一种PCR结合DNA回收克隆基因方法

目的 探讨一种结合DNA片段回收扩增目的片段的方法.方法 以PCR扩增克隆β-珠蛋白MAR和survivin启动子为例,根据GenBank报道的序列设计引物,PCR扩增克隆β-珠蛋白MAR和survivin启动子.结果 PCR产物有非特异DNA片段、根据DNA片段大小采取凝胶DNA回收与预期片段相符的DNA片段,送公司测序.测序结果表明所扩增的序列和GenBank报道的序列一致.结论 用该方法可以成功克隆出目的DNA片段.     

DNA印迹试验

DNA印迹是一种将电泳分离的DNA片段转移到固相支持物上用探针与靶DNA进行杂交的技术,又称Southem杂交。利用一种或多种限制内切酶酶切消化的基因组DNA,或经PCR获得扩增片段,经琼脂糖凝胶电泳,所得的DNA片段按分子大小分离,DNA片段经琼脂糖凝胶、变性,并将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上(多为硝酸纤维素膜,NC或尼龙膜),     

丝状真菌脱氧核糖核酸片段快速扩增法

目的：用聚合酶链反应(PCR)法扩增丝状真菌中脱氧核糖核酸(DNA)片段。方法：将菌丝液氮研磨成粉状后溶于三羟甲基氨甲烷缓冲液(TE)，煮沸15～20min后，用上清做模板扩增DNA片段，然后将PCR产物作琼脂糖电泳，把含有目的片段的胶切下后溶于TE，做第2次PCR的模板，PCR后琼脂糖凝胶电泳。结果：获得大量目的DNA片段。结论：此方法从丝状真菌中扩增DNA片段，是一种既经济又方便可行的方法，大大提高了工作效率，其效果显著。     

对琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段的有效性的再认识

目的探讨琼脂糖凝胶电泳对DNA酶切片段的分离效果.方法将酶切后DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳,回收单一目的片段并再行电泳,观察非目的片段的分离效果.结果第一次回收的"单一"目的片段中,除目的DNA外,还含有多条较小的DNA分子;再次电泳回收的单一目的片段中,肉眼已看不见其它DNA分子,其纯度已大为提高;但是将几个批次的再次回收的目的片段浓缩后进行电泳发现其中仍然含有其它DNA片段.结论琼脂糖凝胶电泳难以将大小不同的DNA片段彻底分开,电泳后回收的目的片段中含有大小不同的污染分子.     

重组质粒pBI190的构建

利用质粒pBI121为载体,通过对其酶切位点的改造,引入一个目的基因（204 bp）,构建成一个新的质粒pBI190。方法：用Sac I和Xba I分别对质粒pBI121进行酶切,0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收所需片段,将已知DNA片段用引物进行PCR扩增后,使用T4 DNA连接酶将上述得到的DNA片段与酶切回收的质粒pBI121 DNA进行连接。结果：将连接产物转化大肠杆菌DH5α及筛选与测序公司进行鉴定,最终符合目的要求。结论：本实验将质粒pBI121进行了改造,构建了新的表达载体pBI190,并且分析了实验过程中遇到的相关问题。     

一种从凝胶中直接回收DNA进行PCR的方法

分子生物学实验中，常常需要从琼脂糖凝胶或聚丙酰胺凝胶中回收DNA，进行纯化、探针标记或进一步扩增等。鉴于PCR反应具有高度敏感性，微量模板即可扩增出阳性产物。我们从琼脂糖凝胶中直接回收DNA进行PCR，取得较满意的结果，报道如下。     

基于水凝胶的基因组DNA固定法研究

目的：通过对人基因组DNA固定化的研究,探讨特异性高的单点共价固定方法,实现对人基因组DNA的反复利用。
方法：选取Mirzabekov等发明的DNA-水凝胶共聚化学法作为基因组DNA固定方法,使用甲基丙烯酰胺凝胶作为固相支持载体,以(CH2)6-NH2氨基末端修饰的PCR产物及甲酸随机断裂修饰的pGEM-T-HLA-G质粒为模板,使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其固定效率,并通过PCR法检测该固定方法的热稳定性。将该法初步应用于人类基因组DNA的固定和反复利用,对基因组DNA扩增的片段进行测序,排除突变可能。
结果：使用甲基丙烯酰胺凝胶作为固相支持载体,实现了对质粒DNA以及人基因组DNA的固定和反复使用,该方法可以经受16轮的PCR扩增（每轮36个循环）。测序结果证实基因组DNA的扩增片段未发生突变。
结论：甲基丙烯酰胺凝胶法固定DNA的热稳定性好,特异性高,可用于全基因组测序及SNP检测。     

简便快速的PCR产物回收方法

目的分析比较几种PCR产物回收方法的回收效果.方法针对PCR DNA的回收效果及回收特点,采用内皮素(Endothelin)基因PCR反应产物,分别利用本室建立的二种新方法--速冻-快速离心法、凝胶浸泡法和传统方法--玻璃珠试剂盒回收法对PCR产物DNA进行回收,用琼脂糖凝胶电泳鉴定3种方法回收PCR产物的效果.结果发现两种新方法回收DNA带的亮度强,与传统方法相比,差异无显著性(P＞0.10).结论说明速冻-快速离心法与凝胶浸泡法不仅具有玻璃珠试剂盒回收PCR 产物的效果,而且经济、方便、可靠,是两种可行的PCR产物回收方法.     

