LY294002联合SN50对裸鼠胃癌模型肿瘤细胞生长和凋亡的影响

目的探讨磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）抑制剂LY294002与NF—KBP65核转运抑制剂SN50联合应用对裸鼠荷人胃癌模型的影响。方法采用裸鼠皮下胃癌SGC7901细胞注射法建立移植瘤模型,将模型鼠分为对照组、LY294002干预组、SN50干预组、LY294002与SN50联合干预组,每组5只。干预处理10d后观察各组肿瘤大小并计算每组肿瘤抑制率。用免疫组织化学法检测Bcl-2、P53、Bax蛋白表达,并用透射电子显微镜从形态变化上观察各组肿瘤细胞凋亡情况。结果药物干预10d后,联合干预组裸鼠胃癌细胞生长抑制率为（49．2±2．5）％,明显高于LY294002干预组（29．4±1．5）％和SN50干预组（19．7±1．6）％,差异有统计学意义（P〈0．05）。此外,与LY294002干预组和SN50干预组相比,联合干预组Bcl-2表达下调和P53、Bax表达上调更为显著（P〈0．05）,胃癌细胞凋亡程度更为严重。结论LY294002与SN50联合应用可以显著抑制人胃癌SGC7901细胞裸鼠移植瘤的生长并促进胃癌细胞凋亡。     

牛膝活性成分β-蜕皮甾酮通过Akt信号干预地塞米松诱导的骨细胞凋亡

目的探讨牛膝活性成分β-蜕皮甾酮对地塞米松诱导MLO-Y4骨样细胞凋亡的抑制作用及其可能的作用机制。方法 10μmol/L地塞米松(dexamethasone,Dex)作用于MLO-Y4骨样细胞,以PI3K/Akt抑制剂LY294002为对照,β-蜕皮甾酮(β-Ecdysone,β-Ecd)干预,分为6组:①正常组;②10μmol/L Dex模型组;③10μmol/L Dex+10μmol/Lβ-Ecd组;④10μmol/L Dex+10μmol/Lβ-Ecd+50μmol/L LY294002组;⑤10μmol/L Dex+0.1μmol/Lβ-Ecd组;⑥10μmol/L Dex+0.1μmol/Lβ-Ecd+50μmol/L LY294002组。作用48 h后,Annexin V-FITC/PI法检测细胞早期凋亡率,Western-Blot检测Akt1、Phospho-Akt(Thr308)、Connexin43(CX43)、Caspase9、Bad、Phospho-Bad蛋白表达。结果与正常组比较,Dex组细胞凋亡率升高,Caspase9、Bad蛋白表达升高,Akt1、CX43蛋白表达降低;与造模组比较,β-Ecd减弱Caspase9蛋白表达,使Akt1、CX43蛋白表达增强;LY294002使Akt1、CX43蛋白表达明显减弱,而β-Ecd并不能使LY294002降低的Akt1蛋白表达升高。结论 0.1μmol/L、10μmol/Lβ-蜕皮甾酮可能通过Akt信号途径干预地塞米松诱导的骨细胞凋亡。     

糖原合酶激酶3β抑制剂对前列腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的 研究糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)抑制剂抗前列腺癌细胞裸鼠移植瘤生长的效用. 方法 建立前列腺癌PC-3和LNCaP/Bcl-xL细胞株裸鼠移植瘤模型,观测GSK-3β抑制剂氯化锂(LiCl)及SB216763腹腔内给药后移植瘤重量及体积的变化.同时通过BrdU掺入的免疫组化染色探讨移植瘤的增殖状态,TUNEL染色比较对移植瘤细胞凋亡的影响. 结果 LiCl及SB216763均可明显抑制移植瘤生长(P＜0.05).与对照组相比,LiCl给药组细胞BrdU标记明显降低(P＜0.05),TUNEL染色差异无统计学意义. 结论 抑制GSK-3β活性可抑制前列腺癌裸鼠移植瘤细胞在体内的生长,其中LiCl可能通过干扰癌细胞DNA复制发挥作用.     

