S-3(-三氟甲基)-6，7-双[4(-三氟甲基)苯基]-3，4-二氢喹啉-2(1H)-酮下调STAT3信号通路抑制人结直肠癌细胞生长的作用研究

目的 基于信号转导和转录活化因子3（STAT3）信号通路探讨三氟甲基化二氢喹喔啉酮类化合物S-3-（三氟甲基）-6,7-双［4-（三氟甲基）苯基］-3,4-二氢喹啉-2（1H）-酮（2o）对人结直肠癌细胞生长的抑制作用。方法 采用 MTT法检测三氟甲基化二氢喹喔啉酮类化合物 2b、2e、2f、2g、2k、2l、2m、2o、2q（20 μmo·L^-1）作 用 48 h 对 人 结 直 肠 癌 细 胞DLD-1 存活率的影响,检测化合物2o（0.5、1.0、2.0、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 μmo·L^-1）作用48 h对人结直肠癌细胞HCT116、RKO和DLD-1存活率的影响;克隆形成实验检测化合物2o（2.5、5.0、10.0 μmo·L^-1）对RKO、DLD-1、HCT116细胞增殖的影响;流式细胞术和 Hoechst染色检测化合物 2o 对细胞凋亡的影响;细胞划痕实验检测化合物 2o 对 DLD-1 和RKO 细胞迁移率的影响;Western blotting 法检测化合物 2o 对 RKO 细胞 p-STAT3、STAT3、骨髓白血病细胞分化蛋白（MCL）-1、生存素（Survivin）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白表达水平的影响,检测化合物2o对白细胞介素-6（IL-6）刺激下p-STAT3、STAT3蛋白表达水平的影响。结果 化合物2o对DLD-1细胞的杀伤能力较其他化 合 物 强 ; 化 合 物 2o 对 HCT116、 RKO 和 DLD-1 细 胞 的 半 数 抑 制 浓 度 （IC₅₀） 分 别 为 （3.573±0.172）、（8.056±0.458）、（6.226±0.458）μmo·L^-1。与对照组比较,化合物2o明显降低了HCT116、RKO和DLD-1细胞的集落形成能力;显著降低DLD-1和RKO细胞迁移率（P＜0.01、0.001）;明显增加RKO、DLD-1细胞凋亡率;明显增加HCT116和RKO细胞核亮染比例;明显降低p-STAT3、MCL-1、Survivin、Bcl-2蛋白表达,明显升高Bax蛋白表达,对STAT3蛋白表达无明显影响。与对照组比较,IL-6刺激的模型组p-STAT3蛋白表达明显升高,STAT3蛋白表达无明显变化;与模型组比较,随着化合物2o浓度的升高,p-STAT3蛋白表达明显降低,STAT3蛋白表达无明显变化。结论 化合物2o可能通过下调STAT3信号通路发挥抗人结直肠癌作用。     

基于结肠癌HCT116细胞三维培养模型的灵芝水提物抗肿瘤活性研究

目的 采用结肠癌HCT116细胞的二维（2D）和三维（3D）培养模型研究灵芝水提物（Ganoderma lucidum water extract，GLWE）的抗肿瘤作用。方法 采用紫外-可见光分光光度法测定GLWE中灵芝多糖（Ganoderma lucidum polysaccharides，GLP）、三萜和甾醇的含量，HPLC分析GLP中水溶性单糖的组成和比例；以Matrigel基质胶为基质材料建立体外HCT116细胞3D培养模型，评价GLWE的抗肿瘤及辅助抗肿瘤活性；CCK-8法检测细胞活力；Real-time PCR检测细胞mRNA表达水平；Western blotting检测细胞蛋白表达水平。结果 GLWE中GLP和三萜及甾醇的含量分别为20.92%和7.18%，其中GLP主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、D-木糖、L-岩藻糖组成；GLWE和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）作用48 h可呈浓度依赖性抑制2D和3D培养的HCT116细胞增殖；与2D培养相比，3D培养的HCT116细胞中整合素β1（Integrin β1）和钙黏蛋白（E-cadherin）mRNA的表达显著升高，并对GLWE和5-FU的敏感性降低；在HCT116细胞3D培养模型中，GLWE既可降低CDK2、CDK4和Bcl-2蛋白的表达，升高p21、p27、cleaved caspase-3和cleaved PARP蛋白的表达，还可显著降低Integrin β1和E-cadherin mRNA的表达，并加强5-FU的抗肿瘤活性。结论 GLWE通过抑制细胞周期和诱导细胞凋亡而抑制3D培养的HCT116细胞增殖，并通过抑制Integrin β1和E-cadherin mRNA的表达增强5-FU的抗肿瘤活性。     