一种改进的提取人外周血和组织线粒体DNA的方法

目的：建立一种简便、快捷地从人外周血和组织中制备高质量线粒体DNA的方法。方法：以差速离心法分离线粒体,用碱性SDS法裂解线粒体膜,释放线粒体DNA后用酚／氯仿抽提,TE或ddH2O溶解。然后将所得线粒体DNA进行纯度鉴定并和其他现有方法制备的线粒体DNA用PCR进行长片段扩增,比较扩增效果。结果：用改进的方法制备的线粒体DNA中没有检测到核DNA,并能有效扩增8kb长的目的片段。结论：改进后的方法简便、快捷,制备的线粒体DNA纯度高,也有利于长片段PCR扩增。     

一步法分离石蜡切片DNA的改进与鉴定

目的　改进一种以含蛋白酶K的裂解液作用于石蜡包埋处理的细胞、分离DNA粗提液用于PCR扩增的实验方案。方法　石蜡包埋组织切片经常规脱蜡处理,用蛋白酶K裂解液洗脱细胞,55　℃消化3　h后离心,吸取上清液;分光光度法检测DNA酶裂解液质量和浓度;以之为模板分别扩增人线粒体基因微卫星多态D310区、ATPase6基因区和核基因HBB、BRCA1等的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测分析PCR扩增情况,并测序验证扩增产物。结果　以石蜡切片的DNA裂解粗提液为模板,扩增目的DNA片段阳性率可达100%;获得序列分析验证。结论　改进的蛋白酶K裂解液一步洗脱消化法操作简单、过程快捷、费用低廉,能快速有效地分离石蜡组织切片DNA,用于后续PCR扩增检测,具有较高效率。     

DNA检测中琼脂糖凝胶重复使用效果

目的：摸索在DNA检测中琼脂糖凝胶多次重复使用的效果。方法：按常规制备琼脂糖凝胶,胶不离框,上样、电泳,电泳后胶连框一起放于饭盒内,盖好盒盖,于4℃冰箱保存。下次使用时保证电泳方向与前次相反,即把胶调转方向加样、电泳。结果：重复使用6~7次,DNA条带仍清晰可见。结论：这是一种简便易行、效率高、节省实验经费并易于推广的好方法。     

连翘干燥叶片高质量DNA的提取方法研究

目的：探讨不同DNA提取方法对连翘干燥叶片的DNA质量及RAPD—PCR标记结果的影响,找出提取连翘总DNA的最佳方法。方法：分别用常规CTAB法、高盐低pH法和改良CTAB法提取连翘总DNA．分别进行琼脂糖凝胶电泳、紫外吸收A260／A280和RAPD—PCR分析,通过比较找出提取连翘总DNA的最佳方法。结果：以CTAB法为基础的改良CTAB法可获得较高质量的DNA进行PCR扩增。结论：改良CTAB法是一种分离高质量完整DNA的简便、快速方法。     

用PCR扩增16Sr RNA基因鉴定幽门螺杆菌的细胞壁缺陷型

目的：探讨幽门螺杆菌及其稳定L型的检测与鉴定方法。方法：用抗生素诱导、滤菌器过滤、非高渗透压培养基培养获得幽门螺杆菌稳定L型纯培养物,对幽门螺杆菌及其稳定L型进行16SrRNA基因的PCR扩增及序列测定。结果：幽门螺杆菌及其稳定L型的16SrRNA基因PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳,在紫外检测仪下可见550 bp的DNA条带,测序结果经NCB I B last分析比对,基因同源性可达100%。结论：16SrRNA基因PCR检测可用于幽门螺杆菌L型及其他形态变异的菌种鉴定。     

应用PCR方法快速鉴定SPF金定鸭性别

目的 利用PCR方法鉴定SPF金定鸭的性别.方法 根据已有报道合成一对禽类性染色体上的染色质解螺旋蛋白DNA结合蛋白1(CHD1)基因的通用引物gCHD.采集培育中的85只SPF金定鸭血液样品,提取血液基因组DNA,进行PCR扩增.通过分析PCR扩增产物凝胶电泳后的条带数判定禽类性别.结果 PCR扩增产物经琼脂糖电泳分析后,雌性鸭样品扩增出CHD 1-Z和CHD1-W,而雄性鸭样品只出现CHD1-Z.结论 本文建立的方法可作为禽类性别的有效鉴定方法.     

