抗阴道毛滴虫AP33单克隆抗体的制备及其功能初探

目的 制备阴道毛滴虫（T.υ317株）黏附蛋白抗原（AP33）单克隆抗体并初步分析鉴定其功能。　方法　将制备和纯化的融合黏附蛋白33（rAP33）为抗原，免疫BALB/c小鼠，共免疫3次（抗原含量分别为100、50和100 μg），每次间隔2周，末次免疫后3 d取小鼠脾细胞及SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇（PEG1500）作用下进行细胞融合，筛选出高滴度分泌的McAb 杂交瘤细胞株，测定其免疫球蛋白亚类及其效价，蛋白质印迹（Western blotting）分析其特异性，间接免疫荧光实验（IFAT）进行定位，并初步探讨其体外对阴道毛滴虫黏附HeLa细胞的抑制作用。 结果 经筛选获得能稳定分泌抗AP33单克隆抗体的5株（4A2， 4F11， 4F8， 4E7和4H11）杂交瘤细胞株，经免疫球蛋白类型和亚型鉴定为IgG1; ELISA和Western blotting分析显示，5 株单抗均能与重组阴道毛滴虫AP33发生特异性结合；IFAT显示其中4株（4F11， 4F8， 4E7， 4H11）可识别培养的阴道毛滴虫，体外滴虫黏附抑制实验显示终浓度分别为200、200、400和200 μg/ml，该4株单抗体外对滴虫黏附HeLa细胞的抑制率分别为50.08%、65.03%、50.70%和49.08%。 结论 制备的抗重组AP33单克隆抗体，体外对阴道毛滴虫黏附有较好的抑制功能。     

重组阴道毛滴虫黏附蛋白33单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备重组阴道毛滴虫(T.υ)黏附蛋白33(AP33)单克隆抗体(McAb)并进行初步鉴定。方法将pET32(a)-AP33重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),用0.5 mmol/L IPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA法纯化,以纯化的融合蛋白33为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,免疫印迹分析其特异性。结果共筛选出能稳定分泌抗AP33单克隆抗体的5株(4A2,4F11,4F8,4E7,4H11)杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1;腹水的上清效价为1∶40 000-1∶80 000。免疫印迹分析显示,5株单抗均能与重组阴道毛滴虫AP33发生特异性结合;与阴道毛滴虫抗原分子量为33kDa抗原分子结合。结论制备的抗重组AP33杂交瘤细胞株能分泌识别重组AP33的高特异性单抗,为进一步研究其在阴道毛滴虫病免疫诊断中的应用奠定了基础。     

鸡疟原虫雌配子单克隆抗体的制备和鉴定

用鸡疟原虫雌配子免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取免疫鼠脾细胞与ＮＳＩ鼠骨髓瘤细胞融合，筛选出的６株（３Ｈ１、２Ｈ１、１Ｇ１、１２Ｄ１、６Ｅ２、６Ｃ２）杂交瘤细胞，证明能分泌效价高、特异性强的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）。亚类鉴定为ＩｇＧ１（６Ｃ２，３Ｈ１）、ＩｇＧ２ａ（１Ｇ１，２Ｈ１）、ＩｇＧ２ｂ（６Ｅ２）、ＩｇＧ（１２Ｄ１），其中２Ｈ１、６Ｅ２、１Ｇ１、１２Ｄ１株ＭｃＡｂ为抗膜抗体，而３Ｈ１和６Ｃ２株ＭｃＡｂ为非抗膜抗体。除１２Ｄ１株ＭｃＡｂ与蓝氏贾第鞭毛虫滋养体有交叉反应外，其它各株ＭｃＡｂ与阴道毛滴虫滋养体、杜氏利什曼原虫前鞭毛体、鼠疟原虫和鸡疟原虫红细胞内期均无交叉反应。     