西红花苷抑制NFATc3活性促进与肿瘤成纤维细胞共培养的结直肠癌细胞放射敏感性

目的 探究西红花苷对与肿瘤成纤维细胞（CAFs）共培养的结直肠癌细胞放射敏感性的影响,并探究分子机制。方法 通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和蛋白质免疫印记（Western blotting）比较人正常结肠上皮细胞NCM460和结直肠癌细胞系SW480、SW620、HCT116、LOVO中活化T细胞核因子c3（NFATc3）表达差异。建立CAFs与HCT116细胞共培养体系,西红花苷处理细胞后经不同剂量（0、2、4、6、8 Gy）X射线照射,细胞克隆形成实验分析细胞存活分数（SF）。再将HCT116细胞分为对照组、6 Gy组、CAFs/HCT116＋6 Gy组、CAFs/HCT116＋西红花苷＋6 Gy组,进行对应处理后,MTT法检测各处理组HCT116细胞活性,流式细胞术检测各处理组HCT116细胞凋亡率,Hoechst 33258染色观察各处理组HCT116细胞凋亡形态,qRT-PCR和Western blotting测定各处理组HCT116细胞中NFATc3表达水平。结果 相较于人正常结肠上皮细胞NCM460,人结直肠癌细胞系SW480、SW620、HCT116、LOVO中的NFATc3 mRNA和蛋白相对表达量均显著上调（P＜0.05）。与HCT116细胞比较,与CAFs共培养的HCT116细胞经辐射后的SF显著增高（P＜0.05）;与CAFs共培养的HCT116细胞比较,与CAFs共培养的HCT116细胞经西红花苷处理再进行辐射的SF显著降低（P＜0.05）。与6 Gy组比较,CAFs/HCT116＋6 Gy组HCT116细胞存活率显著升高（P＜0.05）,细胞凋亡率显著下降（P＜0.05）,细胞内染色也较为均匀,未见致密浓染的凋亡状细胞,细胞中NFATc3 mRNA和蛋白相对表达量均显著上调（P＜0.05）;而与CAFs/HCT116＋6 Gy组比较,CAFs/HCT116＋西红花苷＋6 Gy组HCT116细胞存活率显著降低（P＜0.05）,细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）,细胞中有较多致密浓染、碎裂荧光块,同时,细胞中NFATc3 mRNA和蛋白相对表达量显著下调（P＜0.05）。结论 西红花苷能够明显提高与CAFs共培养的结直肠癌HCT116细胞的放射敏感性,从而促进细胞发生凋亡,该作用可能与抑制NFATc3有关。     

