靶向Dicer的RNA干扰对卵巢癌细胞生物学功能的影响

目的探讨Dicer抑制对卵巢癌细胞A2780增殖和迁移能力的影响,以进一步明确Dicer在卵巢癌生物学行为中的作用。方法合成Dicer的小干扰RNA(Dicer siRNA)转染A2780细胞并筛选有效siRNA,实时定量PCR(RT-PCR)检测Dicer的mRNA的表达,蛋白印迹法检测Dicer蛋白的表达,MTT检测细胞生长活力,Transwell小室检测细胞迁移能力,流式细胞仪测定细胞周期。结果与未转染组相比,siRNA1658转染组Dicer基因mRNA的表达最低,为(0.194±0.002),明显低于siRNA1897转染组的(0.535±0.015),差异有统计学意义(P0.001),但与siRNA334组的(0.251±0.014)相比,差异无统计学意义(P0.05)。实时定量PCR结果显示,以未转染A2780细胞Dicer mRNA表达水平为100%,si Dicer-A2780细胞Dicer的mRNA水平相对下降(0.157±0.012),差异有统计学意义(P0.001)。以未转染A2780细胞Dicer的蛋白表达水平为100%,si Dicer-A2780细胞Dicer的蛋白水平相对下降(0.153±0.021),差异有统计学意义(P0.001)。在种板后第3天、第4天、第5天,与对照组细胞比较,si Dicer转染的A2780细胞增殖能力增强(P均0.05)。与对照组转染si NC的细胞相比,转染si Dicer 96 h后,si Dicer-A2780细胞的增殖活性平均上升了23%。细胞周期分析结果显示si Dicer-A2780细胞中G0/G1期占(44.26±0.48)%,S期占(25.05±1.20)%,G2/M期占(21.53±0.77)%;对照组si NC-A2780细胞中G0/G1期占(52.79±1.11)%,S期占(20.01±1.22)%,G2/M期占(19.80±0.24)%。si Dicer-A2780细胞S期和G2/M细胞较对照组明显增加(P均0.05),而G0/G1期细胞则减少(P0.001)。与对照组si NC-A2780细胞的穿膜细胞数相比,抑制Dicer表达的si Dicer-A2780细胞的穿膜细胞数增加(3.99±0.29)倍(P0.001)。结论 Dicer基因具有抑制卵巢癌细胞增殖和侵袭的能力。     

慢病毒载体介导siRNA抑制survivin对人卵巢上皮癌细胞作用的实验研究

目的:探讨RNA干扰技术沉默survivin基因表达对人卵巢上皮癌A2780细胞增殖和凋亡的影响。方法:设计并合成靶向survivin的小分子干扰RNA(siRNA),构建慢病毒表达载体,MTT比色法检测细胞增殖率;流式细胞计数检测各组细胞周期和凋亡指数;Real-timePCR和Western blot方法观察对A2780细胞survivin mRNA水平及蛋白质表达的抑制效率。结果:survivin-siRNA能有效封闭survivin基因的表达,使survivin的mRNA相对水平明显降低(P<0.05);survivin-siRNA能明显抑制细胞增殖(P<0.05);survivin-siRNA使细胞G0/G1期细胞百分比明显增加,促进细胞的凋亡(P<0.05)。结论:利用RNA干扰技术沉默survivin基因的表达可以显著抑制人卵巢上皮癌A2780细胞的增殖,并在一定程度上诱导其自发凋亡,靶向survivin的RNA干扰技术在卵巢癌的基因治疗中具有一定的研究价值。     

