PI3K/Akt信号通路在瑞芬太尼后处理抑制脑缺血再灌注损伤的作用

目的 探讨瑞芬太尼后处理对短暂脑缺血再灌注海马神经元凋亡的影响及其与PI3K/Akt信号通路活化的关系.方法 随机分为5组：假手术组（Sham组）、模型组（Model组）、瑞芬太尼后处理组[R组,0.6 μg/（kg·min）],LY294002＋瑞芬太尼后处理组（LY＋R组）及LY294002组（LY组）.采用夹闭双侧颈总动脉10 min合并低血压法建立全脑缺血/再灌注（I/R）模型.瑞芬太尼后处理于再灌注前5 min泵注瑞芬太尼.LY294002于再灌注前10 min经侧脑室缓慢泵入（0.3 ml/kg）.RT-PCR法测定bcl-2 和 bax基因的表达.Tunel法检测海马CA1区锥体细胞凋亡.结果 瑞芬太尼后处理可以显著抑制大鼠海马CA1区神经元的凋亡和bax基因的表达,并且促进bcl-2基因的表达（P〈0.05）.LY＋R组、LY组与Model组相比,bcl-2和bax基因表达的结果差异无统计学意义（P〉0.05）.结论瑞芬太尼后处理可以减轻脑缺血再灌注对大鼠的脑损伤,其作用机制可能与 PI3K/Akt信号通路的活化有关.     

瑞芬太尼对大鼠全脑缺血再灌注后神经元凋亡和半胱天冬酶-3表达的影响

目的 观察瑞芬太尼对大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马神经细胞凋亡和半胱天冬酶(Caspase)-3表达的影响.方法 80只大鼠随机分为假手术(sham)、NS、REM2、REM6和REM20组,每组16只.NS、REM2、REM6和REM20组分别于缺血再灌注前静脉滴注0.9%氯化钠溶液及瑞芬太尼2、6、20μg·kg~(-1)·min~(-1).采用双侧颈总动脉阻断+低血压法建立大鼠短暂性全脑缺血模型.于全脑缺血前30 min由靶控微量注射泵经股静脉注射瑞芬太尼,并于双侧颈总动脉阻断前及开放后10 min进行动脉血血气分析.再灌注后24 h,每组各取8只大鼠,取其新鲜海马组织,采用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组Caspase-3 mRNA的表达.再灌注后72 h,取剩余大鼠,灌注取脑,制作脑组织切片,采用苏木精伊红(H-E)染色和原位末端标记法(TUNEL法)观察各组大鼠海马退变的神经元数和凋亡细胞数,采用免疫组织化学法检测各组Caspase-3蛋白的表达.结果 ①H-E染色结果:sham组偶可见退变的锥体细胞,缺血再灌注72 h后,NS组及各瑞芬太尼预处理组海马退变的神经元数较sham组显著增加(P值均<0.05),REM6及REM20组海马退变的神经元数较NS组显著减少(P值均<0.05).②TUNEL法检测结果:sham组未见TUNEL阳性细胞,缺血再灌注72 h后,NS组及各瑞芬太尼预处理组海马CAI区的凋亡锥体细胞数较sham组显著增加(P值均<0.05),REM6和REM20组海马CAI区的凋亡锥体细胞数较NS组显著降低(P值均<0.05).③免疫组织化学法检测结果:sham组可见少量Caspase-3免疫阳性细胞,缺血再灌注72 h后,NS组及各瑞芬太尼预处理组海马区Caspase-3蛋白的免疫阳性细胞数较sham组显著增多(P值均<0.05),各瑞芬太尼预处理组Caspase-3蛋白的免疫阳性细胞数显著低于NS组(P值均<0.05),REM6和REM20组Caspase-3蛋白的免疫阳性细胞数显著低于REM2组(P值均<0.05).④实时RT-PCR结果:sham组大鼠海马组织中Caspase-3 mRNA呈低水平表达,缺血再灌注24 h后,NS组及各瑞芬太尼处理组Caspase-3 mRNA的表达水平较sham组显著升高(P值均<0.05),REM6组Caspase-3 mRNA的表达较NS组显著降低(P<0.05).结论 瑞芬太尼预处理(以6 μg·kg~(-1)·min~(-1)为佳)对全脑缺血再灌注后的神经元损伤具有一定的保护作用,其机制可能与抑制神经元凋亡及下调Caspase-3基因有关.     