吉马酮通过HBXIP/p53信号通路诱导A549、CNE-1、HepG2细胞凋亡

目的 研究吉马酮诱导肺癌 A549、 鼻咽癌 CNE-1、 肝癌 HepG2 细胞凋亡的机制 。 方法 50、 150、 200、250、300 μmol·L^-1的吉马酮处理肝癌 HepG2、肺癌 A549、鼻咽癌 CNE-1、结肠癌 Caco-2 细胞 24、48、72 h 后,MTT 实验检测细胞的存活率的变化。100、150、200 μmol·L^-1的吉马酮分别处理 A549、HepG2、CNE-1细胞 48 h后采用流式细胞术检测细胞凋亡的变化;Western blotting 实验检测细胞凋亡标志蛋白 cleaved-Caspase-3、Caspase-3 的变化,检测乙型肝炎 X相互作用蛋白（HBXIP）、p53蛋白的表达量变化。分别在 A549、HepG2、CNE-1细胞中应用 siRNA 敲低 HBXIP,Westernblotting实验检测 HBXIP的敲低效果及 p53蛋白表达变化;MTT实验检测敲低 HBXIP对吉马酮诱导的细胞增殖抑制作用的影响。结果 吉马酮对鼻咽癌CNE-1、肝癌HepG2细胞增殖抑制作用较强,与溶剂对照组比较,200、250、300 μmol·L^-1组细胞存活率显著下降（P＜0.05）;在高浓度时对肺癌A549细胞增殖抑制效果较强,与溶剂对照组比较,250、300 μmol·L^-1组细胞存活率显著下降（P＜0.05）;对结肠癌Caco-2细胞作用相对较弱。与对照组比较,100、150、200 μmol·L^-1吉马酮处理A549、HepG2、CNE-1细胞 48 h后,凋亡率显著升高（P＜0.05）,cleaved-Caspase-3、p53蛋白表达显著上升（P＜0.05）;以 150、200 μmol·L^-1吉马酮处理A549、HepG2、CNE-1细胞48 h后,HBXIP的蛋白表达显著降低（P＜0.05）。siRNA-HBXIP处理48 h后,与对照组比较,HBXIP的蛋白表达量显著下降（P＜0.05）,p53蛋白表达量显著上升（P＜0.05）。与单独使用的相同浓度的吉马酮相比,沉默HBXIP后A549、HepG2、CNE-1细胞对吉马酮的敏感度明显提高,150、200、250 μmol·L^-1组均差异显著（P＜0.05）。结论 吉马酮可以抑制A549、HepG2、CNE-1细胞增殖、诱导细胞凋亡,作用机制可能与调控HBXIP/p53信号通路相关。     

万古霉素诱导人肾小管上皮细胞损伤及其Smad4表达的研究

目的 研究万古霉素诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）损伤及其Smad同源物4（Smad4）表达，并探讨其潜在的作用机制。方法 使用不同终浓度（0、1、2、3、4、5 mmol/L）的万古霉素溶液作用于HK-2细胞24 h，显微镜下观察万古霉素对细胞形态的影响；蛋白质免疫印迹法检测Smad4、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（Bax）、Bcl-2的蛋白水平；TUNEL法检测HK-2细胞凋亡情况；CCK8法检测HK-2细胞活力来研究万古霉素对肾脏的毒性作用。构建Smad4过表达质粒，通过CCK8法和TUNEL实验检测Smad4过表达对万古霉素诱导的HK-2细胞损伤的影响。结果 与对照组比较，随着万古霉素浓度升高，HK-2细胞逐渐变形，数量逐渐减少；细胞活力显著降低，凋亡率显著增加（P＜0.05、0.01）。与对照组比较，促凋亡蛋白Bax表达显著增高，而抗凋亡蛋白Smad4、Bcl-2表达则显著降低（P＜0.05、0.01、0.001）。过表达Smad4后，使万古霉素诱导的HK-2的细胞活力显著增加，凋亡率显著降低（P＜0.05、0.001）。结论 万古霉素能够诱导人肾小管上皮细胞损伤，其作用机制可能与调控Smad4的蛋白降解密切相关。     

绞股蓝次级皂苷H诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用研究

目的 探讨绞股蓝次级皂苷H （Gypensapogenin H,GH）对人乳腺癌MCF-7细胞的诱导凋亡作用。方法 采用5、10、20、40、60、80 μmol/L的GH处理人乳腺癌MCF-7细胞48 h后,MTT法测定GH对细胞增殖的影响;20 μmol/L的GH作用细胞24 h后,相差显微镜下观察细胞的形态学变化,DAPI染色,荧光显微镜下观察凋亡小体的形成;GH作用细胞6、12、24 h后,流式细胞仪测定细胞凋亡率;免疫印迹法检测GH对Bcl-2、Bax、Cytochrome C、Caspase 3等蛋白表达的影响。结果 GH抑制细胞增殖作用呈明显的浓度相关性,半数抑制浓度（IC₅₀）为（8.67±1.22）μmol/L;GH组细胞形态与对照组比较发生显著变化,主要表现为细胞皱缩、染色质浓缩、细胞核变形;细胞经DAPI染色后在荧光显微镜下可观察到有凋亡小体形成;随GH作用时间延长,细胞凋亡率明显上升,与对照组比较,GH作用12、24 h细胞早期凋亡率显著升高（P<0.05、0.01）;蛋白免疫印迹显示,与对照组比较,GH作用6、24 h Bax,6、12、24 h Cleaved Caspase 3和Cytochrome C蛋白水平显著增加（P<0.05、0.01）;6、12、24 h Bcl-2和12、24 h Caspase 3蛋白表达量显著减少（P<0.05、0.01）。结论 GH通过线粒体通路诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡。     