低氧对人肺腺癌细胞株A549细胞周期及HIF-1α、p27表达的影响

目的 探讨低氧诱导入肺腺癌细胞株A519发生G0/G1期细胞周期阻滞的分子机制。方法 将培养的细胞分为对照组、低氧21h组低氧48h组。流式细胞仪检测细胞周期分布及p27蛋白表达，免疫细胞化学与原位杂交技术检测缺氧诱导因子-1α（HIF-1α ）蛋白表达及p27mRNA转录水平。结果①低氧21h组与18h组G0/G1期细胞比例显著高于对照组（P＜0．05）；②HIF-1α蛋白在对照组有少量表达，随着低氧时间的延长，其表达增加（P＜0.01）；p27mRNA转录水平及p27蛋白表达均随低氧时间的延长而增高（均P＜0.01）;③低氧组HIF-1α表达与p27蛋白表达存在显著相关（r=0.958,P＜0.01）；低氧组p27蛋白表达与G0/G1期阻滞呈现著正相关（r=0.867,P＜0.01）；低氧组HIF-1α表达与p27mRNA转录呈显著相关（r=0.695,P＜0.01）。结论 低氧能使人肺腺癌细胞株A549发生G0/G1期阻滞，HIF-1α对p27转录和表达的调控在其中可能起重要作用。     

低氧预处理对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖、凋亡和坏死的影响

 目的 探讨低氧预处理对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖、凋亡和坏死的影响及其可能机制。方法 采用全骨髓细胞贴壁法分离培养BMSCs,通过细胞成脂、成骨分化诱导及流式细胞仪检测其表面标志物(CD29、CD90、CD45)鉴定BMSCs;运用siRNA干扰技术沉默低氧诱导因子 1α(hypoxia inducible factor,HIF 1α)基因。将细胞分成6组:正常培养组、正常培养+转染阴性对照组、正常培养+HIF 1α RNA干扰组、低氧预处理组、低氧培养+转染阴性对照组及低氧培养+HIF 1α RNA干扰组,分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞仪和乳酸脱氢酶(lactic acid dehydrogenase,LDH)活力测定等方法,检测各组BMSCs的增殖、凋亡和坏死情况;Western blot和real time PCR 检测各组BMSCs中HIF 1α、葡萄糖转运子 1(glucose transporter,GLUT 1)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的mRNA和蛋白的表达。 结果 培养的BMSCs具有成脂、成骨等多向分化潜能;流式检测呈现CD29和CD90高表达,CD45低表达;低氧预处理可促进BMSCs增殖,减轻坏死,对细胞凋亡无明显影响;低氧预处理组HIF 1α、GLUT 1及VEGF的蛋白及mRNA表达明显高于常氧培养组(P<0.05);给予低氧预处理组siRNA HIF 1α后其HIF 1α、GLUT 1及VEGF的蛋白及mRNA表达均明显低于未干扰前(P<0.05),且细胞增殖受抑制,细胞凋亡和坏死加重(与未干扰前相比,P<0.05)。 结论 低氧预处理可促进BMSCs的体外增殖,减轻坏死,其机制可能与低氧预处理后HIF 1α表达增加及上调其下游基因GLUT 1和VEGF表达有关。     

低氧促进C2C12细胞增殖及相关机制探讨

目的：探讨低氧对小鼠骨骼肌成肌细胞系C2Cl2细胞增殖的影响及其增殖的可能相关机制。方法：采用血细胞计数板法和流式细胞仪观察低氧（10％O2）对C2Cl2细胞数量和增殖指数的影响；用RT—PCR和Western blot方法检测低氧诱导因子-1α（HIF—1α）mRNA和蛋白水平的表达。结果：低氧组细胞较常氧组细胞数量和增殖指数增加（P〈0．01）；HIF—1αmRNA和蛋白水平变化在常氧组和低氧组细胞中无显著差异。结论：低氧可促进C2Cl2细胞的增殖，其增殖机制可能不是直接通过HIF—1αmRNA和（或）蛋白水平量的多少来调控。     