大鼠全脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡及认知功能的研究

目的探讨大鼠脑缺血再灌注海马神经元凋亡及认知功能变化。方法雄性SD大鼠60只,随机分成假手术组（SH组）、模型组（IR组）。模型组采用4-VO法建立SD大鼠全脑缺血模型,不同时间点进行水迷宫测试。TUNEL法检测海马CA1区凋亡细胞。结果尼氏染色显示,与假手术组间比较,缺血组海马CA1区神经元数量显著下降（P〈0.01）;TUNEL法检测显示：与假手术组相比,凋亡指数显著增加（P〈0.01）。Morris水迷宫检测,与假手术组相比,模型组大鼠学习阶段寻台时间明显延长,而其记忆测试潜伏期也明显长于假手术组。结论大鼠全脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡显著增加,认知功能明显下降。     

氯化血红素对大鼠全脑缺血/再灌注后海马CA1区血红素加氧酶-1表达的影响

目的探讨氯化血红素预处理对大鼠全脑缺血/再灌注后海马CA1区血红素加氧酶-1表达的影响。方法将Wistar大鼠随机分为假手术组、氯化血红素对照组、全脑缺血/再灌注组、氯化血红素预处理+全脑缺血/再灌注组,将四组结果进行比较。采用四血管闭塞法复制大鼠全脑缺血/再灌注模型,夹闭颈总动脉造成全脑缺血8 min后再灌注。硫堇染色法观察大鼠海马组织学改变;免疫组织化学法观察海马锥体神经元血红素加氧酶-1阳性细胞表达变化。结果 Wistar大鼠氯化血红素预处理+全脑缺血/再灌注组海马CA1区存活细胞数较全脑缺血/再灌注组明显增加,其锥体神经元血红素加氧酶-1阳性细胞表达量较全脑缺血/再灌注组显著升高。结论氯化血红素可通过上调海马锥体神经元血红素加氧酶-1的表达,减少全脑缺血再灌注后海马神经细胞的死亡数,发挥神经保护作用。     

全脑缺血再灌注损伤中JNK及Bim蛋白的表达

目的 探讨大鼠全脑缺血再灌注氨基末端激酶或应激活化激酶（p—JNK）及与Bcl-2相互作用的细胞死亡调解子（Bim）蛋白表达的变化。方法 构建大鼠全脑缺血再灌注模型，采用TUNEL法原位检测凋亡锥体细胞，免疫印迹检测不同实验组中Bim及p—JNK蛋白表达。结果 缺血再灌注各组神经元细胞的凋亡率明显高于假手术组（P〈0．05）。缺血再灌注组p—JNK及Bim蛋白表达积分光密度值与假手术组相比差异有显著性（P〈0．05）。结论 在脑缺血及在灌注损伤中存在有JNK途径的过度激活，p-JNK蛋白与Bim蛋白表达为正相关。JNK途径的激活导致Bim蛋白表达增加，进而导致神经元细胞的凋亡明显增加。     

70味珍珠丸对全脑缺血/再灌注大鼠海马CA1区神经元的保护作用

目的研究70味珍珠丸对大鼠全脑缺血/再灌注后海马的保护作用。方法 48只雄性Wistar大鼠采用4血管闭塞法制造大鼠全脑缺血模型,观察不同剂量70味珍珠丸对大鼠全脑缺血/再灌注后海马CA1区神经元形态学的影响,并应用流式细胞仪检测海马神经元凋亡率。结果 70味珍珠丸组与缺血/再灌组相比表现为海马神经元凋亡率下降,海马CA1区锥体细胞组织学分级（histological grade,HG）明显降低,神经元密度（neuronal density,ND）明显升高（P〈0.05）。结论藏药70味珍珠丸可以抑制脑缺血再灌注时海马神经元凋亡,从而对脑缺血/再灌注损伤有明显的对抗作用。     

