不同冷冻保护剂对低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响

背景：非程序降温-80℃低温冰箱保存方便快捷,程序降温-196℃液氮保存可靠长久,将两者合二为一简化流程已成功用于临床。目的：观察不同冷冻保护剂对-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响。方法：分设10%二甲亚砜组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉组、5%二甲亚砜联合0.25mol/L海藻糖组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉及0.25mol/L海藻糖组。采用-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法对单采外周造血干细胞进行冷冻保存,通过透射电镜观察细胞超微结构变化,流式细胞仪观察Annexin-V、PI、Caspase-3水平。结果与结论：4组冷冻保存细胞的存活率、凋亡率和死亡率差异均无显著性意义（P〉0.05）。透射电镜下各组细胞超微结构变化差异不明显。单个核细胞群落冷冻保存后存活率在90%以上,含成熟细胞较多的CD45＋细胞群落凋亡发生率可达50%左右。造血干祖细胞群落中,早期细胞较晚期细胞更能耐受冷冻损伤。提示在基础冷冻保护剂二甲亚砜的基础上,加入羟乙基淀粉和海藻糖并未显示出对冷冻保存效果的增强作用。     

超低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存造血干细胞的比较

背景:在造血干细胞整个冷冻保存过程中,受到降温速率、储存温度深浅、冷冻保护剂组合等因素影响,各国学者在提倡选择何种保存方法上面存在不同的主张。目的:比较-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存外周造血干细胞的效果。方法:将采集的造血干细胞分两组,第一组细胞浓度为1×1011L-1,加入10%二甲基亚砜,放入程序冷冻仪内程序设置为室温至-4℃按1℃/min的速率降温,按35℃/min快速降至-45℃,再以15℃/min升至-21℃,然后以5℃/min降至-90℃,取出冷冻管置-196℃液氮罐内。第二组细胞浓度为1×1011L-1,加入5%二甲基亚砜、3%羟乙基淀粉、4%人血白蛋白,将冷冻管置-80℃冰箱过夜后取出,置-196℃液氮罐内的气相,再过夜后置液氮罐液相内。结果与结论:两组冷冻方法保存细胞的锥虫蓝拒染率、回收率、凋亡率和死亡率差异无显著性意义(P>0.05)。结果显示用5%二甲基亚砜、4%白蛋白、3%羟乙基淀粉组成的冷冻保护剂,通过-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法冷冻保存造血干细胞与传统10%二甲基亚砜作为冷冻保护剂用程序降温的方法取得一样效果,操作简便易于临床应用。     

超低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存造血干细胞的比较

背景：在造血干细胞整个冷冻保存过程中,受到降温速率、储存温度深浅、冷冻保护剂组合等因素影响,各国学者在提倡选择何种保存方法上面存在不同的主张。目的：比较-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存外周造血干细胞的效果。方法：将采集的造血干细胞分两组,第一组细胞浓度为1×1011L-1,加入10%二甲基亚砜,放入程序冷冻仪内程序设置为室温至-4℃按1℃/min的速率降温,按35℃/min快速降至-45℃,再以15℃/min升至-21℃,然后以5℃/min降至-90℃,取出冷冻管置-196℃液氮罐内。第二组细胞浓度为1×1011L-1,加入5%二甲基亚砜、3%羟乙基淀粉、4%人血白蛋白,将冷冻管置-80℃冰箱过夜后取出,置-196℃液氮罐内的气相,再过夜后置液氮罐液相内。结果与结论：两组冷冻方法保存细胞的锥虫蓝拒染率、回收率、凋亡率和死亡率差异无显著性意义（P〉0.05）。结果显示用5%二甲基亚砜、4%白蛋白、3%羟乙基淀粉组成的冷冻保护剂,通过-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法冷冻保存造血干细胞与传统10%二甲基亚砜作为冷冻保护剂用程序降温的方法取得一样效果,操作简便易于临床应用。     

阶梯降温冷冻保存的自体外周血造血干细胞移植的临床研究

目的:观察低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存的自体外周血造血干细胞移植治疗恶性血液病的效果,并分析造血干细胞移植后患者生存情况。方法:使用3%羟乙基淀粉、4%白蛋白和5%二甲亚砜(DMSO)组成的冷冻保护剂保护自体造血干细胞,后置于-80℃低温冰箱,再置-196℃液氮罐长期储存,然后用于自体移植。2002年1月至2016年12月98例恶性血液病患者,其中包括急性淋巴细胞白血病10例,非急性髓系白血病24例,多发性骨髓瘤11例,恶性淋巴瘤53例的自体移植。对患者造血恢复时间、总生存率(overall survival,OS)、无进展生存率(progression-free survival,PFS)进行了统计分析。结果:除1例因颅内出血死亡未成功植入外,余97例患者均获得造血重建。中性粒细胞计数≥0.5×10~9/L所需时间平均为9.24±1.89 d,连续3 d不输血小板且血小板≥20×10~9/L所需时间平均为11.04±1.84 d。中位生存时间为47.6 (1-80)个月。1、3和5年总生存率分别为(97.2±1.9)%、(84.2±4.6)%和(77.8±5.6)%。3和5年PFS分别为(74.4±5.1)%和(61.2±6.2)%。结论:通过低温冰箱转液氮阶梯降温法冷冻保存造血干细胞自体移植,可以达到和传统的程序降温冷冻保存法一样的临床移植效果,且移植后并发症发生率无增多。     

