辐射诱发细胞恶性转化时Smad7基因表达对细胞生长抑制效应的调节

背景：细胞逃避转化生长因子-β(TGF-β)诱导的对细胞生长、增殖的抑制是许多肿瘤发生的一个重要机制。Smad7是TGF-β信号转导通路的抑制型Smads，它可阻断TGF-β信号在胞浆内的传导，其紊乱是TGF-β信号转导通路紊乱的机制之一。目的：研究在辐射诱发细胞发生恶性转化过程中，Smad7过表达是否可通过抑制TGF-β信号转导通路来拮抗TGF-β对细胞的生长抑制效应。设计：自身对照前瞻性研究。地点和对象：研究在军事医学科学院放射医学研究所完成。实验对象为永生化人支气管上皮细胞BEP2D及辐射诱发恶性转化的人支气管上皮细胞。BERP35T2。干预：以外源性TGF-β作为刺激因子，用Northern blot检测永生化。BEP2D及辐射诱发恶性转化的BERP35T2细胞中Smad7基因的表达水平；用Smad7真核表达载体PCISmad7．neo稳定转染永生化及恶性化的人支气管上皮细胞系，筛选G418抗性克隆，用Western blot加以验证。用MTT法检测Smad7基因转染前后TGF-β对永生化及恶性化细胞的生长抑制效应。主要观察指标：Smad7转染前后BEP2D及BERP35T2细胞Smad7表达水平及TGF-β作用于Smad7转染前后细胞的增殖能力变化。结果：辐射诱发恶性转化的BERP35T2细胞中Smad7表达水平高于永生化BEP2D细胞，相同浓度的TGF-β对BERP35T2细胞的生长抑制效应较BEP2D细胞弱；BEP2D和BERP35T2细胞转染Smad7基因后，各筛选到2个稳定表达SMAD7蛋白的细胞克隆，同对照细胞比，TGF-β对稳定表达Smad7基因的细胞生长抑制能力显著减弱。结论：在辐射诱发细胞发生恶性转化过程中，Smad7基因表达增高，其过表达可降低TGF-β对细胞的生长抑制作用。     

转化生长因子β1及其受体以及Smad4和Smad7在胃癌组织表达的临床病理学意义

目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)及其受体(TGF-βRⅡ)和Smad4、Smad7蛋白在胃癌组织中表达的临床病理学意义.方法 采用免疫组织化学方法检测109例胃癌、28例高度不典型增生、20例低度不典型增生、30例慢性萎缩性胃炎、29例肠上皮化生和21例正常对照的胃黏膜组织中TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad4和Smad7蛋白的表达变化.结果 在胃癌和不典型增生组织中TGF-β1、TGF-βRⅡ和Smad7蛋白表达均明显高于慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生和正常胃黏膜组织(P均<0.001).而Smad4蛋白在高度和低度不典型增生组织中虽呈高表达状态(细胞质染色分数分别为4.89±2.38、5.80±1.54;细胞核染色分数分别为3.89±1.52、3.80±1.33),但在胃癌组织中其表达水平(细胞质染色分数为2.41±2.27、核染色分数为2.02±2.14)又明显降低(P均<0.001).在胃癌组织中TGF-β1、TGF-βRⅡ和Smad7蛋白的表达在进展期胃癌(分别为4.36±2.66、3.05±1.93、4.84±3.06)高于早期胃癌(分别为2.93±1.85、2.17±1.87、4.14±2.46),差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05,P<0.05),而Smad4蛋白的表达则在早期胃癌中表达更高(P<0.001).同时,Smad4蛋白表达与肿瘤的大小(P<0.05)、淋巴结转移(P<0.001)、组织学分期(T分期)(P<0.001)和临床分期(P<0.001)均有关系,而TGF-βRⅡ和Smad4蛋白的表达则与患者的5年生存率有密切关系(P<0.05,P<0.01).在蛋白表达相关性上,TGF-β1蛋白表达与TGF-βRⅡ和Smad7蛋白表达之间存在正相关性(r1=0.45,P<0.05;r2=0.49,P<0.05),而与Smad4蛋白的表达呈负相关(r=-0.21,P<0.05).结论 TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad4和Smad7蛋白共同参与胃癌的形成,且Smad4蛋白是TGF-β信号传导通路中的最关键因素.四种蛋白的检测对反映胃癌的侵袭、转移和预后是一个非常有意义的指标.     