靶向糖原合成酶激酶-3β抗骨肉瘤的实验研究

 目的 研究糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)在骨肉瘤细胞增殖中的作用及相关分子机制,探讨其在骨肉瘤靶向治疗中的价值。方法 Western blot检测人成骨细胞及骨肉瘤细胞p-GSK-3β(Ser9)表达水平,观察GSK-3β抑制剂及siRNA干扰对细胞增殖、凋亡的影响,利用凋亡蛋白芯片筛查并验证GSK-3β调控骨肉瘤细胞的分子机制,通过裸鼠体内实验评估靶向GSK-3β对于骨肉瘤的治疗价值。结果 在骨肉瘤细胞中p-GSK-3β(Ser9)表达水平明显低于成骨细胞。GSK-3β特异性抑制剂及siRNA干扰均可明显抑制骨肉瘤细胞增殖并诱导凋亡蛋白cleave-caspase 3表达量明显上调。通过蛋白芯片筛查显示一组NF-κB调控的靶基因蛋白survivin、cIAP-1、XIAP及Bcl-2明显下调。Western blot验证了上述芯片结果,并发现氯化锂处理后p-IκBα水平下降,核内NF-κB p65表达量下降。NF-κB双荧光素酶报告系统检测稳定过表达持续活化GSK-3β细胞中NF-κB转录活性与空载体组细胞相比明显升高,而稳定干扰GSK-3β的细胞中NF-κB转录活性与空载体组细胞相比明显下降。裸鼠体内动物实验发现稳定干扰GSK-3β和采用氯化锂均可明显抑制骨肉瘤皮下移植瘤的生长。结论 GSK-3β在骨肉瘤中处于相对活化状态,可通过上调NF-κB转录活性调控骨肉瘤细胞增殖;靶向GSK-3β是骨肉瘤潜在的治疗新策略。     

LY294002对胆管癌细胞凋亡的影响

目的：观察PI3-Kinase抑制剂LY294002对人胆管癌细胞QBC939的作用。
方法：MTT法检测LY294002对QBC939细胞的生长抑制作用;流式细胞术检测LY294002诱导的细胞凋亡;免疫印迹法分析LY294002对于PI3-K/Akt信号通路中Akt磷酸化及caspase9的表达作用。
结果：LY294002可抑制胆管癌细胞QBC939的增殖,促进其凋亡。Western-blotting显示,LY2940022可抑制Akt磷酸化水平,促进caspase3,9的蛋白表达。
结论：LY294002可通过抑制Akt信号通路的活性,上调促凋亡分子caspase3,9的表达,抑制胆管癌细胞QBC939的增殖,诱导其凋亡。

     

牛磺酸减轻碘海醇诱导的人肾小管上皮细胞损伤

目的 探讨牛磺酸能否减轻碘海醇导致的HK-2细胞（人近端肾小管上皮细胞）损伤及作用机制。 方法 不同碘浓度（25、50、100、125 gI/L）的碘海醇作用HK-2细胞6 h;碘浓度为100 gI/L的碘海醇作用HK-2细胞不同时间（2 h、4 h、6 h）,观察细胞损伤程度。选用碘海醇（100 gI/L、6 h）作为刺激组,用不同浓度牛磺酸（3、12、24 mmol/L）共孵育进行干预。细胞增殖-毒性试剂盒（CCK-8）测定细胞活力。Hoechst33342染色、荧光显微镜下观察细胞凋亡形态。流式AnnexinⅤ-FITC-PI双染和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-3）活性比色法观察细胞凋亡。Western印迹检测Bcl-2、Bax的表达。流式DCFH-DA细胞内标记法测定细胞内活性氧（ROS）。 结果 碘海醇呈碘浓度和时间依赖性诱导HK-2细胞活力下降、凋亡增加（P ＜ 0.05）。碘海醇（100 gI/L、6 h）导致HK-2细胞ROS升高（P ＜ 0.05）。牛磺酸呈浓度依赖性增加HK-2细胞活力,减轻凋亡。牛磺酸（3、12、24 mmol/L）干预组与碘海醇刺激组比较,细胞活力分别为（88.0±1.00）%、（91.33±0.58）%、（95.67±1.52）%比（76.67±1.53）%（均P ＜ 0.05）;细胞凋亡率分别为（8.84±1.75）%、（7.86±1.82）%、（6.30±1.50）%比（11.98±0.39）%（均P ＜ 0.05）;caspase-3的活性分别为（1.33±0.10）、（1.27±0.0）、（1.10±0.04）比（1.42±0.1）（均P ＜ 0.05）。牛磺酸上调HK-2细胞Bcl-2表达,降低了细胞内ROS的升高（均P ＜ 0.05）。 结论 碘海醇可致HK-2细胞凋亡增加。氧化应激参与了HK-2细胞损伤。牛磺酸通过减轻细胞内氧化应激、促进Bcl-2表达上调,减轻碘海醇诱导的HK-2细胞凋亡和损伤。     