阴道毛滴虫重组蛋白AP33的制备、鉴定和初步应用

目的 克隆阴道毛滴虫(T.v)重组蛋白AP33的基因(ap33基因),构建其原核表达系统,鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性和免疫原性。方法 从阴道毛滴虫临床分离虫株Tv317抽提总RNA,经mRNA纯化试剂盒纯化后逆转录合成cDNA。以cDNA为模板扩增ap33基因,T-A克隆后测序,构建pET32a(+)的ap33基因表达载体,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21DE3株,用不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用抗阴道毛滴虫全虫抗体蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性,用兔抗重组融合蛋白AP33血清的免疫双扩散试验鉴定重组融合蛋白AP33的免疫原性,用阴道毛滴虫临床分离虫株全虫抗原包被的ELISA鉴定重组蛋白AP33的免疫原性。ELISA检测滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体。结果 克隆的ap33基因与已报道的相应核苷酸序列同源性及氨基酸序列同源性均较高。重组融合蛋白AP33表达量较大,能与抗阴道毛滴虫全虫抗体发生结合反应,免疫家兔能获得高效价抗AP33蛋白抗体。T.v临床分离虫株重组蛋白AP33表达率高,能刺激机体产生抗体。ELISA检测50例滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体,阳性率为78.0%(39/50)。结论 构建了阴道毛滴虫ap33基因原核表达系统,重组融合蛋白AP33具有良好的抗原性和免疫原性。     

用阴道毛滴虫全虫抗原和单克隆抗体进行ELISA试验条件的探讨

本文用阴道毛滴虫全虫抗原和单克隆抗体进行 ELISA 试验条件的探讨。选用不同固定剂(丙酮、乙醇、甲醇、福尔马林)和自然干燥法固定虫体,不同虫数(1.5×10~6～9.5×10~6cells/ml)包被酶标板,不同封闭剂(牛血清白蛋白、脱脂奶粉、吐温20/PBS),不同酶标板(国产与进口)、不同类型抗原(全虫和可溶性抗原)。其中以80%丙酮固定5.5×10~6cells/ml 包被国产酶标板,用0.25%脱脂奶粉作为封闭剂为本试验的最佳条件。     

用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测阴道毛滴虫可溶性 …

用抗阴道毛滴虫的单克隆抗体ＩｇＧ（鼠）和兔抗卫道毛滴虫多克隆抗体进行ＥＬＩＳＡ试验（双抗体夹心法），检测阴道毛滴虫可溶性抗原。分别观察了单克隆和多克隆抗体的不同浓度、不同的封闭剂型、封闭时间及孵育时间等条件对本试验效果的影响。结果以单克隆抗体ＩｇＧ（鼠）２５μｇ／ｍｌ包被，用０．２５％脱脂奶粉１次性封闭０．５ｈ（３７℃），兔抗阴道毛滴虫多克隆抗体滴度１：２００，孵育０．５ｈ为最佳条件。阴道毛滴虫可     

阴道毛滴虫酶的定位与代谢的研究

阴道毛滴虫的超微结构细胞化学反应显示:酸性磷酸酶、胞嘧啶核苷酸酶定位于消化泡,溶酶体释放的酶可引起阴道上皮细胞受损;硫胺素焦磷酸酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶分别定位于高尔基体的成熟面膜囊与中间膜囊;在消化泡可见过氧化物酶反应物;琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶反应结果表明,虫体缺乏线粒体;过氧化氢酶反应阴性,提示虫体缺乏微体;铀-铝-铜浸染法可深染氢化酶体和内质网。氢化酶体是虫体的代谢产能重要细胞器。     

阴道毛滴虫致病株可溶性抗原的电泳分析

目的：研究阴道毛滴虫一致病分离株的全虫可溶性抗原。方法：应用SDS－PAGE、激光光密度扫描、免疫印迹法等，对阴道毛滴虫一致病虫株的全虫可溶性抗原进行分析。结果：SDS－PAGE分离出14条蛋白带，在所分离的可溶性抗原中，分子量≤72kDa的占89．5％，分子量为48－51kDa的占19．2％，＞100kDa的占7．4 ％，最低分子量为13kDa。免疫印迹试验显示免疫反应具有广泛性分子量范围，但在86kDa附近未显示出免疫反应。结论：在阴道毛滴虫一致病虫株全虫可溶性抗原中，分子量为48kDa蛋白质具有较高的蛋白含量和较强的免疫学反应。     

