秦皮乙素对BALB/c裸鼠体内胶质瘤生长的影响

摘 要: 【目的】 探讨秦皮乙素(Esc)的体内抗胶质瘤活性,为秦皮乙素进一步研究开发为抗胶质瘤药物提供实验依据?【方法】 采用C6细胞前肢腋下皮下注射BALB/c裸鼠种瘤构建荷瘤鼠模型;分为4组:模型组?50 mg/kg秦皮乙素组?100 mg/kg秦皮乙素组和阳性对照组;采用瘤体积?相对肿瘤增殖率?瘤质量?肿瘤生长抑制率和体质量5个指标评价秦皮乙素的体内抑瘤效果;采用HE染色鉴定瘤体?【结果】 与模型组相比,秦皮乙素可显著抑制雄性荷瘤鼠的瘤体积约10倍,瘤质量约8倍,对其体质量无显著影响,与阳性对照药尼莫司汀(ACNU)相似;对雌性荷瘤鼠瘤体的生长无显著抑制作用?【结论】 秦皮乙素在雄性荷瘤鼠体内具有显著抗胶质瘤活性,为秦皮乙素进一步开发为抗胶质瘤药物提供了实验依据?     

胶质瘤U251干细胞的培养、分离以及体内成瘤的实验研究

目的 以U 251为研究对象探索恶性胶质瘤的新治疗方案,培养恶性胶质瘤干细胞并同时建立肿瘤模型,为下一步体内靶向治疗奠定肿瘤模型基础.方法 培养普通的U251细胞,并在无血清的条件下加入EGF、bFGF、LIF、B27因子,培养获得U251干细胞;分别制备浓度为3.5×107/mL的U251和U251干细胞悬液,并分别种植于BALB/c Nude小鼠左右臀部皮下,观察并测量荷瘤体积.结果 通过以上方法培养,获得U251干细胞:在相同浓度的条件下,干细胞移植组荷瘤生长速度明显比普通的恶性胶质瘤快,并且荷瘤体积明显大于普通的U251细胞组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 U251恶性胶质瘤干细胞比普通U251胶质瘤细胞更具有高生长率、高侵袭性、和高表达CD133抗原;应用U251恶性胶质瘤干细胞建立肿瘤模型更优于普通U251胶质瘤细胞.     

神经细胞粘附分子对人恶性脑胶质瘤细胞株体内外增殖能力的影响

目的：探讨神经细胞粘附分子（neural cell adhesion molecule,NCAM)对人脑胶细胞株U251MG增殖行为的影响。方法：将外源性NACM－140质粒转入U251MG细胞株,采用流式细胞仪及培养细胞增殖动力学方法比较转染前后细胞的细胞周期、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达及群体增殖速度;在裸鼠颅内原位接种上述细胞,观察成瘤率及肿瘤大小。结果：NCAM转染后细胞的体外增殖速度减慢（P＜0．05）,S期细胞减少,PCNA表达率下降;裸鼠颅内接种的成瘤率显降低（P＜0．01）,肿瘤体积明显较小。结论：转染外源性NCAM在体外、体内均可抑制人脑胶质瘤细胞株U251MG的增殖。     

反义PCNA基因片断抑制胶质瘤U251细胞增殖

目的 研究反义PCNA基因片断对胶质瘤细胞株U251的细胞增殖的抑制作用。方法 用脂质体介导寡核苷酸转染培养的U251胶质瘤细胞，以MTT法检测细胞增殖活性，RT-PCR、原位杂交和免疫组织化学方法分别检测相关基因和蛋白的表达，通过流式细胞仪检测细胞周期和TUNEL法检测细胞凋亡。结果 不同浓度的反义寡核苷酸对肿瘤细胞的增殖活性均有抑制作用，且有一定的剂量依赖性。PCNA反义寡核苷酸能够诱导胶质瘤细胞凋亡，且与反义寡核苷酸浓度和作用时间有关。结论 反义PCNA寡核苷酸片断能有效地抑制胶质瘤细胞的体外增殖，且能够诱导胶质瘤细胞的凋亡。     