肌腱细胞转化生长因子β及其受体表达:6-磷酸果糖的抑制效应

背景:转化生长因子β在肌腱愈合与粘连形成中具有重要的作用,抑制转化生长因子β及其受体表达可起到一定的防止肌腱术后粘连作用.目的:探讨转化生长因子β天然抑制剂6-磷酸果糖对兔屈趾肌腱腱鞘、腱外膜和腱内膜细胞转化生长因子β及其受体的影响.方法:取兔屈趾肌腱分离培养腱鞘、腱外膜和腱内膜细胞.3种细胞分别加入6-磷酸果糖(实验组)或不加6-磷酸果糖(对照组)培养.采用酶联免疫吸附实验定量检测转化生长因子β及其受体的表达,原位杂交和免疫组织化学观察观测转化生长因子β1的表达. 结果与结论:实验组细胞转化生长因子β及其受体的表达均较对照组下降(P < 0.05).实验组3种细胞阳性转化生长因子β1 mRNA表达率及细胞内转化生长因子β1 mRNA表达强度均较对照组明显降低(P < 0.05).免疫组化显示加入6-磷酸果糖培养后,3种细胞转化生长因子β1表达均明显降低.     

大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后的表达

背景：将生物材料复合细胞因子基因，或复合转入细胞因子基因的细胞植入骨缺损处可以促进骨修复。目的：观察将大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后进行骨缺损基因治疗的可行性。设计：对照观察实验。单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科。对象：新生SD大鼠5只，雌雄不限。方法：实验于2000—02／09在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。通过脂质体介导将转化生长因子β1基因导人大鼠成骨细胞，并以质粒pcDNA，转染细胞作为对照。转染24h后通过链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测目的基因瞬时表达的情况。采用G418筛选转染细胞2周，获得阳性细胞克隆，用链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法检测转染细胞稳定表达转化生长因子β1的情况。主要观察指标：链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测转染细胞基因表达情况。结果：①pcDNA3-TGF-β1转染成骨细胞瞬时表达组化检测和原位杂交检测结果：24h转染成骨细胞胞浆中充满染色的棕黄色颗粒，对照组空载体转染细胞腧浆中刚没有棕黄倘．颗粒．说明转基因细胞中转化毕长因子β1 mRNA明显增高。②G418筛选转基因细胞组化检测：G418筛选2周后的转染细胞仍然有较高的转化生长因子β表达。结论：利用基因转染技术可使成骨细胞瞬时、高效表达细胞因子，转染后瞬时和筛选2周后，均呈现转化生长因子β1基因转染成骨细胞后稳定的高表达，说明采用细胞因子基因转染成骨细胞进行骨缺损的基因治疗具有可行性。     