磷脂酰肌醇-3-激酶参与过度机械通气诱导的核因子-κB激活

目的通过观察磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）抑制剂（ly294002）对不同潮气量机械通气中NF-κB活性的影响,探讨机械通气肺损伤发生机制.方法40只SD大鼠随机分为对照组（A组）、正常通气组（B组）、过度通气组（C组）、正常通气＋ly294002组（D组）、过度通气＋ly294002（E组）,每组8只.分别采用Western blot测定磷酸化蛋白激酶B（Akt）的活性、免疫组化观察I-κB β、NF-κB在肺细胞中的分布及表达;电泳迁移率测定NF-κB的DNA结合活性.结果C组大鼠肺组织中Akt的磷酸化水平较其他各组增加（P＜0.05）,NF-κB的DNA结合活性较A、D、E组显著提高（P＜0.01）,肺组织中I-κB β表达显著降低,NF-κB表达增加,且主要表达于肺内巨噬细胞和肺上皮细胞.ly294002可明显抑制Akt磷酸化,降低NF-κB的活性及在肺组织中的表达.结论PI3K参与了过度机械通气导致的NF-κB激活.     

Ghrelin提高L6大鼠成肌细胞胰岛素敏感性及其机理

目的 研究Ghrelin对L6大鼠成肌细胞在棕榈酸诱导下的葡萄糖代谢和胰岛素敏感性的影响,并探讨其可能的机理。方法 培养L6大鼠成肌细胞,诱导分化后利用0.3 mmol/L的棕榈酸作用16 h,实验组加入不同剂量的Ghrelin （1、10和100 nmol/L）作用8 h,采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法（GOD-POD）检测骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取,并在荧光共聚焦显微镜下观察细胞膜葡萄糖转运因子-4 （GLUT-4）蛋白染色;采用免疫印迹（Western blot） 法检测骨骼肌细胞中总蛋白激酶B （Akt）、磷酸化蛋白激酶B （pAkt）、总糖原合成酶激酶-3β （GSK-3β）和磷酸化糖原合成酶激酶-3β （pGSK-3β）蛋白的表达。结果 Ghrelin使胰岛素抵抗之L6大鼠成肌细胞葡萄糖摄取量增加,细胞膜GLUT-4染色加深,pAkt及pGSK-3β蛋白表达增加（磷酸化表达增加）,而总Akt和总GSK-3β蛋白无明显变化,这种作用可被PI3K阻断剂（LY294002）消除。结论 Ghrelin通过磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3β （PI3K/Akt/GSK-3β）信号途径促进L6大鼠成肌细胞葡萄糖摄取量,从而提高L6大鼠成肌细胞胰岛素的敏感性。     