mTORC1-HIF1α通路基因在人CD8+调节T细胞中的表达及意义

目的:探讨mTORC1-HIF1α通路基因在人CD8+调节性T细胞中的表达及意义?方法:建立人卵巢癌细胞系SKOV3与健康人CD8+ T细胞体外共培养体系,设置CD8+T细胞单独培养组为对照组?共培养5 d后,收集各组CD8+T细胞,荧光定量PCR检测2组CD8+T细胞中mTORC1-HIF1α通路基因(mTORC1?HIF1α?Glut1?PKM2?GPI?TPI?Eno1及LDHα)mRNA表达水平;Western blot 检测2组CD8+T细胞中mTORC1-HIF1α通路基因(mTORC1?HIF1α及PKM2)蛋白表达水平;收集14例卵巢癌,12例卵巢良性肿瘤及12例健康体检者外周血,磁珠阳选法分离CD8+T细胞,荧光定量PCR检测卵巢癌患者CD8+T细胞中mTORC1-HIF1α通路基因mRNA表达水平,并与卵巢良性肿瘤及健康体检者做比较研究?结果:与单独培养组相比,共培养组CD8+ T细胞mTORC1?HIF1α?PKM2?GPI及TPI mRNA表达水平显著降低(P < 0.05);Western blot 结果显示,共培养组CD8+ T细胞mTORC1?HIF1α及PKM2蛋白表达水平也显著低于对照组(P < 0.05);卵巢癌组CD8+ T细胞中mTORC1?HIF1α?Glut1?PKM2?GPI及TPI表达量显著低于健康对照组(P < 0.05);卵巢癌组mTORC1?PKM2?GPI及TPI表达量明显低于卵巢良性肿瘤组(P < 0.05);卵巢良性组mTORC1-HIF1α通路各基因表达水平与健康对照组间无显著性差异?结论:卵巢癌微环境诱导的CD8+调节性T细胞低表达mTORC1-HIF1α通路基因,mTORC1-HIF1α通路在卵巢癌微环境中CD8+调节性T细胞代谢及分化过程中具有重要意义?     

香菇多糖体外逆转A2780卵巢癌细胞顺铂耐药及可能机制

目的:研究香菇多糖体外逆转A2780卵巢癌细胞顺铂耐药及可能机制。方法:根据药物处理方法将A2780卵巢癌细胞分为CON组(未行香菇多糖或顺铂处理)、DDP组(仅用顺铂处理)、LEN组(仅用香菇多糖处理)及D+L组(香菇多糖联合顺铂处理),比较四组细胞增殖、细胞周期及凋亡率和耐药基因mRNA表达的差异。结果:D+L组细胞第1-7天的吸光度、S期、G2/M期和PI均显著低于CON组、DDP组和LEN组细胞(均P<0.05),G0/G1期和细胞凋亡率均显著高于CON组、DDP组和LEN组细胞(均P<0.05);LEN组和D+L组细胞MDR1和MRP1基因mRNA表达无明显差异(均P>0.05),CON组和DDP组细胞MDR1和MRP1基因mRNA表达显著高于LEN组和D+L组细胞(均P<0.05)。结论:香菇多糖体外可逆转卵巢癌细胞对顺铂耐药性,可能与降低MDR1和MRP1表达有关。     

低氧诱导对人肝癌SMMC7721细胞生物学行为的影响

目的研究低氧对体外培养的人肝癌细胞株SMMC7721增殖、细胞周期、凋亡和黏附、迁移能力的影响,探讨其中可能存在的分子机制.方法通过氯化钴诱导人肝癌SMMC7721细胞低氧,MTT法、流式细胞术、细胞黏附试验、transwell小室迁移实验观察低氧对肝癌细胞增殖、凋亡和细胞周期以及细胞黏附和迁移能力的影响;采用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测低氧对细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶2（MMP2）mRNA和蛋白表达的影响.结果 MTT法显示氯化钴诱导的低氧对肝癌细胞生长起抑制作用;低氧24 h,流式细胞术显示细胞凋亡、坏死增加,细胞周期G0/G1期、S期细胞比例减少,G2/M期比例增加;黏附试验显示低氧后细胞黏附力增强（P〈0.01）,transwell小室实验显示,低氧后细胞迁移能力较常氧时明显增加（P〈0.05）;RT-PCR和细胞免疫化学检测显示低氧条件下HIF-1α、VEGF、MMP2的mRNA和蛋白表达均较常氧时增加（P〈0.05）.结论氯化钴诱导低氧可抑制SMMC7721细胞增殖,使细胞周期阻滞于G2/M期,细胞凋亡、坏死增加,同时细胞黏附、迁移能力增强;低氧时HIF-1αmRNA和蛋白表达增加,并通过调节及其下游靶基因VEGF、MMP2的表达参与了这一生物学行为的转变.     