硝酸甘油对缺血性脑卒中神经元的保护及对JNK信号通路的影响

目的：探讨硝酸甘油（NG）对大鼠缺血性脑卒中JNK和Bad（ser128）磷酸化的影响。方法：36只健康SD（Sprague-Dawley）大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组（对照组）和硝酸甘油组。以大鼠四动脉结扎脑缺血模型为基础,应用焦油紫染色法检测海马CA1区神经元凋亡,采用免疫印迹检测JNK和Bad（ser128）的磷酸化。结果：硝酸甘油组脑海马CA1区神经元凋亡显著少于对照组（P〈0.05）;硝酸甘油组JNK、Bad（ser128）的磷酸化显著低于对照组（P〈0.05）。结论：硝酸甘油能显著减轻脑缺血再灌注后脑海马CA1区神经元凋亡,明显抑制JNK、Bad（ser128）的磷酸化水平,对脑缺血再灌注损伤起保护作用。     

外源性NO供体对脑缺血/再灌注神经元的保护作用

目的观察外源性一氧化氮（NO）供体硝普钠（SNP）和亚硝基谷胱甘肽（GSNO）对脑缺血/再灌注过程中c-jun N末端激酶3（JNK3）磷酸化的影响,及其对再灌注海马CA1区锥体神经元的作用。方法采用四动脉结扎法建立大鼠全脑缺血模型。SNP（5 mg/kg）溶于生理盐水,间隔1.5 h分别腹腔注射3次,第1次注射时间在全脑缺血前30 min。GSNO（100μg/kg）溶于生理盐水,缺血前20 min于侧脑室注射给药。大鼠随机分为假手术组、缺血/再灌注组、缺血/再灌注溶剂对照组、缺血/再灌注给予SNP组和缺血/再灌注给予GSNO组,缺血15 min后分别灌注1天或5天。利用免疫印迹、免疫沉淀和焦油紫染色法检测相关蛋白的表达、磷酸化水平及神经元细胞的存活。结果给予SNP组和GSNO组与生理盐水对照组相比,能够显著抑制脑缺血/再灌注过程中JNK3的磷酸化,并且能显著提高再灌注过程中海马CA1区锥体神经元的存活。结论外源性NO供体能够抑制脑缺血/再灌注过程中JNK3的磷酸化,进一步对海马CA1区锥体神经元发挥了保护作用。本研究为外源性NO对脑卒中的有效治疗提供了参考价值。     

葛根素预处理对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马 CA1区神经元损伤的影响及其机制

目的：探讨葛根素预处理对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马 CA1区神经元损伤的保护作用及其机制。方法雄性 SD 大鼠30只,随机均等分为假手术组、模型组、葛根素预处理组。采用线栓法阻断大鼠大脑中动脉血供,60 min 后拔出栓线造成局部脑缺血再灌注损伤。葛根素预处理组在缺血前1 h 腹腔注射葛根素（100 mg/ kg ）。脑缺血再灌注后第5天,HE 染色法观察海马 CA1区神经元的组织形态学变化,免疫组化法检测海马 CA1区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）的表达。结果 HE 染色结果显示,与模型组相比较,葛根素预处理明显减少脑缺血再灌注引起的海马 CA1区神经元损伤（P<0.05）;免疫组化结果显示,与模型组相比,葛根素预处理使海马 CA1区 Caspase-3、Caspase-9的表达明显降低（ P <0.05）。结论缺血前1 h 葛根素预处理对局灶性脑缺血大鼠海马 CA1区神经元损伤有保护作用,其主要机制可能与抑制凋亡相关蛋白 Caspase-3、Caspase-9的表达有关。     

JNK蛋白在全脑缺血再灌注损伤中的表达

目的:探讨大鼠全脑缺血再灌注氨基末端激酶或应激活化激酶(JNK)蛋白表达的变化。方法:构建大鼠全脑缺血再灌注模型,采用TUNEL法原位检测凋亡锥体细胞,免疫印迹检测不同实验组中JNK蛋白表达。结果:缺血再灌注各组神经元细胞的凋亡率明显高于假手术组(P<0.05)。缺血再灌注组JNK蛋白表达积分光密度值与假手术组相比有显著差异(P<0.05)。结论:在脑缺血及再灌注损伤中存在JNK途径的过度激活,进而导致神经元细胞的凋亡明显增加。     

