现代分子生物学技术系列讲座之四反义核酸技术

现代分子生物学技术系列讲座之四──反义核酸技术杜卫东（生物化学与分子生物学研究中心）反义核酸技术是利用人工合成的特异性反义寡核苷酸定向抑制或封闭同的基因（ＤＮＡ或ＲＮＡ）表达的技术。它包括三方面的内容：（１）反义及ＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ），...     

反义N-ras-1基因对成纤维细胞生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的应用反义Ｎ－ｒａｓ１基因阻断成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）的促增殖作用，为防治以血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖为主要特征的血管损伤后再狭窄等心血管疾病提供进一步探索的途径。方法利用构建的含反义Ｎ－ｒａｓ１基因的逆转录病毒质粒（ｆｐＧｖ１－ＭＴ－ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＮ－ｒａｓ１）转染于培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ），ｆｐＧｖ１－ＭＴ逆转录病毒空载质粒及未转染质粒的细胞为对照，观察其对ｂＦＧＦ诱导的ＶＳＭＣ的影响。结果反义Ｎ－ｒａｓ１细胞数为（１６．８±１．３）×１０４（细胞／ｍｌ），空载质粒对照细胞为（３０．１±１．２）×１０４，两者差异有显著意义（Ｐ＜０．００１）；反义Ｎ－ｒａｓ１细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率为７６４３±６７２（ｃｐｍ），空载质粒对照细胞为１５１３１±１３８（ｃｐｍ），两者差异有非常显著意义（Ｐ＜０．００１），同时应用反义Ｎ－ｒａｓ１基因的细胞ＲａｓｍＲＮＡ表达水平明显降低，其表达蛋白ｐ２１也明显降低。结论反义Ｎ－ｒａｓ１基因对ＶＳＭＣ及ｂＦＧＦ诱导ＶＳＭＣ增殖有抑制作用。     

反义寡脱氧核苷酸对人肝癌裸鼠模型生长及转移的影响

目的 观察反义Ｈ－ｒａｓ寡脱氧核苷酸（ＯＤＮ）对高表达蛋白ｐ２１Ｈ- ｒａｓ的人肝癌高转移裸鼠模型ＬＣＩ－Ｄ２０细胞生长、凋亡及转移潜能的影响。方法原代培养ＬＣＩ－Ｄ２０细胞，经１０μｍｏｌ／Ｌ浓度反义ＯＤＮ处理后，以１．５×１０细胞数分别接种于１４只裸鼠皮下缝制皮囊内：６只接种反义Ｈ－ｒａｓＯＤＮ处理细胞，４只接种Ｈ－ｒａｓ非特异性反义ＯＤＮ处理细胞，余４只接种未作处理的对照细胞。结果反义Ｈ－ｒａｓ对ＬＣＩ－Ｄ２０细胞增殖具有显著抑制作用（ｔ＝３１．５２９，Ｐ＜０．０１），反义ＯＤＮ处理细胞，Ｓ期比率（３６．０±１．４）显著低于对照组（５８．５±０．９，ｔ＝１３．５１９，Ｐ＜０．０１），而Ｇ１／Ｇ０期比率（５６．７％±１．１％）高于对照组（３７．４±０．７，ｔ＝１４．８０２，Ｐ＜０．０１）；反义Ｈ－ｒａｓＯＤＮ处理细胞的凋亡发生率（３４．０％±４．５％）显著高于对照组（２．５％±１．２％，ｔ＝１３．４３４，Ｐ＜０．０１）；反义Ｈ－ｒａｓ处理对ＬＣＩ－Ｄ２０细胞在接种动物体内的生长具有显著延迟抑制作用（ｔ＝３．５０９，ｔ＝３．４５２，Ｐ＜０．０１）；接种动物的肺转移率，反义Ｈ－ｒａｓＯＤＮ处理组显著低于对照组。     