骨髓细胞液氮保存21-25年后的细胞活力体外研究

为探讨适合临床应用的骨髓细胞保存方法,揭示细胞长期低温保存效果,将20人份骨髓加入DMSO-AuP(10%二甲亚砜、10%自体血浆)或DMSO-HES-HuA(5%DMSO、6%羟乙基淀粉、4%人血白蛋白)保护剂,分装2毫升/管,600-800管/人份,自控程序降温仪或-80℃低温冰箱预冻降温、液氮中保存21-25年。取冷冻骨髓细胞于38℃复温,检测细胞相关指标。结果表明:加保护剂的细胞标本在-80℃低温冰箱中为低速降温,-30℃前,与自控程序降温仪设定1℃/min的低降温速率接近。DMSO-HES-HuA与DMSO-AuP比较,红细胞形态畸形率分别为(3.5±1.5)%和(12.6±4.8)%;溶血率分别为(3.3±1.6)%和(23.1±5.1)%(p0.05);前者渗透性脆性不变,后者减低;红细胞、血小板、粒单系造血祖细胞、长期培养起始细胞回收率,前后者对比分别为(96.1±1.8)%、(70.0±9.5)%、(49.2±10.9)%、(54.2±13.8)%vs(76.3±5.6)%、(52.7±8.1)%、(43.5±12.3)%、(47.2±13.6)%。用上述保护剂配合上述降温法保存后,细胞在间充质干细胞培养上,生长特性良好。同一保护剂用上述两种降温法保存后,细胞各种回收效果差异不显著(p0.05)。结论:细胞在液氮中保存21-25年,其细胞形态和回收活力(率)良好;保存如骨髓这种细胞成分并非单一的标本时,用5%DMSO-6%HES-4%HuA为保护剂的-80℃冰箱预冻降温后液氮保存,方法简便、经济、易操作,适合临床应用。     

以二甲亚砜及羟乙基淀粉为保护剂冻存骨髓细胞

采用二甲亚砜(Me_2SO)及羟乙基淀粉(HES)联合冷冻保护骨髓细胞,-80℃冰箱降温,液氮储存,其有核细胞计数,台盼蓝柜染率及CFU—GM回收率与采用传统冻存法相似。该法冻存的骨髓细胞回输后病人临床副仅应轻,并能加快高剂量治疗后其造血功能的恢复。     

-80℃直接冻存人造血干细胞的实验研究和临床应用

以5％二甲基亚砜(DMSO)和6％羟乙基淀粉(HES)作为冷冻保护剂,非程控降温、-80℃冷冻保存人造血干细胞的简化方法用于骨髓移植(BMT)及外周干细胞移植(PBSCT)自80年代起已获成功。该方法冻存的造血干细胞活性与传统的10％DMSO作为冷冻保护剂、程控降温、液氮冷冻保存的相当。其主要优点为操作简便,费用低,便于普及。实验研究表明简化法冻存外周血干细胞5年后,BFU-E、CFU-GM的回收率无明显下降,细胞活性约为贮存前的80％。目前临床上推荐该方法用于短期(<1年)冻存造血干细胞。本文就其发展过程、作用机理、技术实施及应用现状作一介绍。     

一种简便的外周血干细胞冷冻保存法

为了简化传统的细胞冷冻方法。即用10%二甲基亚砜（DMSO）作为冷冻保护剂并用程控降温仪-196℃液氮保存,研究了用5%DMSO,3%羟乙基淀粉（HES）和4%人血白蛋白（HSA）作为冷冻保护剂,而不用程控降温仪直接-80℃冰箱冷冻细胞的方法。对比了不同方法冷冻保存外周血干细胞（PBSCs)的细胞活性,单个核细胞数,CFU-GM和CD34^ 细胞回收率。结果发现,简便冷冻法可获得更高的单个核细胞（MNC）和CFU-GM回收率,无凝集现象;并且经长达24个月冷冻保存后仍可获得满意的CFU-GM和CD34^ 细胞回收率,37℃融冻和20℃室温融冻法之间各项指标无明显差别。细胞融冻后在室温下暴露于5%DMSO中1小时,CFU-GM回收率并不降低。而细胞活性从93.2%降至84.5%,所以,这种简便的细胞冷冻保存法简便易行。可替代传统的液氮保存法,对于没有程控降温仪的单位具有实用价值。而且还可减少病人DMSO输入量第一线决策。     