NF－κB 对卵巢癌细胞中 HIF－1α与 GST－π的调节作用

目的：探讨卵巢癌细胞中,HIF－1α与GST－π表达的相关性及NF－κB的调节作用,为卵巢癌耐药的基因治疗提供重要靶点。方法卵巢癌SKOV3细胞转染HIF－1αsiRNA,检测其转染效率;采用RT－PCR和Western blot法检测HIF－1α基因沉默后卵巢癌细胞中GST－π以及NF－κB基因和蛋白表达的变化;给予不同浓度NF－κB抑制剂PDTC后,检测GST－π和NF－κB的表达变化。结果 HIF－1α的siR－NA载体成功转染卵巢癌SKOV3细胞后,HIF－1αmRNA表达显著下降,GST－π的mRNA 和蛋白表达抑制,NF－κB表达增加。给予NF－κB抑制剂PDTC后,随着抑制剂浓度增加,GST－π表达增加。结论靶向沉默HIF－1α降低卵巢癌耐药因子GST－π的表达,增加卵巢癌细胞对化疗的敏感性。 NF－κB可能参与HIF－1α沉默后引起GST－π表达下降的调节途径。     

RNAi抑制Aurora B激酶对卵巢癌A2780细胞增殖和周期的影响

目的研究RNAi抑制Aurora B激酶对卵巢癌A2780细胞增殖和周期的影响。方法采用RNAi方法,将AURKB RNAi转入A2780细胞,RT-PCR、Western blot检测Aurora B mRNA和蛋白的表达,MTT检测A2780细胞增殖情况,流式细胞术检测A2780细胞周期改变。结果①通过RT-PCR、Western blot检测到人类5种卵巢癌细胞株A2780、SKOV3、CAOV3、A2780/taxol及AD6中均明显表达Aurora B mRNA和蛋白;②A2780细胞转染AURKBRNAi后,Aurora B mRNA和蛋白的表达明显下降,转染浓度至200 pmol/L RNAi 48 h后,Aurora B mRNA和蛋白的表达被完全抑制;③MTT检测和锥虫蓝染色结果显示,于转染200 pmol/L AURKB RNAi第4天开始,A2780细胞增殖明显受到抑制,吸光度值与空白对照组和阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);④Flow cytometry检测显示,转染200 pmol/L AURKB RNAi 24 h,大量A2780细胞进入有丝分裂期,并形成多倍体细胞,于72 h多倍体细胞比例达到峰值20.54%,转染后96 h转染组细胞凋亡率(11.67%)显著高于对照组(0.57%);⑤Hoechst 33258染色观察细胞凋亡结果显示,与A2780对照和阴性对照相比,转染200 pmol/L浓度AURKB RNAi 96 h后A2780细胞凋亡明显增多。结论 Aurora B的抑制使A2780细胞增殖受到明显抑制;导致多倍体形成,使细胞基因组严重不稳定,最终导致细胞凋亡,Aurora B可能是卵巢癌治疗的有效分子靶点。     