改进的PCR模板制备及DNA回收方法

直接用煮沸的细菌裂解液中的ＤＮＡ作ＰＣＲ模板，扩增效果与用酚／氯仿抽提纯化的质粒ＤＮＡ作模板的结果一致，缩短了实验时间。利用简单材料回收酶切片段，省去了有机溶剂反复抽提和沉淀的步骤，回收率达到９０％，效果很好。     

一种简单、稳定、可靠的屏氧酶1基因多态性分析法

目的：建立一种简单、稳定、可靠的PON1基因多态性分析法。方法：取外周静脉血100μl，用ROSE法提取基因组DNA，用两对引物：P192F 5′-TAT TGT TGC TGT GGG ACC TGA G-3′,P192R 5′-CAC GCT AAA CCC AAA TAC ATC TC-3′；P55F 5′-GAA GAG TGA TGT ATA GCC CCA G-3′,P55R 5′-TTT AAT CCA GAG CTA ATG AAA GCC-3分别进行PCR扩增，用限制性内切酶AlwI,NlaⅢ对两种PCR产物分别进行酶切，3％琼脂糖凝胶电泳。结果：扩增的两个PCR产物在192、55多态性位点大小分别为99bp、170bp。Alw I酶切后，凝胶电脉得到完全酶切（66bp,33bp)，部分酶切（99bp、66bp、33bp)，未被酶切（99bp)三种类型DNA片段（RR，QR，QQ基因型）；NlaⅢ酶切后，凝胶电脉得到部分酶切（170bp,126bp,44bp)，未被酶切（170bp)两种类型DNA片段（LM，LL基因型）。经双盲重复检测，结果一致。应用此方法对胃癌患者血样标本检测，发现其PON1基因多态性在192位点频率较高。结论：采用一步PCR－RFLP技术可以建立简单、稳定、可靠的PON1基因多态性分析法。     

经典酚/氯仿抽提法和纯化试剂盒法提取全血基因组DNA的比较

目的 比较经典酚/氯仿法和纯化试剂盒法抽提全血基因组DNA的差异.方法 分别对两种方法抽提的全血DNA产物进行紫外分光光度仪、琼脂糖凝胶电泳和体外聚合酶链锁反应（PCR）扩增.结果 两种方法DNA的提取效率相似,TaKaBa试剂盒法提取的纯度[光密度（OD）260nm/280nm]较常规酚/氯仿法明显提高.结论 TaKaBa试剂盒法较传统酚/氯仿提取基因组DNA法快速、简便、经济,可用于PCR模板DNA的制备.     

CYP2A6基因多态性的一步PCR-RFLP分析法

目的：建立CYP2A6基因多态性的一步PCR－RFLP分析法。方法：取外周静脉血100μl，用Rose法提取基因组DNA，用特异性引物CYP2A6F03：5′-CTG ATC GAC TAG GCG TGG TA-3′,cyp2a6r06:5′-CGT CCT GGG TGT TTT CCT TC-3′进行一步PCR扩增，用限制性内切酶Dde I,XcmI对PCR产物进行酶切，3％琼脂糖凝胶电泳。结果：扩增的PCR产物大小为214bp，部分血样标本未获得PCR扩增产物，判为CYP2A6缺失基因型（CYP2A6 del/CYP2A6del)。DdeI酶切后，凝胶电泳可得到部分酶切（CYP2A6wt/CYP2A6v2基因型），未被酶切（CYP2A6wt/CYP2A6wt基因型）两种类型DNA片段；XcmI酶切后，凝胶电泳可得到部分酶切（CYP2A6wt/CYP2A6vl/CYP2A6wt基因型），未被酶切（CYP2A6wt/CYP2A6wt基因型）两种类型DNA片段。其中，部分血样标本同时被DdeI和XcmI部分酶切（CYP2A6v2/CYP2A6vl基因型）。应用此方法检测，发现中国人群胃癌患者存在CYP2A6等位基因多态性。经双盲重复检测，上述结果一致。结论：采用一步PCR－RFLP技术可以建立简单、稳定、特异的CYP2A6基因多态性分析法。     

Alu-PCR检测人肝癌细胞株PLC/PRF/5基因组中乙型肝炎病毒DNA的整合

目的 应用Alu-PCR方法检测人肝癌细胞株PLC/PRF/5 基因组中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的整合。 方法 提取经培养扩增的人肝癌细胞株PLC/PRF/5 基因组DNA,根据Alu-PCR方法经过3轮PCR反应扩增潜在的HBV DNA和人基因组DNA整合片段。琼脂糖凝胶电泳观察PCR 扩增产物片段,切取并纯化整合阳性的电泳条带,对纯化产物进行核酸测序,得到整合片段的核苷酸序列。 结果 经琼脂糖凝胶电泳检测,用Alu-PCR方法能够从PLC/PRF/5 细胞株中扩增得到4条HBV DNA整合序列,经测序后与比对其中3条整合序列能够定位于人染色体03p21.31、05p15.33、12q13.12~q14.1。 结论 Alu-PCR可以准确测定肝细胞中HBV DNA的整合,为研究HBV DNA在肝细胞中的整合研究提供了一个简单、经济的方法。