反义myb寡核苷酸对内皮素诱导动脉平滑肌细胞增殖抑制作用的研究

合成反义和正义ｃ－ｍｙｂ１８－ｍｅｒ，分别导入培养的ＷＫＹ主动脉平滑细胞（ＳＭＣｓ），同时用内皮素诱导ＳＭＣｓ增殖。反义ｃ－ｍｙｂ寡核苷酸（ＯＤＮｓ）对内皮素诱导ＳＭＣｓ的抗细胞增殖抑制作用随浓度（６０μｍｏｌ·Ｌ－１～１２０μｍｏｌ·Ｌ－１）的增加而增加。用１２０μｍｏｌ·Ｌ－１反义ＯＤＮＳ抗细胞增殖能力随时间延长而下降。免疫组化显示受抑制细胞ｍｙｂ水平较同期对照组或正义ＯＤＮｓ组低。以上为反义ＯＤＮｓ抑制外源性生长因子或细胞因子诱导靶基因的高表达和细胞增殖提供了新的线索，同时为探讨癌基因表达调控与动脉ＳＭＣｓ增殖的关系提供了一种新方法。     

反义核酸技术及其在心血管研究中的应用

反义核酸技术及其在心血管研究中的应用北京医科大学生物化学教研室邱京欣，周爱儒北京医科大学生物化学教研室反义（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）核酸是揩按照碱基互补配对原则，能够与互补链（靶基因或其表达的ｍＲＮＡ）特异结合，从而影响靶基因转录或翻译的ＲＮＡ或ＤＮＡ片...     

ODC反义RNA对人肺鳞癌细胞cfos基因及人肺癌表面相关抗原表达的影响

为探讨鸟氨酸脱羧酶（ＯＤＣ）反义ＲＮＡ逆转人肺鳞癌Ｌ７８细胞恶性表型的分子机理，采用核酸杂交、免疫细胞化学染色等方法作研究。结果表明，在ＯＤＣ反义基因稳定整合、ＯＤＣ反义ＲＮＡ高效表达的转染细胞株中，ｃｆｏｓｍＲＮＡ的表达增强，而人肺癌细胞表面相关抗原的表达明显减少。提示ＯＤＣ反义ＲＮＡ抑制多胺合成而引起Ｌ７８细胞恶性表型逆转，与其对ｃｆｏｓ及某些肿瘤相关基因表达的调节作用有关。     

反义N—ras1DNA片段部分抑制人膀胱癌BIU—87细胞VEGF基因的表达

本文报道将载有反义人Ｎ－ｒａｓｌ（ｅｘｏｎｌ）ＤＮＡ片段的重组表达质粒ｆＰＧＶ１－ＭＴ－Ｎｒａｓｌ（Ａ）导入人膀胱移行细胞癌ＢＩＵ－８７细胞系，可以部分抑制ＢＩＵ－８７细胞中ＶＥＧＦｍＲ－ＮＡ的表达。提示ＶＥＧＦ基因的表达可受到反义Ｎ－ｒａｓ１ＤＮＡ片段的调控。本研究不仅增加了从分子水平对ＢＩＵ－８７细胞的认识，有助于进一步确定该细胞的生物学特征，还为以后具有Ｎ－ｒａｓ癌基因及ＶＥＧＦ基因表达的膀胱癌进行反义癌基因治疗提供一定的理论和实验依据。     

反义寡核苷酸设计策略与学习记忆研究

反义核酸是指与体内某ＲＮＡ或ＤＮＡ序列具有互补顺序,并能通过碱基配对与互补链杂交,从而影响其转录或翻译过程的ＲＮＡ或ＤＮＡ片段。反义ＲＮＡ和ＤＮＡ的特异性源自反义序列和靶序列之间的碱基配对。反义核酸的长度可长可短,长的反义核酸一般都借助表达载体导入细胞,通过在细胞中进行转录而实现功能。反义寡核苷酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ,ＯＤＮ）是短序列的单链ＤＮＡ,在体外通过化学合成,与细胞内特异的靶序列互补。ＯＤＮ比通过表达载体导入的方式应用广泛,而且由于它可以作为反义…     

反义寡核苷酸技术的进展及应用

随着分子生物学和遗传工程的发展,基因治疗应运而生,得到广泛的肯定,其中包括反义核酸技术,简称反义技术。那些能与特定的ＤＮＡ或ＲＮＡ以碱基互补配对的方式结合,并阻止其转录和翻译的短核酸片段,称为反义寡核苷酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）。研究反义寡核苷酸作用机理和应用的技术叫反义技术。 反义技术概述 早在１９８４年,Ｊｏｈｎａｔｈａｎ Ｇ就报道了用反义ＲＮＡ抑制ＴＫ基因的表达取得了良好的效果~［１］。反义寡核苷酸抑制靶基因的作用途经包括：１．反义寡核苷酸与ＤＮＡ双螺旋形成三螺旋,…     