姜黄素与LY294002联合应用对前列腺癌PC-3细胞体外生长的影响

【摘要】 目的〓探讨姜黄素与PI3K/Akt抑制剂LY294002联合应用对前列腺癌PC-3细胞体外生长的影响。方法〓根据给药不同将实验分为对照组、姜黄素组、LY294002组和姜黄素组+LY294002联合组,分别加入等量的培养基、25 μmoL/L姜黄素、25 μmoL/L的LY294002和两种混合液。采用MTS法检测各组细胞的增殖情况、流式细胞仪术检测各组细胞凋亡情况、q-PCR测定各组细胞中NF-κB、P53及caspase-9的表达情况。结果〓姜黄素组、LY组和联合组的细胞增值率均较对照组明显降低,且联合组明显低于两个单独用药组(P<0.05)。姜黄素与LY294002联合作用前列腺癌PC-3细胞后,细胞总凋亡率较姜黄素及LY294002单独使用后明显增加(P值均<0.05)。联合用药组的NF-κB表达量明显低于两单独用药组(P<0.05),而P53和caspase-9的表达量均明显高于两单独用药组(P<0.05)。结论〓姜黄素与LY294002联合使用较两种药物单独使用更能有效抑制前列腺癌PC-3细胞的体外生长,作用机制可能是通过抑制NF-κB的表达从而抑制细胞增殖,并增加P53和caspase-9的表达从而促进细胞凋亡来实现的。     

nephrin通过PI3K-Akt途径抑制血管紧张素Ⅱ诱导的足细胞凋亡

目的 研究nephrin在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导足细胞凋亡中的作用,以及可能的分子机制。 方法 体外培养永生化小鼠足细胞（MPC）,以不同浓度AngⅡ处理MPC和10-8 mol/L AngⅡ刺激不同时间,用流式细胞仪检测细胞凋亡率;实时定量PCR、免疫荧光和Western印迹法检测nephrin的表达和分布;Western印迹法检测Akt磷酸化水平。脂质体法转染pcDNA3.1-mNPHS1质粒,G418筛选稳定转染细胞系。用Akt抑制剂LY294002或与AngⅡ共孵育刺激MPC和pcDNA3.1-mNPHS1转染细胞,检测Akt磷酸化水平和细胞凋亡率。 结果 （1）AngⅡ以剂量和时间依赖方式诱导MPC凋亡。AngⅡ受体拮抗药氯沙坦与AngⅡ共孵育18 h,显著降低AngⅡ单独刺激的足细胞凋亡率（P < 0.05）。（2）10-8 mol/L AngⅡ刺激12 h后,nephrin mRNA和蛋白较对照组显著降低,24 h nephrin mRNA约为正常对照的50%（P < 0.05）。正常足细胞nephrin主要分布于核膜周围的胞质和细胞膜,随刺激时间延长,胞膜和胞质nephrin表达逐渐降低。（3）10-8 mol/L AngⅡ刺激15 min后,Akt磷酸化显著降低,约为正常对照细胞的50%（P < 0.01）。（4）AngⅡ与LY294002共孵育12 h后,细胞凋亡率显著高于AngⅡ和LY294002单独刺激（均P < 0.05）。（5）pcDNA3.1-mNPHS1稳定转染显著上调足细胞Akt磷酸化水平（P < 0.05）,抑制 AngⅡ诱导的细胞凋亡（P < 0.05）。 结论 AngⅡ通过AngⅡ受体诱导小鼠足细胞凋亡,抑制足细胞nephrin表达。nephrin通过PI3K-Akt信号通路调节足细胞存活状态。     