5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad7和转化生长因子βⅠ型受体表达的影响

背景:很多实验已证明5-氟尿嘧啶应用于瘢痕疙瘩治疗可收到良好的效果.但作者所查针对5-氟尿嘧啶经由转化生长因子β信号通路作用于瘢痕疙瘩分子机制的报道较少.目的:实验拟观察5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad7和转化生长因子βⅠ型受体表达的影响.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-02/10在安徽医科大学微生物教研室完成.材料:标本分别取自因瘢痕疙瘩入院的6例整形手术患者.方法:①瘢痕疙瘩组织成纤维细胞原代培养,取4～6代传代细胞加入5个不同浓度5-氟尿嘧啶(10,20,40,80,160 μmol/L)干预24,48,72 h.②待细胞长至80%汇合时,加入5-氟尿嘧啶配成10,20,30 μmol/L 3个药物干预浓度组,每组再加入转化生长因子β1继续培养.设空白对照和单纯加转化生长因子β1(5 μg/L)的阳性对照.主要观察指标:①利用四甲基偶氮唑盐法测定瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖能力.②蛋白免疫印迹检测各组瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad7和转化生长因子βⅠ型受体的表达.结果:①5-氟尿嘧啶浓度为10,20 μmol/L 作用24 h 时未发现成纤维细胞死亡,与空白对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05);其他浓度下作用各组均有显著的成纤维细胞死亡现象(P < 0.01).②与空白对照组相比,转化生长因子β1组Smad7表达明显减弱,转化生长因子βⅠ型受体表达则显著增强(P均 < 0.01).③加入5-氟尿嘧啶干预后可显著增强Smad7的表达,且在5-氟尿嘧啶浓度为20 μmol/L 时的表达最强(P < 0.01).④不同浓度5-氟尿嘧啶对转化生长因子βⅠ型受体表达无明显影响.结论:5-氟尿嘧啶浓度为10～20 μmol/L 时无细胞毒性,与转化生长因子β1共同培养成纤维细胞,能够提高该细胞转化生长因子β1诱导的Smad7表达,但对于转化生长因子βⅠ型受体的表达没有明显影响.     

大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后的表达

背景将生物材料复合细胞因子基因,或复合转入细胞因子基因的细胞植入骨缺损处可以促进骨修复.目的观察将大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后进行骨缺损基因治疗的可行性.设计对照观察实验.单位华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科.对象新生SD大鼠5只,雌雄不限.方法实验于2000-02/09在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成.通过脂质体介导将转化生长因子β1基因导入大鼠成骨细胞,并以质粒pcDNA3转染细胞作为对照.转染24 h后通过链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测目的基因瞬时表达的情况.采用G418筛选转染细胞2周,获得阳性细胞克隆,用链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法检测转染细胞稳定表达转化生长因子β1的情况.主要观察指标链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测转染细胞基因表达情况.结果①pcDNA3-TGF-β1转染成骨细胞瞬时表达组化检测和原位杂交检测结果24 h转染成骨细胞胞浆中充满染色的棕黄色颗粒,对照组空载体转染细胞胞浆中则没有棕黄色颗粒,说明转基因细胞中转化生长因子β1 mRNA明显增高.②G418筛选转基因细胞组化检测G418筛选2周后的转染细胞仍然有较高的转化生长因子β1表达.结论利用基因转染技术可使成骨细胞瞬时、高效表达细胞因子,转染后瞬时和筛选2周后,均呈现转化生长因子β1基因转染成骨细胞后稳定的高表达,说明采用细胞因子基因转染成骨细胞进行骨缺损的基因治疗具有可行性.     

转化生长因子-β1影响瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3和Smad7 mRNA表达的调控机制

目的研究转化生长因子-β 1(TGF-β 1)影响瘢痕疙瘩成纤维细胞( KFB) Smad3,7mRNA表达的调控机制.方法用放线菌酮( CHX)和放线菌素 D预处理 KFB,以分别阻断 KFB内源性蛋白质的合成及 mRNA合成.采用逆转录 PCR法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞 Smad3,7 mRNA表达水平.结果经 CHX预处理后, KFB的 Smad3 mRNA表达轻度上调,并完全抑制了 TGF-β 1对 KFB Smad3 mRNA的下调作用,而 CHX预处理对 KFB的 Smad7 mRNA表达及 TGF-β 1上调 Smad7 mRNA的作用并无明显影响.经放线菌素 D预处理后,随 TGF-β 1作用时间延长, KFB的 Smad3 mRNA表达水平无明显下降.结论 TGF-β 1对 KFB Smad3 mRNA表达的调控过程可能还需要细胞合成其他蛋白的参与;但对 Smad7 mRNA表达的调控则不需要细胞合成其他蛋白参与, KFB细胞中的 Smad7可能也是活化的 Smads的直接靶基因.     