反义C—myc寡核苷酸对人肝癌细胞SMMC—7721的生长抑制

针对Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ第二外显子起始妈ＡＵＧ及下游４个密码子设计合成了反义、正义及锚配寡核苷酸（ＯＤＮｓ）、并对合成的ＯＤＮｓ进行 硫代磷酸化修饰。在人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１培养体系中，对反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）抑制细胞增殖的作用进行了研究。发现（１）与正义和错配ＯＤＮｓ相比较，反义Ｃ－ｍｙｃＯＤＮ有明显抑制人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１生长的作用；（２）该生长抑制作用随ＡＳＯＤＮ剂量增加而增     

硫代修饰c—fos反义寡脱氧核苷酸的潜在抗焦虑作用研究

目的：探讨硫代修饰ｃ－ｆｏｓ反义寡脱氧核苷酸的潜在药理学价值及分子机制。方法：建立焦虑的动物模型,将硫代修饰ｃ－ｆｏｓ反义寡脱氧核苷酸注入大鼠侧脑室;高架十字迷宫和空场实验评估大鼠焦虑行为,免疫组织化学技术检测Ｆｏｓ蛋白表达,计算机图像分析系统定量。结果：ｃ－ｆｏｓ反义寡核苷酸减少了下丘脑室旁核部位的Ｆｏｓ免疫反应阳性神经元,抑制率５７．０３％。并可以拮抗应激所至的焦虑相前行为,与ｄｉａｚｅｐａｍ     

反义myb和反义myc寡核苷酸对动脉平滑肌细胞增殖和其蛋白表达的抑制作用

反义ｍｙｂ和反义ｍｙｃ寡核苷酸对动脉平滑肌细胞增殖和其蛋白表达的抑制作用衡阳医学院心血管病研究所杨和平，涂玉林，杨永宗北京医科大学心血管研究所董薇，李岱宗，周爱儒，汤健动脉粥样硬化、再狭窄和高血压血管中都存在着平滑肌细胞（ＳＭＣｓ）增殖，而ｃ－ｍｙｂ...     

ODC反义RNA对人肺鳞癌细胞c—myc及c—Ha—ras基因表达的影响

目的：探讨鸟氨酸脱羧酶（ＯＤＣ）反义ＲＮＡ逆转人肺鳞癌细胞ＬＴＥＰ７８（Ｌ７８）恶性表型的分子机理。方法：核酸杂交，免疫细胞化学染色等。结果：在ＯＤＣ反义基因稳定整合、ＯＤＣ反义ＲＮＡ高效表达的转染细胞株中，ｃｍｙｃ及ｃＨａｒａｓｍＲＮＡ的表达比Ｌ７８亲本细胞显著下降；ｒａｓＰ２１蛋白的表达也受到明显抑制。结论：ＯＤＣ反义ＲＮＡ引起细胞内多胺耗竭，对ｃｍｙｃ及ｃＨａｒａｓ基因表达有明显的下调作用，这可能是其逆转人肺鳞癌细胞恶性表型的重要机制之一。     

硫代反义寡脱氧核苷酸阻断树鼠感染丁型肝炎病毒的初步研究

硫代反义寡脱氧核苷酸阻断树鼠感染丁型肝炎病毒的初步研究ＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｙｏｆＨＤＶＳ－ａｓＯＤＮｔｏｐｒｅｖｅｎｔＨＤＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｔｕｐａｉａ毛青，王升启，李奇芬，王玉芝，吴纯清，陈鸿书（第三军医大学西南医院传染科）６３００...     

TGFα反义RNA对人脑胶质瘤细胞系BT325的影响

ＴＧＦα反义ＲＮＡ对人脑胶质瘤细胞系ＢＴ＿（３２５）的影响惠宏襄，金　明，王成济（生物化学教研室）关键词反义核酸；转化生长因子α；胶质瘤；逆转录病毒载体中图法分类号　Ｑ５２２．１转化生长因子α（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒα，ＴＧ...     