缺血预处理经抑制线粒体释放细胞色素C减轻大鼠海马神经元缺血再灌注损伤

目的：探讨线粒体细胞色素C的释放在缺血预处理（IPC）保护大鼠海马神经元缺血再灌注损伤中的作用。方法：动物随机分为单纯缺血再灌组（IR组）、IPC加缺血再灌组（IPC+IR组）和对照组。HE染色观察海马CA1区神经元的组织形态学变化;TUNEL染色检测该区神经元凋亡;免疫组化测定该区神经元细胞色素C的表达。结果：IPC+IR组海马CA1区神经元存活数显著多于IR组,凋亡细胞数显著低于IR组,细胞色素C 的释放明显少于IR组(P均＜0.001)。结论：IPC可经阻止线粒体释放细胞色素C抑制凋亡的发生,对海马CA1区神经元缺血再灌损伤起保护作用。     

全脑缺血复灌不同时间对大鼠海马神经元损伤及JNK通路的影响

目的探讨大鼠全脑缺血和复灌不同时间对海马神经元损伤、C-Jun氨基末端激酶（JNK）表达以及JNK激活的影响。方法采用四血管法（4-vessel-occlusion,4-vo）法制作大鼠全脑缺血模型,随机将51只SD大鼠分成假手术组、缺血组和缺血再灌注组,用Western blot检测海马组织JNK的表达和P-JNK的含量。另取9只大鼠缺血10min或缺血20min后复灌7d,甲醛灌注固定后取海马组织用于组织学评价。结果JNK在全脑缺血10min表达明显增加,缺血20min时达到峰值;全脑缺血20min复灌阶段JNK在复灌6h表达明显增加并达到-高峰,复灌12h到达最高峰;P-JNK含量在全脑缺血20min后复灌1h达到高峰,复灌12h再次出现高峰。结论20min全脑缺血后JNK高表达持续时间延长,JNK激活时间更早,更为显著,表明长时间缺血时JNK通路介导的损害作用更大。     

Bcl-2和Bax在缺血预处理保护海马神经元缺血再灌损伤中的作用

目的:探讨凋亡相关基因bcl-2和bax在缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)保护大鼠海马神经元缺血再灌损伤中的作用。方法:随机将动物分为IPC加缺血再灌组(IPC组)、单纯缺血再灌组(IR组)和对照组。观察海马CA1区神经元的组织形态学变化;TUNEL染色检测海马CA1区神经元凋亡;免疫组化测定海马CA1区神经元Bcl-2和Bax的表达。结果:IPC组海马CA1区神经元存活数显著多于IR组,凋亡细胞数显著低于IR组,Bcl-2呈强表达,Bax表达不明显。结论:IPC诱导Bcl-2表达上调和Bax蛋白表达下调,可抑制凋亡的发生,对海马CA1区神经元缺血再灌损伤起保护作用。     

MLK3信号通路在癫痫及脑缺血海马CA3区神经元中的不同作用

目的:研究混合性谱系激酶3(MLK3)信号通路对癫痫及脑缺血海马CA3区神经元的作用?方法:采用海人藻酸(KA)或四动脉结扎法分别建立大鼠癫痫及全脑缺血模型,运用免疫印迹技术检测在KA注射后及脑缺血再灌注后不同时间海马CA3区MLK3和c-Jun的N端激酶(JNK)的活化水平;采用焦油紫染色,观察大鼠海马CA3区神经元的损伤?结果:KA刺激6 h,癫痫大鼠海马CA3区MLK3和JNK明显激活,1 d后仍维持在较高水平(P < 0.05);MLK3和JNK的总蛋白表达并无显著改变?脑缺血大鼠海马CA3区,缺血再灌注后各时间点,MLK3和JNK并未出现明显的活化?此外,大鼠致痫后7 d,海马CA3区神经元大量死亡;缺血再灌注后7 d,海马CA3区神经元并未受到明显损伤?结论:MLK3/JNK信号通路参与了癫痫脑损伤海马CA3区神经元的损伤;但并未介导缺血性脑损伤海马CA3区神经元的存活?     