Survivin在肾癌组织和肾癌细胞系中的表达及意义

目的探讨存活蛋白(Survivin)在肾癌和肾癌细胞系中的表达情况及其与肾癌发生发展的关系。方法应用免疫组化方法检测66例肾癌患者和20例正常肾组织中Survivin的表达情况,应用Western blot和RT-PCR检测10例肾癌组织,正常肾组织及两种肾癌细胞系786-0和ACHN中Survivin的表达情况。结果肾癌组织和正常肾组织吸光度分别为0.031±0.002和0.875±0.124,差异具有显著性意义(P<0.01)。透明细胞癌,嗜色细胞癌和嫌色细胞癌吸光度值分别为0.873±0.091,0.904±0.103和0.813±0.126,各类型间差异无显著性意义。临床分期Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ、Ⅳ吸光度值分别为0.864±0.121,0.884±0.093和0.853±0.106,各期间比较差异无显著性意义。肾癌组织G1,G2,G3和G4吸光度值分别为0.693±0.092,0.762±0113,0.876±0.106和0.903±0.092,各级间比较,差异具有显著性意义(P<0.05)。Western blot和RT-PCR检测结果显示,正常肾组织表达阴性,肾癌组织和两种肾癌细胞系786-0和ACHN均有不同程度的Survivin蛋白和mRNA表达,统计学表明差异有显著性意义。结论Survivin和肾癌的分期,分型无关,和肾癌的分级有关,可以作为判断预后的标志物。     

维生素C对Hela细胞系增殖及细胞周期的影响

目的 探讨维生素C对Hela细胞系增殖及细胞周期的影响。方法 采用MTT测定，观察不同浓度维生素C(1μmol／L～3500μmol／L)对Hela细胞系增殖的抑制作用；运用流式细胞仪检测用药后细胞周期分布及增殖指数的变化。结果 各个浓度的维生素C对Hela细胞系增殖均有抑制作用，并呈剂量依赖性，3500μmol／L时，抑制率为66．15％。维生素C能使Hela细胞系阻滞于G0／G1期，抑制DNA的合成，使细胞增殖指数明显下降。且此作用随用药浓度的增加而增强。结论 维生素C在体外对Hela细胞系有明显的抑制作用，使细胞阻滞于G0／G1期。     

人牙髓细胞向成牙本质细胞诱导分化中细胞周期变化

目的 建立成牙本质细胞样细胞体外培养体系,观察体外培养的牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中细胞周期的变化.方法 利用组织块酶解法培养人牙髓细胞并进行鉴定,使用矿化诱导液诱导其向成牙本质细胞样细胞分化.对细胞增殖情况使用流式细胞仪进行细胞周期测定.结果 ①获得的牙髓细胞均为波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性,证明为中胚层来源的细胞.②诱导分化的牙髓细胞在2周左右进入复层生长期;3周左右开始有细胞结节形成,周围细胞呈放射状排列,部分细胞出现细长突起并呈极性排列;4周左右细胞团中央Von Kossa染色为阳性.③在诱导开始后1周,细胞处于活跃的增殖期,以后细胞增殖变慢,3周后多数细胞处于G0G1期.结论 实验成功建立了成牙本质细胞样细胞体外培养体系,所获得的成牙本质细胞样细胞具有成牙本质细胞的部分形态和生物学功能,诱导分化后细胞增殖变慢,是研究成牙本质细胞的较好模型.     

透明细胞肾细胞癌多层CT影像表现特点分析

目的分析透明细胞肾细胞癌的多层CT影像特点,提高诊断水平。方法回顾性分析55例透明细胞肾细胞癌的CT表现,所有病例均进行平扫及增强三期扫描。结果 51例透明细胞肾细胞癌平扫表现为不均匀肿块,呈稍高密度影;增强后皮质期和髓质期明显不均匀强化,肾盂期强化程度迅速下降;均出现不同程度囊变、坏死,钙化3例。结论透明细胞肾细胞癌CT表现具有一定特征,大部分可准确诊断。     

姜黄素对人肝癌Bel7402细胞杀伤动力学及周期时相的影响

目的 研究姜黄素对人肝癌Ｂｅｌ－７４０２细胞杀伤动力学及周期时期的影响，方法 以集落形成法测定药物对增殖期与坪期细胞杀伤的量效关系曲线，以流式细胞仪及ＡＯ／ＥＢ荧光染色法分析药物对Ｂｅｌ７４０２细胞周期时相及凋亡的影响。结果 姜黄素１～１０μｇ／ｍｌ作用２ｈ对不同增殖状态的Ｂｅｌ７４０２细胞均呈单指数型杀伤，但对增殖期细胞敏感，１～１０μｇ／ｍｌ作用２４ｈ，Ｇ０－Ｇ１，期细胞及Ｇ２－Ｍ期细胞的比例     