反义寡核苷酸对乙型肝炎病毒基因表达的影响

将乙肝病毒（ＨＢＶ）的反义或正义寡核苷酸，加入能复制ＨＢＶ的肝癌细胞模型ＨｅｐＧ２．２．１５中，通过检测其上清中ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ的含量，初步分析了反义寡核苷酸潜在的抗ＨＢＶ能力。针对Ｃ基因区１９７４─１９５５的反义链（ＣＳＰ）在１５μｍｏｌ／Ｌ浓度下可抑制８４．８％的ＨＢｓＡｇ表达和４０．０％的ＨＢｅＡｇ表达，停药２日时抑制率仍分别为９３．５％和３９．０％。实验期间未发现反义链对上述细胞形态或细胞生长状况有明显影响。结果提示反义寡核苷酸ＣＳＰ在实验条件下具有一定的抑制细胞ＨＢＶ表达的能力。     

反义c-myc、增殖细胞核抗原基因片断抑制血管平滑肌细胞相关基因表达

目的研究有效的防治血管术后再狭窄的方法，以及应用反义ｃｍｙｃ、增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因片断来封闭其相应基因表达的可行性。方法设计并合成ｃｍｙｃ、ＰＣＮＡ正义、反义及四个碱基错配的反义寡核苷酸，经体外稳定性检测和细胞转染实验证实其有效性后，分别作用于体外培养的血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ），应用逆转录ＰＣＲ半定量测定及计算机图像分析的方法，观测其对ｃｍｙｃ、ＰＣＮＡ基因表达的影响。结果设计合成的寡核苷酸在血清培养基中１～５天未被完全降解；寡核苷酸能顺利进入ＶＳＭＣｓ内；１０μｍｏｌ／Ｌ浓度的反义ｃｍｙｃ、ＰＣＮＡ作用于ＶＳＭＣｓ后１～５天，其相应的ｃｍｙｃ和ＰＣＮＡ基因表达减弱，计算机图像分析表明其表达产物与对照组相比差异有显著意义（Ｐ＜０．０５），而正义和错配反义寡核苷酸无此效应（Ｐ＞０．０５）。结论反义ｃｍｙｃ和ＰＣＮＡ寡核苷酸可通过抑制其相应基因表达来实现阻遏血管平滑肌细胞增殖     

催产素与其反义肽抗体的相似性

观察了催产素反义肽抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙｏｆａｎｔｉｓｅｎｓｅｐｅｐｔｉｄｅｏｘｙｔｏｃｉｎ，简称ＡＳ－　ＯＴ－Ａｂ）对催产素受体（ＯＴＲ）的识别特性。该反义肽是按照牛催产素（ＯＴ）和它的结合蛋白ＮｅｕｒｏｐｈｙｓｉｎＩ（ＮＰＩ）氨基端前十二个氨基酸（包括ＯＴ［１－９］）编码ＤＮＡ的互补序列固相合成的，简称ＡＳ－ＯＴ。ＡＳ－ＯＴ与甲状腺球蛋白联结后，制备兔抗ＡＳ－ＯＴ多克隆抗体（ＡＳ－ＯＴ－Ａｂ），间接酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）证明，ＡＳ－ＯＴ－Ａｂ能与催产素受体（ＯＴＲ）相互结合，而这一结合能被ＯＴ所阻断，显示了ＯＴ与其反义肽抗体的相似性。     

ODC反义RNA对人肺鳞癌细胞c—fos基因及人肺癌表面相关抗原…

为探讨鸟氨酸脱羧酶反义ＲＮＡ逆转人肺鳞癌Ｌ７８细胞恶性表型的分子机理，采用核酸杂交、免疫细胞化学染色等方法研究。结果表明，在ＯＤＣ反义基因稳定整合、ＯＤＣ反义ＲＮＡ高效表达的转染细胞株中，ｃ－ｆｏｓｍＲＮＡ的表达增强，而人肺癌细胞表面相关抗原的表达明显减少。     

反义bcr／abl寡核苷酸诱导K562细胞凋亡时Caspase3表达及？…

用反义ｂｃｒ／ａｂｌ寡核苷酸片段诱导Ｋ５６２细胞凋亡,观察Ｃａｓｐａｓｅ３表达及活性变化,以阐明Ｃａｓｐａｓｅ在慢性髓性白血病（ＣＭＬ）发病机制中的作用。方法：用反义ｂｃｒ／ａｂｌ寡核苷酸片段ＡＳ和对照无义片段ＮＳ自理５６２,ＳＷＩＭＸＬＥＱＵＭＦ ＹＮＶ ＥＹ display status