miR-17对靶基因转化生长因子受体β2的负性调控表达

目的 探讨miR-17在HEK293T细胞中对转化生长因子受体β2(transforming growth factor receptor beta 2,TGFRβ2)的调控作用.方法 采用生物学信息预测软件对miRNA-17的靶基因进行预测,选定TGFRβ2为靶基因,构建pCDNA3.1+ miRNA 17重组表达载体.将HEK293T细胞分为3组,分别为对照组(无转染)、空载组(转染空质粒)和miR-17组(转染pcDNA3.1-GW/EmGFP-miR-17质粒),3组采用实时定量PCR检测miRNA-17和TGFRβ2mRNA表达水平,采用Western blot检测TGFRβ2蛋白表达水平.将HEK293T细胞再分为3组,分别为CTL组(转染miR-17无义寡核苷酸序列)、miR-17组(转染pcDNA3.1-GW/EmGFP-miR-17质粒)和ASO-miR-17组(转染miR-17反义寡核苷酸序列),采用免疫荧光法检测各组TGFRβ2荧光强度.结果 转染24 h后,空载组和miR-17组HEK293细胞处于对数生长期,细胞突起和包体均正常,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);miR-17组miR-17表达量(5.391±0.053)明显高于空载组(1.654±0.075)与对照组(1.436±0.038),TGFRβ2 mRNA和蛋白表达量(2.449±0.092、1.030±0.030)明显低于空载组(6.135±0.058、5.550±0.040)和对照组(6.862±0.074、5.090±0.030) (P＜0.05);ASO-miR-17组TGFRβ2荧光强度(1.144±0.079)明显高于CTL组(0.776±0.044)和miR-17组(0.917±0.096) (P＜0.05).结论 miR-17可负性调节靶基因TGFRβ2的表达.     

miR-17对靶基因转化生长因子受体β_2的负性调控表达

目的探讨miR-17在HEK293T细胞中对转化生长因子受体β2(transforming growth factor receptor beta 2,TGFRβ2)的调控作用。方法采用生物学信息预测软件对miRNA-17的靶基因进行预测,选定TGFRβ2为靶基因,构建pCDNA3.1+miRNA-17重组表达载体。将HEK293T细胞分为3组,分别为对照组(无转染)、空载组(转染空质粒)和miR-17组(转染pcDNA3.1-GW/EmGFP-miR-17质粒),3组采用实时定量PCR检测miRNA-17和TGFRβ2mRNA表达水平,采用Western blot检测TGFRβ2蛋白表达水平。将HEK293T细胞再分为3组,分别为CTL组(转染miR-17无义寡核苷酸序列)、miR-17组(转染pcDNA3.1-GW/EmGFP-miR-17质粒)和ASO-miR-17组(转染miR-17反义寡核苷酸序列),采用免疫荧光法检测各组TGFRβ2荧光强度。结果转染24h后,空载组和miR-17组HEK293细胞处于对数生长期,细胞突起和包体均正常,与对照组比较差异无统计学意义(P0.05);miR-17组miR-17表达量(5.391±0.053)明显高于空载组(1.654±0.075)与对照组(1.436±0.038),TGFRβ2mRNA和蛋白表达量(2.449±0.092、1.030±0.030)明显低于空载组(6.135±0.058、5.550±0.040)和对照组(6.862±0.074、5.090±0.030)(P0.05);ASO-miR-17组TGFRβ2荧光强度(1.144±0.079)明显高于CTL组(0.776±0.044)和miR-17组(0.917±0.096)(P0.05)。结论 miR-17可负性调节靶基因TGFRβ2的表达。     