PI3K/Akt信号转导通路在二氮嗪预处理减轻大鼠海马神经元缺氧复氧损伤中的作用

目的 探讨PDK/Akt信号转导通路在二氮嗪预处理减轻大鼠海马缺氧复氧损伤中的作用.方法 新生SD大鼠,出生时间<24 h,体重5-6 g,断头取海马组织,胰蛋白酶消化后,将神经元接种于96孔板或直径35 mm培养皿中,培养12 d后,随机分为6组:对照组(C组)、缺氧复氧组(HR组)、二氮嗪100μmol/L预处理组(Dz组)、二氮嗪100 μmol/L预处理+5-羟癸酸100μmol/L预处理组(DZ+HD组)、5-羟癸酸100 μmol/L预处理组(HD组)和二氮嗪100 μmol/L预处理+LY294002 50μmol/L预处理组(Dz+LY组),每组48孔或12皿.C组不给予任何处理,其余5组每天给予相应药物预处理l h,连续3 d,然后缺氧4 h,复氧24 h,测定神经元活力、凋亡率、Akt、Bcl-2和Bax的表达水平.结果 与C组比较,其余各组海马神经元活力降低.凋亡率升高,Akt和Bcl-2和Bax表达上调(P<0.01);与HR组比较.DZ组海马神经元活力升高.凋亡率降低,Altt和Bel-2表达上调,Bax表达下调(P<0.01);与Dz组比较,DZ+HD组、HD组和Dz+LY组海马神经元活力降低,凋亡率升高.Akt和Bel-2表达下调,Bax表达上调(P<0.01).结论 二氮嗪预处理可能通过激活PDK/Akt信号转导通路,上调Bel-2表达,下调Bax表达,抑制神经元凋亡,从而减轻大鼠海马缺氧复氧损伤.     

萝卜硫素改善LPS诱导肾小管上皮细胞损伤的作用机制研究

目的:探讨萝卜硫素对脓毒症肾损伤的影响和可能机制。方法:体外培养肾小管上皮细胞HK-2，用不同剂量(5、10、20μmol/L)萝卜硫素孵育24 h后，再用LPS干预8 h。酶联免疫吸附法检测IL-6、IL-1β和TNF-α表达，流式细胞术检测凋亡，蛋白质印迹法检测cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达，qRT-PCR检测miR-22-3p表达。转染miR-22-3p模拟物或抑制剂至HK-2细胞后，用LPS干预8 h或用20μmol/L萝卜硫素孵育24 h后再用LPS干预8 h，上述相同方法检测IL-6、IL-1β和TNF-α表达、细胞凋亡及cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达。结果:与LPS组比较，萝卜硫素降低LPS诱导的HK-2细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平、细胞凋亡率及cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达，增加miR-22-3p表达。上调miR-22-3p降低LPS诱导的HK-2细胞IL-6、IL-1β和TNF-α水平、细胞凋亡率及cleaved-caspa...     

奥曲肽诱导人结肠癌细胞凋亡与细胞周期的影响及机制

目的:探讨奥曲肽诱导人结肠癌细胞凋亡与细胞周期的影响及机制。方法:奥曲肽、GSK-3β抑制剂Li Cl单独或联合作用于人结肠癌SW480细胞后,用流式细胞术检测SW480细胞的凋亡与细胞周期,以及用DNA凝胶电泳实验进一步验证细胞凋亡;Western blot检测SW480细胞中GSK-3β、p-GSK3-β(Tyr216)及p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达。结果:与未处理的空白对照组SW480比较,奥曲肽处理SW480细胞后,细胞凋亡率与G0/G1细胞明显升高,凝胶电泳出现典型的"梯形"DNA条带,总GSK-3β蛋白与p-GSK3β(Tyr216)表达明显上调,而p-GSK3β(Ser9)蛋白表达明显下降(均P<0.05);Li Cl单独作用对SW480细胞的凋亡与细胞周期无明显影响(均P>0.05),但与奥曲肽联合作用能明显削弱奥曲肽对SW480的促凋亡与细胞周期阻滞作用(均P<0.05)。结论:奥曲肽能有效诱导SW480细胞凋亡与细胞周期阻滞,该作用可能与其上调GSK-3β蛋白的表达,并调节GSK-3β蛋白的磷酸化水平有关。     