人外周血树突状细胞低温保存的优化研究

目的探寻冻存树突状细胞(DCs)优化的冷冻保护剂组合。方法配制含不同浓度二甲基亚砜(DM-SO)的3种冷冻保护剂组合,A组:5%DMSO+6%羟乙基淀粉(HES)+4%人血清白蛋白(HAS);B组:10%DMSO+40%FCS;C组:12%DMSO+40%FCS,比较3组冷冻保护剂对人外周血CD14+单个核细胞诱导产生的成熟树突状细胞(mDCs)的冻存效果:采用两步法将mDCs冻存于-80℃冰箱过夜后转移至-196℃液氮气相中放置24 h,再将冻存的mDCs复苏后继续培养,并检测、比较冻存前后DC的形态、存活率、细胞表型及其对同种异体T细胞刺激活性的差异。结果 3组不同组合冷冻保护剂冷冻保存的mDCs复苏后其存活的细胞的形态没有发生明显改变,仍保留其成熟表型,并具备对T细胞的刺激活性。结论 3种不同浓度的DMSO冷冻保存mDCs,5%DMSO+6%HES+4%HSA组合更适宜。     

—80℃直接冷冻保存人骨髓造血干细胞的实验研究

－８０℃直接冷冻保存人骨髓造血干细胞的实验研究贾东新宋永平陈绍倩王桂叶白任奎魏旭东王桂菊刘延方赵志平我们采用二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）／羟乙基淀粉（ＨＥＳ）混合物作骨髓冷冻保护剂，－８０℃冰箱直接降温并在该温度下冻存１个月后，对骨髓造血干细胞活性进行评价...     

二甲基亚砜联合羟乙基淀粉的非程控降温法冻存脐血造血干细胞研究

为了探索有效低温保存脐血造血干／祖细胞的冷冻保护剂和技术，进行了二种方法试验。第一种方法联合使用二甲基亚砜(DMSO)和羟乙基淀粉(HES)(分子量120000)作为冷冻保护剂并用非程控降温冷冻技术；第二种方法只使用DMSO作为冷冻保护剂并用程控降温仪冷冻技术保存脐血。对二种方法的效果进行比较。结果表明：15份脐血冻存后细胞存活率、CFU—GM回收率，无论在使用非程控降温的第一种方法和使用程控降温仪的第二种方法均无显著性差异。183份脐血质量检测结果及21例临床移植结果也显示两种方法无显著性差异。结论：联合使用DMSO和HES作为冷冻保护剂并用非程控降温冷冻的方法对脐血造血干细胞有良好的保护作用，是一种简单易行、省时省力、适合于脐血造血干细胞库大批量冻存脐血的方法。     

Long‐term storage of peripheral blood stem cells frozen and stored with a conventional liquid nitrogen technique compared with cells frozen and stored in a mechanical freezer

BACKGROUND: Cryopreservation of hematopoietic progenitor cells using liquid nitrogen and controlled‐rate freezing requires complex equipment and highly trained staff and is expensive. We compared the liquid nitrogen method with methods using a combination of dimethyl sulfoxide (DMSO) and hydroxyethyl starch (HES) for cryopreservation followed by storage in mechanical freezers. STUDY DESIGN AND METHODS: Peripheral blood stem cells (PBSCs) were collected from normal donors by apheresis and allocated to one of four preservation and storage conditions: 1) 10% DMSO with freezing in liquid nitrogen and storage in liquid nitrogen, 2) 5% DMSO and 6% HES with freezing and storage in a ?80°C mechanical freezer, 3) 5% DMSO and 6% HES with freezing in a ?80°C mechanical freezer and storage in a ?135°C mechanical freezer, or 4) 5% DMSO and 6% HES with freezing and storage both in a 135°C mechanical freezer. Cells were stored for 5 years during which total nucleated cells (TNCs), cell viability, CD34+ cell content, and colony‐forming unit–granulocyte‐macrophage content were determined. RESULTS: There were some significant differences in the variables measured during freezing and the 5 years of storage compared to the values before freezing and storage; however, these differences were not consistent and do not favor one protocol over the others. Samples stored for 24 hours before cryopreservation showed a significant decrease in TNCs, but no other significant changes during the 5 years. CONCLUSION: In vitro measurements indicate that PBSCs can be successfully frozen and stored using a combination of DMSO and HES providing smaller amounts of DMSO and allowing simplified freezing and storage conditions.     