苯那普利对阿霉素肾病大鼠肾皮质Smad3、Smad7表达的影响

目的 :评估苯那普利对阿霉素肾病大鼠肾皮质中Smad3、Smad7表达的影响。方法 :建立阿霉素肾病大鼠模型 ,药物组予苯那普利 10mg·kg-1·d-1灌胃。分别于第 4、7周取肾皮质 ,通过RT PCR半定量分析Smad7mRNA表达 ,通过光镜、电镜观察肾脏病理改变 ,用免疫组化法测定转化生长因子 β1(TGF β1)、Smad3、Smad7蛋白表达。结果 :Smad3、Smad7主要表达于肾小管上皮细胞 ,肾病组Smad7mRNA、蛋白的表达随病变加重而上调 ,Smad3蛋白表达下调 ,而苯那普利可抑制Smad7的上调和Smad3的下调。结论 :在阿霉素肾病大鼠肾皮质的小管病变进展中 ,Smads起着重要作用。苯那普利可通过调节Smads的表达而保护肾脏     

Smad7稳定转染胶质母细胞瘤细胞系的建立

目的建立Smad7稳定转染胶质母细胞瘤细胞株，并观测Smad7表达对U251细胞增殖的影响。方法应用脂质体将真核细胞表达质粒pCDNA3.0-Smad7和空载质粒pCDNA3.0转染人胶质母细胞瘤细胞。并在转染后绘制生长曲线以观测细胞增殖。结果RT-PCR和westem blot证实Smad7在转录和蛋白翻译水平上均呈高表达。Smad7转染后，细胞增殖速度减慢。结论Smad7稳定转染胶质母细胞瘤细胞株已成功建立，Smad7高表达可抑制胶质母细胞瘤细胞株的增殖。     

氧化苏木素抑制人乳癌MCF-7细胞生长及其相关机制

目的:探讨氧化苏木素对人乳癌MCF-7细胞生长的抑制作用及其相关作用机制.方法:MTT实验检测氧化苏木素对乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制;PI染色流式细胞仪检测细胞周期的变化;Western blot 实验检测细胞CD1和β-Catenin蛋白的变化.结果:氧化苏木素显著性的抑制了人乳癌MCF-7细胞的生长,将细胞周期阻滞在G1期;0、7.5、15、30 μmol/L的氧化苏木素处理MCF-7细胞48 h后,G1期在整个细胞周期中的比率从(48.10±3.48)％依次增加到(59.56±4.31)％、(70.37±3.71)％、(77.75±6.12)％;Western blot结果显示氧化苏木素下调了MCF-7细胞CD1和3-Catenin蛋白的表达.结论:氧化苏木素具有高效的抑制人乳癌MCF-7细胞增殖的活性,抑制Wnt/β-Catenin信号通路,下调CD1蛋白是其抑制细胞生长的主要机制.     

Regulation of cell division cycle progression by bcl-2 expression: a potential mechanism for inhibition of programmed cell death

Expression of the bcl-2 gene has been shown to effectively confer resistance to programmed cell death under a variety of circumstances. However, despite a wealth of literature describing this phenomenon, very little is known about the mechanism of resistance. In the experiments described here, we show that bcl-2 gene expression can result in an inhibition of cell division cycle progression. These findings are based upon the analysis of cell cycle distribution, cell cycle kinetics, and relative phosphorylation of the retinoblastoma tumor suppressor protein, using primary tissues in vivo, ex vivo, and in vitro, as well as continuous cell lines. The effects of bcl-2 expression on cell cycle progression appear to be focused at the G1 to S phase transition, which is a critical control point in the decision between continued cell cycle progression or the induction programmed cell death. In all systems tested, bcl-2 expression resulted in a substantial 30-60% increase in the length of G1 phase; such an increase is very substantial in the context of other regulators of cell cycle progression. Based upon our findings, and the related findings of others, we propose a mechanism by which bcl-2 expression might exert its well known inhibition of programmed cell death by regulating the kinetics of cell cycle progression at a critical control point.