抗蓝氏贾第鞭毛虫单克隆抗体的制备和特性研究

用体外培养的四川株蓝氏贾第鞭毛虫滋养休免疫BAIB/c小鼠,以免疫脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合,共获得3个分泌抗蓝氏贾第鞭毛虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株。这些McAb经鉴定均属lgG_1亚类。选取活性最强的1E_2株McAb对不同贾第虫株进行抗原定位的测定,由IFA显示,该McAb与四川株和山东株滋养休的后1/3表面呈现荧光反应,但与澳大利亚株滋养体表面不显荧光,表明国内株与国外澳大利亚株滋养体表膜抗原存在株间差异。     

马拉硫磷抗性致倦库蚊酯酶单克隆抗体的制备及鉴定

用马拉硫磷抗性致倦库蚊酯酶免疫经ＰＰＤ刺激的小鼠制备了５株单克隆抗体，经鉴定均为ＩｇＧ１，各株单抗两两相加的相加指数（Ａ．Ｉ．）均未超过５０％。酯酶与１∶１０００稀释的腹水孵育１ｈ后即失去分解底物活性。免疫印迹结果显示，单克隆抗体识别的抗原在８个群体（或品系）均有一６４ｋＤａ蛋白带，反应强度及蛋白带数量与抗性程度有关。单抗对幼虫及苄呋菊酯抗性品系酯酶基本无反应。     

抗日本血吸虫单克隆抗体的制备及其在诊断中的应用

The present paper reported on an anti-CCA monoclonal antibody, McAb-IIID 10, which could be used in determinations of both parasite-oriented circulating antigens and specific anti-CCA antibodies. The established competitive ELISA (C-ELISA) using McAb-IIID 10 to detect schistosome-antibodies showed high sensitivity and specificity in the diagnosis of schistosomiasis with few cross-reactions. In field trials, coincident rates in 3 separate batches of serum samples when subjected to double-blind detections were obtained. A total of 1,915 serum samples had been determined by C-ELISA, among them 113 acute cases achieved a 100% positive rate, 765 chronic and 25 late cases showed 96.3% and 72% positive respectively. 70% of the 66 cured schistosomiasis cases turned to be negative. None of the 750 normal individuals showed positive reactions. No cross reaction was found in 27 sera from hydatidosis, whereas 1 and 2 positive reactions were found in 43 paragonimiasis sera and 126 clonorchiasis sera respectively. The established McAb-IIID 10 involved Dot-ELISA was found of value in the assessment of effective chemotherapy and showed a high negative conversion rate of 97.9% in 48 cured schistosomiasis patients. In 16 experimentally infected rabbits, 12 became negative in Dot-ELISA determinations at the 8th week post treatment, and the remaining 4 treated ones, the titer as well as the reaction intensity were also found reduced. A good coincidence rate was also found between C-ELISA and Dot-ELISA, their detection results may be complementary each other.     

计算机图象分析系统测量阴道毛滴虫:形态学数据和参数的建立和分析

目的　建立并分析阴道毛滴虫的形态学数据和参数。　方法　用计算机图象分析系统得到阴道毛滴虫及核的长、宽、周长、长宽比、等效圆直径、圆度、面积、前鞭毛与后鞭毛、轴柱长度。计算滋养体和核的体积。　结果　滋养体的大小为 15 .0 11μm(9.2 2 2～ 2 1.796μm)× 12 .0 5 8μm(5 .86 8～ 17.6 0 5μm)。前鞭毛、后鞭毛和轴柱的长度分别 18.2 7μm、17.4 1μm、2 1.94μm。相关分析显示滋养体与核的面积 (r=0 .5 4 ,P<0 .0 1)、滋养体与核体积 (r=0 .4 7,P<0 .0 1)相关性有显著性意义 ,滋养体面积和核圆度呈负相关 (r=- 0 .2 9,P<0 .0 1) ,滋养体圆度和核圆度之间无相关性。　结论　参数间的相关系数显示 ,随着滋养体增大 ,虫体的形态变圆 ,而核的形态变化不大。阴道毛滴虫形态学数据和参数的建立为量化及评价虫体的形态奠定了基础。     