注射用益气复脉(冻干)对阿霉素诱导H9c2(2-1)心肌细胞毒性的保护作用

目的 探讨注射用益气复脉（冻干,YQFM）对阿霉素（doxorubicin,DOX）诱导H9c2（2-1）心肌细胞毒性的保护作用。方法 H9c2（2-1）心肌细胞随机分为对照组,模型组（终浓度为0.3 μmol/L的DOX处理细胞48 h）,YQFM低、中、高剂量（125、625、3 125 μg/mL）组（提前2 h加入药物预处理,然后加入终浓度为0.3 μmol/L的DOX处理48 h）,采用CCK-8法检测细胞活力;使用乳酸脱氢酶（LDH）和ATP试剂盒检测细胞LDH和ATP水平;应用Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡;JC-1法检测细胞线粒体膜电位;Western blotting法检测caspase-3蛋白的表达水平。结果 与模型组比较,YQFM中、高剂量组显著增加细胞存活率（P<0.05、0.01）,低、高剂量组明显改善细胞凋亡;低、中、高剂量组LDH活性显著降低（P<0.05、0.01）,ATP含量显著增加（P<0.05、0.01）,线粒体膜电位明显恢复。结论 YQFM抑制DOX诱导H9c2（2-1）的细胞毒性,其作用机制可能与抑制线粒体凋亡信号通路的激活有关。     

洋甘菊活性组分对LPS诱导人支气管上皮细胞的保护作用及机制研究

目的 基于驱动蛋白家族 3A 基因（Kif3a）和 Sonic hedgehog（SHH）信号通路探讨洋甘菊活性组分对脂多糖（LPS）诱导的人支气管上皮细胞（16HBE）的保护作用及机制。方法 用LPS诱导16HBE建立哮喘炎症细胞模型。CCK-8法检测不同浓度洋甘菊活性组分对LPS诱导16HBE的增殖的抑制作用，筛选出最佳洋甘菊活性组分给药浓度。将细胞分为空白对照组、LPS模型组、阳性药物组（1 µmol•L^-1地塞米松干预2 h）、洋甘菊活性组分组（200 µg•mL^-1，48 h）。Annexin V/PI结合流式细胞术检测各组的凋亡率。实时荧光PCR法和Western blot法检测Kif3a、SHH、Ptch1和Gli1的mRNA和蛋白表达变化。结果 LPS干预后，可显著降低16HBE活力（P < 0.05），并诱导其细胞凋亡（P < 0.01）。洋甘菊活性组分在浓度200 µg•mL^-1处理48 h时，可以显著逆转LPS对细胞的损伤并促进增殖（P < 0.01），减弱LPS诱导的细胞凋亡（P< 0.01）。与空白对照组比较，LPS诱导的16HBE内Kif3a在mRNA水平和蛋白表达水平显著降低（P < 0.05），SHH、Ptch1、Gli1在mRNA水平和蛋白表达水平显著升高（P < 0.05）；与LPS模型组相比较，洋甘菊活性组分处理后可显著逆转mRNA水平和蛋白表达（P< 0.05），增加Kif3a的mRNA水平和蛋白表达水平，并降低SHH、Ptch1、Gli1的mRNA水平和蛋白表达（P< 0.05）。结论 LPS诱导16HBE损伤，下调Kif3a水平从而上调SHH、Ptch1、Gli1水平，调控SHH信号通路处于异常激活状态。洋甘菊活性组分可显著逆转LPS诱导的细胞炎症损伤，上调Kif3a水平，下调SHH、Ptch1、Gli1水平，通过Kif3a调控SHH信号通路，对LPS诱导的16HBE发挥保护作用，改善哮喘气道炎症。     