PI3K/Akt 信号通路在舒芬太尼后处理减轻在体大鼠心肌缺血-再灌注损伤中的作用

目的探讨PI3K/Akt信号通路在舒芬太尼后处理减轻在体大鼠心肌缺血-再灌注损伤时细胞凋亡中的作用。方法取90只健康成年雄性SD大鼠,采用随机数字表法分为五组:假手术组(Sham组),只穿线不结扎;缺血-再灌注组(IR组),结扎左冠状动脉前降支造成心肌缺血30min,再灌注120 min;舒芬太尼后处理组(Sufen组),在灌注即刻,给予舒芬太尼1.0μg/kg输注3min,再灌注处理同IR组;舒芬太尼后处理~+LY294002(PI3K抑制剂)组(SL组),再灌注前10min给予LY294002 0.3mg/kg,并行舒芬太尼后处理;LY294002组(IL组),再灌注前10 min给予LY294002 0.3mg/kg,再灌注120min。在缺血前即刻(T_0)、缺血30min(T_1)、再灌注60min(T_2)和再灌注120min(T_3)时记录HR和MAP;再灌注末,测定心肌梗死面积(IS/AAR);再灌注15 min时,采用Western blot法测定心肌组织总的Akt和磷酸化的Akt蛋白含量;在再灌注末,用RT_-PCR检测Bax和Bcl-2mRNA的表达。结果五组大鼠组间组内HR差异无统计学意义;T_2、T_3时IR组、SL组和IL组MAP明显低于Sham组(P0.05);Sufen组IS/AAR明显低于IR、SL和IL组(P0.05);五组心肌总的Akt蛋白含量表达差异无统计学意义;与Sufen组比较,sham、IR、SL和IL组磷酸化的Akt表达明显下调(P0.05),IR组、SL和IL组Bax mRNA的表达明显升高,Bcl-2mRAN的表达明显降低(P0.05)。结论舒芬太尼后处理可减轻心肌缺血-再灌注损伤,可能与激活PI3K/Akt信号通路,降低Bax和增加Bcl-2蛋白表达而达到抑制心肌细胞的凋亡有关。     

紫草素调控PI3K/Akt/mTOR通路对人胃癌MGC803细胞自噬和凋亡的影响

目的：研究紫草素对人胃癌MGC803细胞自噬和凋亡的影响及作用机制。方法 ：取对数生长期MGC803细胞,设空白对照组、紫草素组、紫草素+IGF-1(PI3K激活剂)组、紫草素+LY294002(PI3K抑制剂)组。药物干预24 h后,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡,GFP-LC3质粒转染法观察细胞自噬小体,Western blot法检测磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR、Caspase-3、cleaved Caspase-3、LC3、Beclin-1的表达。结果：与空白对照组比较,紫草素组细胞增殖抑制率、凋亡率升高（P<0.05）,自噬小体数量明显增多,PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平降低（P<0.05）,cleaved Caspase-3/Caspase-3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1表达量升高（P<0.05）。IGF-1可明显逆转紫草素对MGC803细胞增殖抑制、凋亡、自噬,PI3K、Akt、mTOR磷酸化和cleaved Cas...     

Akt/GSK-3β信号转导通路在小鼠神经病理性痛中的作用

目的 探讨丝氨酸-苏氨酸激酶(Akt)/糖原合成酶激酶-3β (Akt/GSK-3β)信号转导通路在小鼠神经病理性痛中的作用.方法 雄性C57BL/6小鼠36只,体重20～25 g,7～8周龄,采用随机数字表法,将其随机分为2组:假手术组(S组,n=9)和神经病理性痛组(CCI组,n=27).CCI组采用坐骨神经慢性结扎损伤的方法制备神经病理性痛模型,S组行假手术.2组取6只小鼠,分别于CCI前1d、CCI后1、3、5、7、10、14、17、21 d时测定机械缩足阈值(PWMT)和热缩足潜伏期(PWTL).S组于造模后3d,CCI组于CCI后1、3、5、7、10、14、21 d时处死3只小鼠,取L3～5段脊髓,采用Western blot法检测Akt、磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)的表达.结果 与S组比较,CCI组CCI后1～21 dPWMT降低,PWTL缩短,CCI后7～21 d时脊髓Akt表达上调,CCI后1～21 d时脊髓p-Akt和p-GSK-3β表达上调(P＜0.05).结论 Akt/GSK-3β信号转导通路参与了小鼠神经病理性痛的形成和维持.     