依达拉奉对脑缺血再灌注大鼠脑组织超氧化物歧化酶、一氧化氮、丙二醛水平的影响

目的探讨依达拉奉对局灶性脑缺血再灌注损伤的影响。方法用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,TUNEL法检测大鼠局灶脑缺血再灌注损伤及依达拉奉干预后海马CA1区原位凋亡情况,用试剂盒检测脑组织丙二醛(MDA)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性。结果缺血再灌注损伤后,大鼠海马CA1区神经元细胞凋亡随时间延长而增加,脂质过氧化产物丙二醛含量和一氧化氮合酶活性增高,依达拉奉干预能显著减轻海马神经元凋亡,降低MDA含量和NOS活性。结论在脑缺血再灌注损伤后,依达拉奉能通过清除自由基而减轻细胞凋亡及脂质过氧化损伤。     

全脑缺血再灌注后海马神经元凋亡及组织NO含量动态变化的研究

目的:观察全脑缺血15 m in后再灌注不同时间点海马神经元凋亡及海马组织NO含量的动态变化。方法:采用4血管闭塞法制备大鼠全脑缺血再灌注模型,采用DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测缺血15 m in后再灌注1 d、2 d、3 d、5 d、7 d时海马神经元凋亡情况;硝酸还原酶法检测各时间点海马组织中NO含量。结果:DNA琼脂糖凝胶电泳显示:在再灌注1 d时呈大致正常条带,2 d、3 d呈“梯状条带,”5和7 d出现了代表部分神经元坏死的涂抹状条带;流式细胞仪检测结果显示:在脑缺血再灌注1 d时,海马神经元凋亡率即明显增加,再灌注3 d时凋亡率达高峰,随后凋亡率逐渐下降,7 d时大致达正常水平;海马组织中NO含量于再灌注后2 d明显升高,3 d达峰值,以后逐渐下降,7 d降至接近对照组水平。结论:全脑缺血再灌注后海马神经元凋亡和NO含量均于再灌注3 d时达高峰,7 d大致恢复至正常水平,提示NO增多可能是诱导海马神经元凋亡的机制之一。     

紫杉醇通过MLK_3/JNK_3信号通路对海马神经元损伤的保护作用

目的研究紫杉醇对脑缺血/再灌注后海马神经元损伤的保护作用的分子机制。方法采用SD大鼠四动脉结扎脑缺血模型（4-VO）,在缺血前30 min脑室注射紫杉醇（4、8、12、20μg/kg）,应用免疫沉淀及免疫印迹方法分析JNK3/MLK3/Fas-L的蛋白表达量和激活情况;焦油紫染色,观察紫杉醇对大鼠海马神经元的作用。结果紫杉醇显著抑制了脑缺血/再灌注后JNK3/MLK3/Fas-L的激活;焦油紫染色观察,紫杉醇对大鼠海马神经元的凋亡有明显的抑制作用。结论紫杉醇对脑缺血/再灌注诱导的海马神经元的损伤具有保护作用,这种保护作用和JNK3介导的信号通路密切相关,为临床治疗脑中风提供理论依据。     

亚低温减轻沙土鼠脑缺血／再灌注损伤与海马CAl区Bax表达变化的关系

目的研究亚低温（33℃,4h）减轻沙土鼠脑缺血／再灌注损伤与海马CA1区Bax表达变化的关系,探讨亚低温脑保护的可能机制。方法采用沙土鼠双侧颈总动脉阻断5min前脑缺血／再灌注损伤模型,随机分为假手术组（SH）、常温再灌注组（IR）、低温假手术组（HSH）、低温再灌注组（HIR）,每组根据再灌注的不同时间点（2h、4h、1d、3d、5d）又分为5个对应的亚组（／Z=6）。在预定时间点行开阔法迷宫检查,TUNEL法检测海马CA1区的凋亡细胞,苏木精-伊红染色检测海马存活细胞,免疫组化检测Bax在海马CA1区的动态变化。结果4h亚低温可显著减少缺血沙土鼠1d、3d、5d的探索活动及CA1区的凋亡细胞,增加存活细胞,抑制脑缺血后海马CA1区Bax的早期表达（2h、4h、1d）。结论4h亚低温对沙土鼠5min前脑缺血有确切的保护作用,抑制海马CA1区缺血／再灌注早期Bax的表达可能是其减少海马细胞凋亡、产生脑保护作用的机制之一。