甘草次酸对胃癌细胞SGC7901增殖、凋亡及PI3K-Akt-mTOR通路的影响

目的 探究甘草次酸对胃癌SGC7901细胞增殖、凋亡及PI3K-Akt-mTOR通路的影响。方法 体外培养胃癌SGC7901细胞,分为对照组和甘草次酸低、中、高浓度（12.5、25.0、50.0 μmol/L）组,药物处理24、48、72 h后,CCK-8法检测细胞增殖情况;药物处理48 h后,流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡情况;Western blotting检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3以及PI3K-Akt-mTOR信号通路中磷酸化PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平。结果 甘草次酸低、中、高浓度组胃癌SGC7901细胞增殖受到明显抑制,并呈时间和剂量相关性（P<0.05）。与对照组比较,甘草次酸低、中、高浓度组胃癌SGC7901细胞G₀/G₁期细胞比例显著降低（P<0.05）,G₂/M期细胞比例及凋亡率显著升高（P<0.05）,Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达水平显著升高（P<0.05）,Bcl-2、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。结论 甘草次酸可抑制胃癌SGC7901细胞增殖,促进其凋亡,其机制可能与抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路激活有关。     

RNAi沉默PCDGF基因对喉鳞癌Hep-2细胞生物学特性的影响

目的 研究RNAi沉默畸胎瘤细胞源性生长因子（PCDGF）表达对喉鳞癌Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法 RT-PCR检测喉鳞癌组织中PCDGF的mRNA表达水平;Hep-2细胞分为空白对照组、阴性对照组和PCDGF-siRNA组,Western blot检测转染效果及Bcl-2、Bax、E-cadherin和MUC1蛋白表达;CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Transwell 小室检测细胞侵袭能力。结果 喉鳞癌组织中的PCDGF mRNA表达水平显著高于声带息肉组织（t=6.88,P=0.005）。PCDGF在喉鳞癌组织中高表达。PCDGF-siRNA组喉鳞癌Hep-2细胞中PCDGF、Bcl-2、MUCI蛋白表达显著低于空白对照组（P<0.05）,Bax、E-cadherin蛋白表达显著高于空白对照组（P<0.05）,细胞增殖率显著低于空白对照组（P<0.05）,细胞侵袭数显著低与空白对照组（P<0.05）,细胞凋亡率显著高于空白对照组（P<0.05）。结论 抑制PCDGF的表达能够抑制喉鳞癌Hep-2细胞的增殖和侵袭能力,诱导细胞发生凋亡。     

基于结肠癌HCT116细胞三维培养模型的灵芝组分抗肿瘤活性研究

目的 基于结肠癌HCT116细胞的二维(2D)和三维(3D)培养模型研究灵芝组分(Ganoderma components,Gc)的抗肿瘤作用。方法 采用UPLC-Q-TOF-MS鉴定3种Gc的化学组成;以Matrigel基质胶为基质材料建立体外HCT116细胞3D培养模型,评价Gc1、Gc2、Gc3和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)对2D和3D培养的HCT116细胞增殖的影响,并在HCT116细胞3D培养模型中分析Gc3对周期、凋亡、耐药、脂代谢及5-FU抗肿瘤活性的影响;采用CCK-8法检测细胞活力;Real-time PCR检测细胞mRNA表达水平;Western blotting检测细胞蛋白表达水平;采用HPLC检测细胞内5-FU含量。结果 从Gc1、Gc2和Gc3中分别鉴定出76,69和17个化合物;与2D培养相比,3D培养的HCT116细胞增殖率更低,周期促进蛋白CDK2、CDK4、CDK6及脂肪酸合成蛋白FASN、SREBP1的表达显著下调,周期抑制蛋白p21和p27、脂滴分解蛋白ATGL及药物抵抗基因ITGB1、CDH1、ABCB1、ABCC1 m...     

重楼活性单体PP-22对人结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨重楼活性单体PP-22对人结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响及其联合5-氟尿嘧啶(5-FU)和洛铂的抗肿瘤效果。方法 采用噻唑蓝(MTT)法和克隆形成抑制实验观察不同浓度PP-22对人结肠癌SW620细胞增殖的抑制作用;分别观察PP-22联合5-FU和洛铂对人结肠癌SW620细胞增殖的抑制作用;碘化丙锭单染流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡水平;Western blot法检测PP-22作用后细胞凋亡相关蛋白的表达。结果 重楼单体PP-22能显著抑制SW620细胞的生长,作用呈剂量-效应关系;随着PP-22浓度的增加,细胞克隆形成逐渐减少,与细胞对照组和DMSO组相比有显著差异;PP-22联合不同浓度的5-FU和洛铂作用于SW620细胞48 h,可提高SW620细胞对5-FU和洛铂的敏感性;不同浓度PP-22作用于SW620细胞后,细胞周期阻滞于S期;PP-22作用后存在Caspase-3和Caspase-9蛋白的活化和降解,抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL减少,促凋亡蛋白Bax的表达增加。结论 PP-22能显著抑制人结肠癌SW620细胞增殖,诱导细胞凋亡,提高SW620细胞对5-FU和洛铂的敏感性。     