I粒子植入对大鼠脑内胶质瘤细胞增殖的抑制作用

目的：探讨 ¹²⁵I治疗人脑胶质瘤的可行性及其机制。方法：体外培养人胶质瘤细胞（SHG-44），采用MTT法检测 ¹²⁵I粒子对 SHG-44细胞增殖抑制的影响;采用立体定向的方法建立大鼠脑内人胶质瘤模型，接种1周后经MRI检测脑内形成实体瘤。将建模成功大鼠随机分成实验组(n=30)与对照组(n=10)。实验组大鼠在当天肿瘤区域植入 ¹²⁵I粒子1粒，植入粒子1周后复查MRI，2周后处死大鼠，取对照组、实验组肿瘤周边组织及肿瘤组织做增殖细胞核抗原（PCNA）免疫组化检测。结果：MTT法检测SHG-44细胞经¹²⁵I粒子照射后，增殖受到明显抑制，接种1周后脑内形成实体瘤；¹²⁵I可抑制肿瘤细胞生长，延长荷瘤鼠生存期，PCNA基因表达受抑制。结论：¹²⁵I抑制体外培养的SHG-44细胞生长和颅内接种的脑胶质瘤生长的作用机制可能与抑制PCNA基因表达有关。     

Livin siRNA重组腺病毒对胶质瘤U251细胞的增殖、凋亡的作用研究

目的通过小分子干扰RNA(siRNA)沉默livin的表达,探讨其对胶质瘤U251细胞增殖及凋亡的影响。方法制备livin siRNA重组腺病毒后感染U251细胞,采用RT-PCR、蛋白质印迹法检测livin基因的干扰效果,用MTT法和流式细胞术检测U251细胞的增殖和凋亡情况。同时观察重组腺病毒对荷瘤小鼠的治疗效应。结果重组腺病毒Ad-livin siRNA能有效抑制U251细胞的livin mRNA和蛋白水平的表达;抑制U251细胞增殖,促进凋亡;在小鼠体内有效抑制U251细胞的生长和提高荷瘤小鼠的平均生存期（P<0.05）。结论用livin siRNA重组腺病毒介导抑制livin基因的表达,可抑制U251细胞增殖,促进凋亡,为胶质瘤的治疗提供了新策略。     

HOXA4调控Wnt/β-cateni n信号通路对裸鼠移植胶质瘤的抑制作用

目的：建立人胶质瘤荷瘤裸鼠模型,探讨HOXA4对胶质瘤U251细胞体内生长的影响以及对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用及其机制。方法：采用慢病毒转染,建立胶质瘤U251细胞稳转同源异型盒基因A4（HOXA4） siRNA细胞系（si-HOXA4）和稳转空载体阴性对照U251细胞系（si-NC）。取对数生长期U251、si-NC和si-HOXA4细胞接种于BALB/c裸鼠颈背部皮下,建立荷瘤裸鼠模型,命名为对照组、si-NC组和si-HOXA4组。观察各组裸鼠成瘤情况并绘制肿瘤生长曲线;培养21 d处死裸鼠后剥离肿瘤组织,测量肿瘤体积和质量;qRT-PCR法检测各组裸鼠肿瘤组织中HOXA4、CTNNB1和Gsk3β mRNA相对表达量;免疫组织化学（IHC）法检测各组裸鼠肿瘤组织中HOXA4、β-catenin、Gsk3β、CyclinD1和P53蛋白表达水平。结果：si-HOXA4组裸鼠肿瘤体积和质量小于si-NC组和对照组（P<0.05）;si-HOXA4组裸鼠肿瘤组织中HOXA4 mRNA相对表达量和HOXA4蛋白表达水平低于其他2组（P<0.05）;与si-NC组和对照组比较,si-HOXA4组裸鼠肿瘤组织中CTNNB1 mRNA相对表达量降低（P<0.05）,β-catenin和CyclinD1蛋白表达水平亦降低（P<0.05）,但Gsk3β和P53蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。结论：抑制人胶质瘤U251细胞HOXA4表达可在体内通过Wnt/β-catenin信号通路调控CyclinD1和P53蛋白的表达,从而抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长。     

Genistein对胶质瘤细胞株U251MG作用的研究

目的探讨Genistein对胶质瘤细胞株U251MG的作用。方法采用光镜和倒置显微镜观察Genistein对胶质瘤细胞株U251MG生长的影响,并用流式细胞仪检测Genistein对U251MG细胞凋亡的影响。结果 Genistein在25μg/mL和50μg/mL作用48 h后,对U251MG细胞生长均有抑制作用,凋亡率均较对照组显著增加（P〈0.01）,并呈剂量依赖性。结论 Genistein既可以抑制U251MG细胞增殖,又可以诱导其凋亡。     