PI3K/Akt信号通路在异丙酚后处理减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用

目的 评价磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路在异丙酚后处理减轻大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用.方法 体外培养SD乳鼠心肌细胞,接种于96孔板(细胞密度1×105/ml,200 μl/孔)或6孔板(细胞密度5×105/ml,2 ml/孔)中,采用随机数字表法,将细胞随机分为4组(n=24):常规培养组(C组)细胞常规培养6h;缺氧复氧组(H/R组)细胞行缺氧2h,复氧4h;缺氧复氧+异丙酚组(H/R+P组)于缺氧结束时行异丙酚(终浓度50 μmol/L)后处理;H/R+异丙酚+ PI3K抑制剂组(H/R+ P+W组)于缺氧结束时加入PI3K抑制剂渥曼青霉素(终浓度100nmol/L)和异丙酚(终浓度为50μmol/L).复氧结束时,采用MTT法测定细胞活力,应用生化自动分析仪测定培养液LDH活性;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Western blot法检测心肌细胞磷酸化Akt(p-Akt)、Bcl-2及Bax表达水平.结果 与C组相比,H/R组细胞活力降低,LDH活性和细胞凋亡率升高,p-Akt和Bax表达上调,Bcl-2表达下调,Bcl-2/Bax降低(P＜0.05).与H/R组比较,H/R+P组细胞活力升高,LDH活性和细胞凋亡率降低,p-Akt和Bcl-2表达上调,Bax表达下调,Bcl-2/Bax升高(P＜0.05).与H/R+P组比较,H/R+ P+W组细胞活力降低,LDH活性和细胞凋亡率升高,p-Akt和Bcl-2表达下调,Bcl-2/Bax降低(P＜0.05).结论 异丙酚后处理减轻心肌细胞缺氧复氧损伤的机制与激活PI3K/Akt信号通路有关.     

异丙酚对肝缺血再灌注大鼠心肌损伤的影响及PI3K/Akt信号通路在其中的作用

目的 探讨异丙酚对肝缺血再灌注大鼠心肌损伤的影响及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/Akt)信号通路在其中的作用.方法 清洁级雄性SD大鼠102只,体重250～280g,采用结扎肝蒂30 min后再灌注的方法制备肝缺血再灌注模型.随机分为5组:假手术组(S组,n=6)仅分离肝门,不结扎;缺血再灌注组(I/R组,n=30)制备肝缺血再灌注模型;异丙酚组(P组,n=30)缺血前10 min股静脉注射异丙酚12 mg/k异的负荷剂量,随后以30 mg·kg-1·h-1的速率静脉输注直至处死;异丙酚+PI3K抑制剂组(P+LY组,n=18)缺血前10 min股静脉注射PI3K特异性抑制剂LY294002 1.5mg/kg(溶于二甲亚砜0.5 ml);溶剂对照组(P+DMSO组,n=18)缺血前10 min股静脉注射二甲亚砜0.5 ml.I/R组和P组于再灌注即刻、30、60、120和240 min(T1-55)时,P+LY组和P+DMSO组于T3-5时取6只大鼠,处死后快速取左心室壁心肌组织,测定总Akt(t-Akt)和磷酸化Akt(p-Akt),并于T3时测定Bcl-2的表达和心肌细胞凋亡情况,取肝左外叶组织,光镜下观察肝组织病理学结果.S组于T1相应时点处死大鼠,测定上述指标.结果 与S组比较,其余各组心肌p-Akt表达水平和心肌细胞凋亡率升高(P＜0.05),P+LY组心肌Bcl-2表达差异无统计学意义(P＞0.05),其他各组心肌Bcl-2表达均上调(P＜0.05);与I/R组比较,P组和P+DMSO组心肌p-Akt和Bcl-2表达上调,心肌细胞凋亡率降低(P＜0.05),P+LY组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05);与P组比较,P+LY组心肌p-Akt和Bcl-2表达下调,心肌细胞凋亡率升高(P＜0.05),P+DMSO组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05);各组心肌t-Akt表达比较差异无统计学意义(P＞0.05).P组和P+DMSO组肝组织病理学损伤较I/R组和P+LY组减轻.结论异丙酚可减轻大鼠肝缺血再灌注诱发心肌损伤,该作用与激活PI3K/Akt信号通路有关.     