Anti-cancer effect of Cordyceps militaris in human colorectal carcinoma RKO cells via cell cycle arrest and mitochondrial apoptosis

Background

Cordyceps militaris has been used as a traditional medicine in Asian countries for a long time. Different types of Cordyceps extract were reported to have various pharmacological activities including an anti-cancer effect. We investigated the inhibitory effect of Cordyceps militaris ethanol extract on a human colorectal cancer-derived cell line, RKO.

Methods

RKO cells were treated with various concentrations of nucleosides-enriched ethanol extract of Cordyceps militaris for 48 h and cytotoxicity was measured using a CCK-8 assay. Then, xenograft Balb/c nude mice were injected with RKO cells and subsequently orally administered with ethanol extract of Cordyceps militaris every day for 3 weeks to examine the inhibitory effect on tumor growth. Lastly, the effect of Cordyceps militaris on cell cycle as well as apoptosis was measured using flow cytometry. Also, the expression of p53, caspase 9, cleaved caspase-3, cleaved PARP, Bim, Bax, Bak, and Bad were detected using western blot assay.

Results

RKO cells were highly susceptible to the ethanol extract of Cordyceps militaris (CME) and the growth of RKO cells-derived tumor was significantly delayed by the treatment of Cordyceps militaris. Cordyceps militaris induced cell cycle arrest in G2/M phase (untreated; 20.5 %, CME 100 μg/ml; 61.67 %, CME 300 μg/ml; 66.33 %) and increased early apoptosis (untreated; 1.01 %, CME 100 μg/ml; 8.48 %, CME 300 μg/ml; 18.07 %). The expression of p53, cleaved caspase 9, cleaved caspase-3, cleaved PARP, Bim, Bak, and Bad were upregulated by the treatment of Cordyceps militaris.

Conclusion

Ethanol extract of Cordyceps militaris was highly cytotoxic to human colorectal carcinoma RKO cells and inhibited the growth of tumor in xenograft model. The anti-tumor effect of Cordyceps militaris was associated with an induction of cell cycle arrest and mitochondrial-mediated apoptosis.     

缺失错配修复基因MLH1的结直肠癌HCT唱116细胞对氟尿嘧啶耐药机制的研究

目的 研究缺失错配修复基因MLH1（MutL homolog 1）的结直肠癌细胞HCT-116对氟尿嘧啶（5-Fu）耐药机制。方法 通过构建MLH1缺失的结直肠癌细胞HCT-116稳定表达MLH1细胞株,CCK-8试剂检测细胞恢复MLH1表达后对化疗药物5-Fu耐药性的影响,并通过流式细胞仪检测细胞表面干细胞标志CD133和分化标志CK20以及CK8的表达变化。结果 HCT-116稳定表达MLH1分子后,其对5-Fu作用的化疗耐受性降低,5-Fu处理后细胞的活率显著降低（P<0.01）;流式细胞仪检测结果显示CD133表达显著降低,并伴随细胞分化标志CK8和CK20表达上调。结论 结直肠癌细胞缺失错配修复基因MLH1引起5-Fu耐药性可能与其促进肿瘤干细胞样特性密切相关。     

