大部分为MAP-2阳性细胞，MAP-2阳性率显著高于B、D组(P<0.01)。B、D组以圆形上皮样分化细胞为主，9 d 时绝大部分为GFAP阳性细胞，GFAP阳性率显著高于A、C组(P<0.01)。A、C组之间或B、D组之间的MAP-2及GFAP阳性率均无显著差异(P>0.05)。 结论:在体外，可不经EB阶段，应用RA直接将ESC诱导分化为神经细胞，改良的ESC诱导分化方法与传统的RA4-/4+方法效果相同，可取代传统方法。     

丁酸钠体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为肝细胞

目的:探讨分化刺激剂丁酸钠对体外培养的小鼠胚胎干细胞（ES细胞）分化为肝细胞的影响，并分析其可能机制。 方法:常规培养E14 ES细胞后，继续悬浮培养4 d以形成拟胚体，然后转移拟胚体到铺有明胶的6孔板中并添加3 mmol/L丁酸钠开始诱导分化，分化过程中用倒置相差显微镜观察细胞形态学的改变；免疫荧光染色观察肝细胞特异性标志白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白18（CK18）的表达；RT-PCR检测肝细胞特异性标志基因ALB、AFP、甲状腺素运载蛋白(TTR)、α1抗胰蛋白酶(AAT)的mRNA表达；流式细胞技术检测ALB阳性细胞比例；糖原PAS染色和吲哚氰绿（ICG）摄取试验检测肝细胞功能。 结果:诱导分化过程中ES细胞逐渐出现肝细胞样改变；诱导分化第7d仅检测到AFP和TTR在mRNA水平的表达，第14 d检测到ALB、AAT在mRNA水平的表达；分化14 d时免疫荧光检测显示ALB、AFP、CK18均为阳性；流式细胞技术检测ALB阳性细胞比例约为48.6%；糖原PAS染色和ICG摄取试验显示分化18d的肝细胞样细胞具有肝细胞功能。 结论:丁酸钠可以高效诱导小鼠ES细胞分化为肝细胞样细胞，并且分化细胞具有肝细胞功能。