糖原合酶激酶3β在轻型/重症急性胰腺炎细胞模型中的表达

目的 探讨糖原合酶激酶3β(GSK3β)在轻型/重症急性胰腺炎发病中的表达及作用方法 采用单独雨蛙素、雨蛙素联合脂多糖刺激分别构建轻型急性胰腺炎(MAP)和重症急性胰腺炎(SAP)的细胞模型,分别在2、4、8、12、24 h收集细胞培养基上清,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测淀粉酶、脂肪酶、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的表达变化,流式细胞术检测细胞凋亡率及坏死率,实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测GSK3β及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、-8、-9 mRNA表达变化.结果 雨蛙素组和雨蛙素+脂多糖组各时间点淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6较对照组均增高,且在大多数时间点,雨蛙素+脂多糖组组比雨蛙素组水平更高,开始上调时间相同或更早(P＜0.05).刺激24 h后,雨蛙素组凋亡率[(19.2±0.9)％]显著高于雨蛙素+脂多糖组[(10.2±0.5)％,P ＜0.05].雨蛙素组坏死率[(5.8±0.3)％]显著低于雨蛙素+脂多糖组[(13.6±0.7)％,P＜0.05].SAP组的坏死/凋亡比值是MAP组的5倍.GSK3β的mRNA水平在雨蛙素组中是2h短暂下调[相对表达量为(0.5±0.1)倍]后于8h显著上升[相对表达量为(3.0±1.1)倍,P ＜0.05],然后又逐步下降;而在雨蛙素+脂多糖组中则是是8h才缓慢上调[相对表达量为(1.8±0.6)倍,P＜0.05],至24 h达到高峰[相对表达量为(3.6±0.3)倍,P＜0.05].GSK3β和Caspase-3 mRNA水平均有升高,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 采用单独雨蛙素、雨蛙素联合脂多糖刺激分别建立MAP和SAP细胞模型可行;GSK3β在MAP和SAP中可能通过促进腺泡细胞凋亡来起作用.     

柚苷对髓核间充质干细胞生物学性能的影响及其相关机制

目的:探讨柚苷对人退变腰椎间盘来源髓核间充质干细胞(human nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cell,h NPMSC)生物学性能的影响及其可能机制。方法:收集腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织,分离培养h NPMSC并进行体外扩增。通过细胞形态学观察、细胞免疫表型检测及三系分化进行间充质干细胞的鉴定。取P3代hNPMSC分为对照组(正常培养基培养)、柚苷组(以含20μg/mL柚苷的培养基培养)和LY294002组(用含20μg/mL柚苷及PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002的培养基培养),培养6d后通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,TUNEL荧光检测TUNEL染色阳性细胞率,Western Blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax及PI3K/Akt信号通路相关蛋白p-Akt、Akt和p53的表达,RT-PCR检测Ⅱ型胶原及蛋白多糖的m RNA表达。结果:来自人退变腰椎间盘髓核的原代细胞贴壁生长,呈不规则多边形,传代后以梭形为主;高表达干细胞相关阳性表面抗原分子CD73、CD90及CD105,低表达CD45及CD34;茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色证实经诱导后可向骨、脂肪及软骨细胞分化,符合间充质干细胞的表型。与对照组比较,柚苷组细胞凋亡率、TUNEL染色阳性细胞率、p53、Caspase-3和Bax蛋白表达显著性下降,p-Akt及抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著性增加(P0.05);LY294002干预后可以逆转这种改变(P0.05)。与对照组比较,柚苷组hNPMSC中Ⅱ型胶原及蛋白多糖的m RNA表达显著性增加;LY294002组中Ⅱ型胶原及蛋白多糖的m RNA表达较柚苷组显著性减少(P0.05)。结论:柚苷可通过激活PI3K/Akt信号通路减少细胞凋亡,促进hNPMSC向髓核细胞分化。