天然红心鸭蛋紫杉紫素对人胶质瘤细胞增殖、凋亡的干预作用

目的:研究天然红心鸭蛋紫杉紫素对人星形胶质瘤U251细胞增殖、凋亡的干预作用。方法:研究对象为U251人星形胶质瘤细胞系,细胞增殖采用MTT比色法检测,细胞凋亡采用荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术法检测,U251细胞浆中钙离子浓度采用LSCM测定。结果:天然红心鸭蛋紫杉紫素对胶质瘤细胞的生长具有明显的抑制作用,使用小剂量(0.25μmol·L-1)的紫杉紫素能有效地诱导胶质瘤细胞凋亡,并显著提高胶质瘤细胞内Ca2+浓度。结论:天然红心鸭蛋紫杉紫素可以显著抑制U251细胞增殖,且呈时间-效应和剂量-效应依赖关系,同时使U251细胞内Ca2+浓度升高,诱导U251细胞凋亡。     

脑干胶质瘤模型的建立及其MRI特征的观察

目的:观察3种脑干胶质瘤模型的MRI特征,探讨应用1.5 T MRI研究脑干胶质瘤模型的可行性.方法:将F98鼠胶质瘤细胞系种植于Fischer344大鼠脑干,U87MG和U251MG人胶质瘤细胞种植于裸小鼠脑干,1.5 T MRI观察脑干组织肿瘤生长情况,分析MRI影像检测的肿瘤体积与实际病理体积的相关性,以及肿瘤病理检测与MRI图像的依从性;观察3种模型下动物存活情况分析模型稳定性.结果:18只种植F98鼠胶质瘤细胞的大鼠形成脑干胶质瘤,成瘤率为94.7%(18/19);12只裸小鼠接种U87MG胶质瘤细胞后形成肿瘤,成瘤率为92.3%(12/13);3只裸小鼠接种U251MG后形成肿瘤,成瘤率为23.1%(3/13).图像融合分析发现肿瘤病理图像与MRI图像基本一致.大鼠肿瘤MRI检测体积(mm3)比病理肿瘤体积增加约14.7%(95.9±17.8 vs 81.8±20.5, P＜0.01),两者相关(r=0.631,P=0.005); U87MG裸鼠MRI肿瘤体积(mm3)比病理肿瘤体积增加约8.0%(9.49±0.91 vs 8.79±1.15, P=0.01),两者亦明显相关(r=0.526,P＜0.001).F98脑干胶质瘤模型大鼠生存期10～19 d,50%(9/18)大鼠在13～15 d死亡;U87MG脑干胶质瘤模型裸小鼠生存期21～41 d,75%(9/12)裸小鼠在24～31 d死亡.结论:F98鼠胶质瘤细胞系和U87MG人胶质瘤细胞可建立稳定的脑干胶质瘤模型,而U251MG人胶质瘤细胞不适合建立此模型;1.5 T MRI可用于观察脑胶质瘤模型肿瘤的生长.     

HIFU联合化疗对裸鼠皮下胶质瘤细胞凋亡及增殖的影响研究

目的:探讨高强度聚焦超声(High intensity focused ultrosound,HIFU)联合化疗对裸鼠皮下胶质瘤靶区周围细胞凋亡和增殖的影响.方法:建立人(U251)胶质瘤移植模型,随机分入3组,局部分别行单HIFU治疗、单盐酸尼莫司汀(Nimustine,ACNU)及HIFU联合ACNU治疗.治疗24 h后切取肿瘤组织,行HE染色观察组织病理变化,免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达和TUNEL法检测细胞凋亡.治疗7d后分别测量3组瘤块体积.结果:HIFU联合化疗组靶区周围组织凋亡细胞数较单HIFU组及单化疗组高(P＜0.01);而PCNA阳性细胞数较后两者降低(P＜0.01).联合治疗组肿瘤体积较单HIFU组及单化疗组缩小(P＜0.01).结论:HIFU治疗及化疗在胶质瘤的治疗中具有协同作用.HIFU联合化疗能明显提高HIFU治疗疗效,诱导靶区周围胶质瘤细胞凋亡并抑制其增殖发挥抗肿瘤作用,有利于胶质瘤的治疗.     