MiR-19反义核酸与CD133+HT29细胞亚群对多柔比星敏感性关系的研究

目的 探讨miR-19反义核酸与CD133⁺HT29细胞亚群对多柔比星敏感性的关系并研究其机制。方法 用RT-qPCR方法检测miR-19在结直肠癌细胞中的表达水平。流式细胞术检测miR-19反义核酸和多柔比星对HT29细胞系的CD133⁺细胞亚群种群比例的影响。MTT法检测miR-19反义核酸对多柔比星杀伤CD133⁺HT29细胞亚群能力的影响。利用生物信息学及Western blot法验证miR-19是否调节CD133⁺HT29细胞亚群中PTEN的表达。运用Western blot、免疫共沉淀、流式细胞术研究miR-19反义核酸影响多柔比星疗效的信号通路。结果 结直肠癌细胞系的miR-19表达水平显著高于正常结直肠上皮细胞系,并且CD133⁺细胞中的miR-19表达水平显著高于常规结直肠癌细胞。多柔比星体外单独治疗能提高HT29细胞系中CD133⁺细胞亚群的比例,然而联用miR-19反义核酸后CD133⁺HT29细胞亚群的种群比例显著下降。MTT结果表明miR-19反义核酸可显著增强多柔比星对CD133⁺HT29细胞亚群的杀伤活性。Western blot实验表明miR-19的靶基因可能为PTEN。MiR-19反义核酸可显著抑制CD133⁺HT29细胞亚群PI3K、AKT和Bad的磷酸化,增强Bad与Bcl-2和Bcl-xl的结合,从而提高CD133⁺HT29细胞亚群对多柔比星依赖的凋亡信号的敏感性,促进caspase-9和caspase-3的活化。结论 MiR-19反义核酸通过PTEN/PI3K/AKT/Bad途径提高CD133⁺HT29细胞亚群对多柔比星的敏感性。     

SMS 201-995 enhances S-phase block induced by 5-fluorouracil in a human colorectal cancer cell line

The action of the somatostatin analog SMS-201.995 (SMS) was tested in monotherapy and in combined therapy with the cytotoxic agent 5-fluorouracil (5-FU) on cell cycle kinetics of the human colon cancer cell line WiDr, expressing a mutant p53 (mp53). The data, obtained by flow cytometric DNA analysis, showed that SMS at 0.2 microg/ml increased apoptosis, augmenting the proportion of cells with subdiploid DNA content by 65 and 48% after 3 and 6 h, respectively. In cultures lasting 24 and 36 h, it also decreased the percentages of cells in G0/G1 phase by 22.9 and 14.3%; whereas at a dose of 0.1 microg/ml, SMS decreased the percentage of cells in G2/M by 14.3%. In contrast to SMS, 5-FU (0.1 microg/ml) augmented the apoptosis at 12 h, and markedly increased the fraction of cells in S phase, increasing its value from 24 and 72 h by 108 and 234%, respectively, in comparison to the control. The most evident finding after the combination of SMS (0.2 microg/ml) and 5-FU (0.1 microg/ml) was a potentiation of 5-FU-induced S-phase block by a further 7.9, 12.9 and 42.1% at 24, 36 and 72 h, respectively. Treatment with 5-FU also upregulated HLA class I expression of the cancer cells. In this sense, SMS was less effective and when given in combination with 5-FU did not change the effects induced by 5-FU. The data emphasize that SMS exhibits pro-apoptotic and anti-proliferative effects, which in proper dose combinations might enhance the effects of 5-FU on human colorectal cancer cells expressing mp53.     

Nicotine increases survival in human colon cancer cells treated with chemotherapeutic drugs

Cigarette smoking is implicated in the development of colon cancer. Furthermore, nicotine increases cell proliferation and inhibits apoptosis through α₇-nicotinic acetylcholine receptor (α₇-nAChR) activation in human colon carcinoma cells. An open issue is whether nicotine interfere with colorectal cancer pharmacological treatment, by inhibiting drug-mediated apoptosis. To assess this hypothesis, we evaluated nicotine effect on Caco-2 and HCT-8 colon cancer cells, treated with 5-Fluorouracil (5-FU) and Camptothecin (CPT), chemotherapeutics commonly utilized as adjuvant treatment of colon cancer. Nicotine decreased anti-proliferative and pro-apoptotic effects exerted by chemotherapeutics on both cell lines. These effects partially reverted by exposure to α-bungarotoxin (α-BTX), an inhibitor of α₇-nAChR. Nicotine addition to Caco-2 and HCT-8, treated with 5-FU or CPT, decreased the cleavage of substrate of caspase 3 and 7, poly-ADP-ribose polymerase (PARP). Moreover, P-ERK/ERK ratio was modified by nicotine addition to 5-FU and CPT treated cells in an opposite manner. However, when co-administrating PD98059, an ERK phosphorylation inhibitor, an increased apoptosis was observed. In Caco-2 and HCT-8 nicotine reverted 5-FU and CPT apoptotic effects through AKT phosphorylation, as demonstrated by apoptotic increase in presence of LY294002, an AKT phosphorylation inhibitor. Nicotine interfered with colorectal cancer pharmacological treatment in vitro by inhibiting apoptosis induced by chemotherapeutic drugs. Nicotine anti-apoptotic effects were exerted through ERK and AKT pathway activation.     