人脐带间充质干细胞不同冻存方法探讨

目的 观察不同冻存条件对人脐带间充质干细胞(HUC-MSC)冻存效果的影响.方法 将HUC-MSC传代培养增殖后,设立4个因素和3个水平,分为9个实验组,分别观察不同冻存条件下对各组HUC-MSC的存活率、回收率、免疫抗原CD34和CD44的影响.结果 第9组HUC-MSC解冻复苏后,其存活率、回收率以及免疫抗原CD44积分值均高于其他组(P<0.01),冻存前后其细胞形态无明显差别,细胞免疫抗原CD34均为阴性.结论以90%血清+10%二甲基亚砜(DMSO)作为冻存液,取106/mL以下浓度的HUC-MSC放入厚壁聚乙烯泡沫盒中,立即封存置-80 ℃冻存24 h,再投入液氮中冻存,为最佳冻存方法.     

二甲亚砜与海藻糖联用对冷冻保存血小板的保护作用

本研究观察二甲亚砜（DMSO）与海藻糖联用对冷冻保存血小板的保护效果。实验分设空白组、海藻糖组、DMSO组、5％DMs0加海藻糖联用组、2．5％DMSO加海藻糖联用组。各组血小板置-80℃冰箱保存,37℃水浴融化。采用血细胞计数仪测定血小板回收率和MPV值、电子显微镜观察血小板超微结构变化和流式细胞仪测定血小板的CD41、CD42b、CD61及CD62p的表达水平。结果表明：海藻糖单独应用对提高回收率的保护作用不强,但海藻糖处理后冷冻保存的血小板的形态接近正常。DMSO在保证冷冻保存血小板的回收率和血小板整体完好性方面作用较为突出,但其血小板形态偏向于肿胀,仍有部分血小板呈异形性改变。DMSO和海藻糖合用对维持血小扳外部形态和内部结构接近正常稳态方面具有保护作用,同时保证冷冻保存血小板具有理想的回收率和较高的CD41、CD42b、CD61、CD62p表达水平。结论：DMSO和海藻糖联合应用对冷冻保存血小板具有协同保护作用,但DMSO和海藻糖单用或合用都较难抑制冷冻保存血小板的活化,两者合用作为血小板冷冻保护剂有望促使冷冻保存血小板临床输注效果的进一步提高。     

不同保存方式下嗅鞘细胞的活性

背景：获取和寻找适合的保存方式对嗅鞘细胞实验和临床应用有重要的意义。目的：探索合适的嗅鞘细胞低温保存方式。方法：取对数期生长的嗅鞘细胞,冻存1,3,6个月进行复苏。结果与结论：MTT比色法及锥虫蓝染色显示5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉处理的细胞活性最高,其次是10%二甲基亚砜处理的细胞,5%二甲基亚砜的保护作用最差。冰箱降温或程控降温仪降温方式及不同的冻存时间对嗅鞘细胞活性影响不明显。因此,推荐用5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉作为嗅鞘细胞冻存低温保护剂。     

Improved postthaw viability and in vitro functionality of peripheral blood hematopoietic progenitor cells after cryopreservation with a theoretically optimized freezing curve

BACKGROUND: The freezing curve currently used for the cryopreservation of peripheral blood stem cell transplants (PBSCTs) has been determined empirically. Although the use of cryopreserved PBSCTs is successful and usually leads to rapid hematopoietic recovery, the freeze-thawing process is known to induce a significant degree of cell death. Furthermore, the infusion of dimethyl sulfoxide (DMSO), used to protect the cells against damage induced by freezing, can cause morbidity. Therefore, optimizing the current cryopreservation protocol (with 10% DMSO and a slow linear cooling curve) with theoretically optimized freezing curves and a lower DMSO concentration might improve the recovery after transplantation. STUDY DESIGN AND METHODS: A theoretical model was used to predict optimal freezing curves for 5 and 10 percent DMSO. CD34+-selected and -unselected PBSCs were cryopreserved with the current or the new freezing curves. Postthaw quality was evaluated by cell viability, colony formation, and megakaryocyte outgrowth. RESULTS: With 10 percent DMSO, the use of the predicted optimal freezing curve resulted in increased postthaw viability of CD34+ cells, colony formation, and megakaryocyte outgrowth. Lowering the DMSO concentration to 5 percent resulted in improved postthaw viability and functionality, which was not further improved by use of the theoretically optimized freezing curve. CONCLUSIONS: Our results indicate that the current cryopreservation method for PBSCTs can be improved by either lowering the DMSO concentration to 5 percent or by using the theoretically optimized freezing curve. Infusion of less DMSO and more viable cells might improve the outcome of PBSCT.