双氢青蒿素通过下调NICD-1抑制胶质瘤生长

目的 探讨双氢青蒿素(dihydroartemisinine,DHA)对人神经胶质瘤生长的影响及机制.方法 人胶质瘤U251细胞株传代培养,设置空白对照组、二甲基亚砜(DMSO)组、DAPT组和DHA(10、20、40、80 μmol/L)实验组,应用CCK-8和FCM检测细胞增殖、周期及凋亡,Western blot检测Notch1的胞内区域(NICD-1)及其下游靶蛋白Hes1的表达水平.建立裸鼠皮下胶质瘤模型(n=20),按随机数字表法分为DMSO组、DAPT组、DHA(50、100 mg/kg)治疗组,每组5只,根据时间体积曲线计算各组抑瘤率,免疫组化法检测裸鼠皮下移植瘤组织中NICD-1表达水平变化.结果 与空白对照组和DMSO组相比,实验组U251细胞增殖率显著下降,G1期细胞所占百分比显著上升,S期细胞所占百分比显著下降,早期凋亡率显著上升(P＜0.05),NICD-1及Hes1蛋白表达水平显著低于空白对照组(P＜0.05),均呈浓度依赖关系;DHA各治疗组的裸鼠皮下移植瘤生长速率及移植瘤组织内NICD-1表达显著低于DMSO对照组(P＜0.05).结论 DHA有效抑制人神经胶质瘤的生长,其作用机制可能与通过下调NICD-1表达抑制Notch信号通路有关.     

蛇毒激肽原酶对大鼠脑缺血再灌注的作用及机制

目的：探讨蛇毒激肽原酶对脑缺血再灌注大鼠的缺血区脑组织的保护作用及机制．方法：将实验动物随机分为假手术组、生理盐水对照组和治疗组．治疗组在大鼠脑缺血再灌注后8h,腹腔注射蛇毒激肽原酶17．5U／（kg·d）,连续注射3d．于术后第3日行神经功能缺失评分（NSS）,然后处死大鼠行梗死体积（TTC染色）的计算、缺血区的病理改变（HE染色）的检查以及缺血区神经细胞情况（尼氏染色）的检查,同时检测缺血区NSE,GFAP及vWF的免疫组化情况．结果：在大鼠脑缺血再灌注后8h,给予蛇毒激肽原酶治疗能明显降低大鼠的神经功能缺损,使大鼠的梗死体积变小,病理改变明显减轻,缺血区的尼氏染色结果得到明显的改善．治疗组脑缺血区的NSE,GFAP及vWF免疫组化的阳性细胞增多,与生理盐水对照组比较有明显差异（P〈0．05）．结论：蛇毒激肽原酶对脑缺血再灌注大鼠的缺血区脑组织有保护作用;促进缺血区神经细胞的再生以及神经胶质细胞、血管内皮细胞增生为其重要机制之一．     

抑制USP22表达对胶质瘤细胞顺铂耐药的影响

目的 探讨泛素特异性肽酶22（ubiquitin specific peptidase 22,USP22）对胶质瘤细胞顺铂耐药的作用。 方法 采用顺铂剂量梯度爬升筛选方法诱导顺铂耐药胶质瘤细胞株U251/CP2,转染USP22小干扰RNA沉默胶质瘤顺铂耐药细胞株U251/CP2中USP22的表达,RT-PCR检测细胞USP22 mRNA的表达水平,流式细胞术检测转染USP22-shRNA对细胞凋亡的影响,CCK-8法检测细胞的活力及耐药指数,Western blotting检测USP22的蛋白水平。 结果 成功构建了顺铂耐药胶质瘤细胞株U251/CP2、USP22基因沉默细胞株U251-shUPS22和U251/CP2-shUSP22。抑制USP22的表达可以明显提高U251/CP2-shUSP22细胞的凋亡率（P < 0.05）,顺铂上调USP22蛋白在U251和U251/CP2细胞中的表达（P < 0.01）。U251-shUPS22、U251/CP2和U251/CP2-shUSP22各组细胞的顺铂半数抑制浓度分别为（0.56±0.07）μg/mL、（73.73±2.74）μg/mL和（51.25±1.09）μg/mL,与对照U251组（1.23±0.13）μg/mL比较差异均有统计学意义（P < 0.01）。 结论 抑制USP22表达可增强胶质瘤细胞对顺铂的敏感性,且可在一定程度上逆转耐药细胞株的顺铂耐药,提示USP22是胶质瘤顺铂耐药的潜在分子机制之一。     