阴道毛滴虫在两种培养基中的生长与形态观察

目的 通过对改良肝浸汤培养液及RPMI1640培养基内阴道毛滴虫生长情况的观察,选择适合教学和科研的培养基。 方法 用临床分离的阴道毛滴虫标本,分别接种至改良肝浸液及RPMI1640两种培养基内进行培养,pH值为5.6~5.8,通过计数了解生长情况并观察阴道毛滴虫的形态。 结果 肝浸汤培养液中培养48 h,阴道毛滴虫达到生长高峰,虫体呈现出多分裂相,虫体变大、呈圆形,内含4~12个细胞核,细胞膜外缘可见数丛鞭毛。RPMI1640培养基中阴道毛滴虫72 h达到生长高峰,虫体密度约为肝浸液高峰期的2／3,未见多分裂现象,虫体与生理盐水涂片中阴道毛滴虫形态、大小相近。 结论 改良的肝浸液培养基适于阴道毛滴虫的药物试验及其他实验项目的研究,RPMI1640培养基更适用于教学、标本的制作及实验室保种工作。     

阴道毛滴虫整虫抗原和单克隆抗体进行斑点酶联免疫吸附试验条件的探讨

以阴道毛滴虫整虫抗原和单克隆抗体进行ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ试验，分别观察了不同的虫体数量、孵育时间、封闭剂型、抗原类型、ＮＣ膜及抗原保存时间与温度等条件对试验效果的影响。结果显示以２．５×１０７细胞／ｍｌ的虫数制备抗原膜，用０．５％脱脂奶粉１次性封闭１ｈ（３７℃），单克隆抗体和酶分别孵育１ｈ（３７℃）为最佳条件。在４℃和－２０℃温度下，抗原可保存４个月。     

蒿甲醚体外抗阴道毛滴虫的作用

目的 :为了寻找新的高效、低毒 ,既能口服 ,又可外用的抗滴虫药物。方法 :将蒿甲醚的不同浓度作用于体外培养基中的阴道毛滴虫 ,并与甲硝唑作比较。结果 :蒿甲醚各浓度组的滴虫死亡率均高于对照组 ,但低于甲硝唑组。结论 :蒿甲醚具有一定的抗滴虫作用 ,但杀虫效果不及甲硝唑     

蜂胶体外抗阴道毛滴虫的效果观察

目的观察蜂胶体外抗阴道毛滴虫的效果. 方法阴道毛滴虫体外无菌培养后,加入蜂胶溶液使其浓度为2.4 mg/ml,同时设置溶剂对照组和正常培养空白对照组,分别于0 h、6 h、12 h和24 h观察各组虫数、活率并计算活虫数. 结果培养0 h、6 h、12 h、24 h不同时间蜂胶组的虫数(万/ml)分别为50.50±2.92、16.25±2.40、12.88±0.85、11.13±1.31;活虫数(万/ml)46.20±2.91、7.04±1.75、2.87±0.69、1.24±0.59;活率(%)91.50±3.11、43.00±6.83、22.25±5.32、11.50±5.74.空白对照组的虫数分别为43.25±8.29、39.00±13.22、55.50±18.01、81.88±22.63;活虫数37.68±7.56、36.77±12.28、50.09±17.19、79.61±22.09;活率87.00±0.82、94.50±3.51、90.00±4.32、97.25±0.96.蜂胶组与溶剂对照组以及空白对照组比较差异有显著性. 结论蜂胶具有明显的体外抗阴道毛滴虫效果,培养液蜂胶浓度为2.40 mg/ml时,随培养时间延长,滴虫不断减少,活率不断降低.