WBSCR22基因调控人恶性肿瘤细胞铁死亡的研究

目的 研究WBSCR22是否参与调控细胞铁死亡。方法 设计合成靶向人WBSCR22基因的siRNA (siWBSCR22),瞬时转染敲低WBSCR22 mRNA;RT-qPCR、Western blotting分别检测WBSCR22 mRNA、蛋白表达水平;铁死亡诱导剂Erastin、RSL3单独或联合抗氧化剂NAC、坏死抑制剂NSA、凋亡抑制剂ZVAD-FMK、自噬抑制剂3-MA作用于人结直肠癌细胞系HCT116和RKO、人肺癌细胞系H460、人肝癌细胞系SMMC7721,CCK8法检测细胞死亡率;丙二醛法、菲罗嗪法分别检测细胞脂质过氧化水平、Fe²⁺浓度。结果 siWBSCR22瞬时转染显著降低WBSCR22 mRNA及蛋白水平;WBSCR22敲低显著促进Erastin、RSL3诱导的HCT116、RKO、H460、SMMC7721细胞铁死亡;加入NAC后显著降低Erastin、RSL3诱导的WBSCR22敲低细胞铁死亡,而加入NSA、ZVAD-FMK、3-MA对Erastin、RSL3诱导的WBSCR22敲低细胞铁死亡无影响;Erastin、RSL3诱导后细...     

Efficient induction of apoptosis by ONYX-015 adenovirus in human colon cancer cell lines regardless of p53 status

The ONYX-015 virus is a mutated adenovirus that in theory selectively replicates and induces cytolysis in tumor cells lacking functional p53. The present study investigated whether ONYX-015 viral infection alone or in combination with conventional chemotherapeutic agents could significantly increase apoptosis in human colon cancer cell lines, regardless of p53 status, compared to untreated cells. A pair of colon cancer cell lines that differ only in their p53 status (RKO with wild-type p53 and RKOp53 with deficient p53) was tested. Two chemotherapeutic agents, 5-fluorouracil (5-FU) and CPT-11, were tested in combination with ONYX-015. Final concentrations of these agents corresponded to peak plasma levels achievable in patients. ONYX-015 concentration was 10 p.f.u./cell. In RKO and RKOp53 cell lines, ONYX-015 viral infection alone or in combination with 5-FU or CPT-11 induced a significant increase in apoptosis compared to chemotherapeutic agents alone, regardless of p53 status. Moreover, the combination of ONYX-015 and chemotherapeutics induced more apoptosis than chemotherapeutics alone in the two colon cancer cell lines independently of their p53 status. We conclude that ONYX-015 virus infection alone or in combination with 5-FU or CPT-11 induced apoptosis in human colon cancer cell lines, independently of p53 status.     

维生素E琥珀酸酯联合5-氟尿嘧啶抗人肝癌细胞增殖作用的研究

目的观察维生素E琥珀酸酯(VES)联合5-氟尿嘧啶(5-FU)抗人肝癌细胞SMMC-7721的增殖作用。方法体外培养的SMMC-7721细胞以VES联合5-FU分别作用24和48h,MTT法测定细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪分析细胞周期、凋亡率以及Fas的表达。结果MTT检测显示,VES6μg/mL作用细胞24h后抑制率为(2.78±0.05)%,随药物浓度的增加和作用时间的延长,抑制率显著增加(P<0.01);相同条件下,VES与5-FU合用较两药单用抑制作用显著增加(P<0.01)。流式细胞仪分析显示,SMMC-7721细胞自然凋亡率为(0.86±0.20)%,VES24μg/mL,5-FU30μg/mL及两者合用作用细胞24h后凋亡率分别为(30.08±2.32)%,(18.23±1.58)%和(63.68±2.88)%(P<0.01),细胞表面Fas表达增加。结论VES联合5-FU通过阻滞细胞周期于G0/G1期、促进细胞表面Fas的表达协同抑制肝癌细胞增殖。