替莫唑胺缓释微球治疗胶质瘤皮下移植瘤的实验研究

目的观察替莫唑胺缓释微球（P-TMZ）对SHG-44人脑胶质瘤皮下移植瘤的抑瘤效应。方法将SHG-44胶质瘤细胞（1×107）注射于Balb/c裸小鼠右腋皮下,再将皮下移植瘤以组织块接种的方法皮下传代（2mm3/鼠）。待肿瘤生长至约65mm3时,将荷瘤鼠随机分为瘤内注射替莫唑胺缓释微球（P-TMZ）组、替莫唑胺（TMZ）组、P-TMZ＋TMZ联合用药组、卡莫斯汀（BCNU）组、空白微球（P-0）组和生理盐水（NS）组,每组10只鼠。将P-TMZ（500mg/kg）和P-0（500mg/kg）以DMEM培养液混悬至终体积150μl,经皮多点穿刺缓慢注入肿瘤组织内;TMZ以50mg/kg灌胃,每日一次,连续5d;BCNU以40mg/kg尾静脉注射一次;NS以150μl瘤内注入。每4d测量荷瘤鼠肿瘤大小直至治疗后28d。结果 P-TMZ、P-TMZ＋TMZ和BCNU组抑瘤率均明显高于P-0、NS组（P〈0.01）,且抑瘤效应优于TMZ组（P〈0.05）;TMZ组抑瘤率高于P-0、NS组（P〈0.05）。结论 P-TMZ保留了TMZ的抑瘤活性,在局部应用时抑瘤效果优于TMZ。     

裸鼠胶质瘤模型的建立及其病理

目的 建立裸鼠胶质瘤动物模型。方法 采用瘤细胞悬液接种法和瘤组织块接种法制作裸小鼠皮下移植瘤,并研究肿瘤的病理组织学特征。结果 两种方法所建肿瘤模型其成功率均为１００％,肿瘤生长状况良好,裸鼠无明显恶异质变化,肿瘤病理形态检查符合胶质瘤细胞的形态学特征,免疫组化证实体外培养的胶质瘤细胞和体内胶质瘤组织胶质纤维酸性蛋白均高表达。结论 该方法所建裸鼠皮下移植瘤模型能作为研究胶质瘤发病机制、生物学特性以     

放射性粒子125I对胶质瘤细胞治疗作用的实验研究

目的探讨放射性粒子125I在动物体内抗人脑胶质瘤的效果及其作用机制。方法建立人胶质瘤的动物模型,瘤内植入放射性粒子125I,观察肿瘤生长情况,在电镜下观察其超微结构的变化,采用TUNEL技术检测肿瘤组织的凋亡情况,流式细胞仪检测Bax/Bcl-2的表达,并应用免疫组化染色检测血管密度和VEGF、bFGF的表达。结果成功建立了人胶质瘤细胞U251的动物模型,植入放射性粒子125I后,胶质瘤生长较对照组明显受到抑制(P<0.05,P<0.01),电镜下可呈现核断裂、染色质边聚等细胞凋亡的形态特征。检测显示:和对照组相比,肿瘤组织的Bax/Bcl-2(1.88±0.47vs1.11±0.52,P<0.01)和组织凋亡率的IHS评分(3.64±0.89vs0.81±0.45,P<0.01)明显增高;肿瘤组织的微血管密度IHS评分(1.40±0.55vs3.23±0.87,P<0.01)、VEGF的IHS评分(1.58±0.55vs4.19±0.45,P<0.01)和bFGF的IHS评分(2.44±0.89vs3.52±0.79,P<0.05)明显降低。结论放射性粒子125I对在体人胶质瘤U251有明确的抑制作用,促进...     

人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植动物模型建立的实验研究

目的:探讨人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植动物模型建立的技术方法。方法:借助动物立体定向仪的引导,采用微注射方法将体外培养人脑胶质瘤细胞U87MG(悬浮于无血清RPMI1640培养液中,细胞数为108/ml)接种于裸鼠(BALB/c)额叶白质区。接种后观察不同实验鼠的生存情况,分别于接种后1h至63d的不同时间进行裸鼠脑肿瘤组织病理学检查和免疫组织化学分析。结果:裸鼠脑内注射体外培养的人脑胶质瘤细胞U87MG的合适速率为0.05μl/min=1μl/20min,细胞悬液体积1ul,细胞数105,注射时间20min。按此方案注射U87MG细胞无沿针道返流,恰好在尾状核区形成近圆球形肿瘤体,成瘤率高(100%),肿瘤颅内生长稳定,组织病理学检查符合人脑胶质瘤形态特征,未见脑外转移。结论:本研究的人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植动物模型建立方法精确可靠,重复性好,该模型可作为研究人脑胶质瘤发生、生物学特性以及治疗研究的可靠动物模型。