漂洗技术对血液中肿瘤细胞去除作用的研究

目的　观察血液回收机漂洗技术能否将血液中的肿瘤细胞去除。方法　选择繁殖能力强 ,不易受损的细胞系肠肿瘤细胞LOVO和胃肿瘤细胞SGC ,计数后分别混入浓缩的红细胞中。采用血液回收机将其过滤、离心、漂洗。在漂洗后的浓缩红细胞中分离肿瘤细胞 ,台盼蓝染色计数存活的肿瘤细胞。将分离出的肿瘤细胞培养 1 4d ,进行克隆形成实验及DNA代谢物测定 ,观察肿瘤细胞的活性。结果　经血液回收机漂洗后仍然存在肿瘤细胞 ,但活性受到显著抑制 ;细胞培养 7d时 ,未发现肿瘤细胞有克隆形成 ;培养 1 4d后 ,肿瘤细胞有克隆形成。免疫组化实验显示 ,漂洗后肿瘤细胞DNA合成能力与对照组无显著性差异。结论　单纯采用血液回收机漂洗技术可显著减少血液中的肿瘤细胞 ,但不能完全去除血液中的肿瘤细胞     

Electron Microscopy of the Cell: Cell Structure and Function

The use of the electron microscope has added much to our knowledge of the cell. The fine structure of the component parts of the nucleus and the cytoplasm is described, and their functions are indicated. The nature and structural modifications of the plasma membrane are illustrated with particular reference to function. To illustrate the interrelationships of the nucleus and cytoplasm, the theory of protein secretion is discussed, the secretion of a particular protein or polypeptide being determined by a particular nucleotide sequence in the desoxyribonucleic acid of a chromosome, that is, by a gene. This information is transferred from nucleus to cytoplasm. It is in the cytoplasm that the majority of the work is performed while the nucleus directs the work of the cell.     

成体干细胞向肝细胞分化的研究进展

成体干细胞(adult stem cells,ASC)存在于胎儿和成人的各种组织器官中,来源广泛,不涉及伦理问题。ASC有横向分化(transdifferentiation)的能力,对揭示不同胚层细胞间相互分化的生物学意义和机制具有重要学术价值,并可以为临床细胞移植治疗开辟新的途径,也为终末期肝病的治疗提供了新思路。本文对成体干细胞加以分类并综述了各种成体干细胞向肝细胞分化的研究进展,对成体干细胞在肝脏疾病细胞治疗上的应用及前景作了总结和展望。     

肿瘤干细胞与结直肠癌肿瘤干细胞

肿瘤干细胞是一类未分化的原始肿瘤细胞,具有三大显著的生物学特性即自我更新的能力、无限增殖的能力及多分化潜能性。它是肿瘤不停生长的罪魁祸首。分离、鉴定包括结直肠癌在内的各种肿瘤干细胞以及寻求针对肿瘤干细胞的治疗措施将是肿瘤研究的新方向。     

山豆根对Eca-109细胞株细胞周期的作用

应用流式细胞术(FCM)和Feulgen-DNA法显示分裂指数,分析不同浓度山豆根对Eca-109细胞的作用。流式细胞光度术分析结果表明,实验组细胞DNA指数(DI=2)显著低于对照组(DI=2.5),两者相比差异均有极其显著性意义(P<0.01)。细胞DNA组方图G_0/G_1期细胞呈增高趋势,S期细胞均减少,G_2M期细胞均增高,与对照组比差异均有显著性(P<0.01,P<0.05)。Feulgen-DNA染色显示细胞分裂指数与小剂量药物作用时间呈负相关,大剂量药物作用下分裂指数明显下降。这说明山豆根对Eca-109细胞DNA合成有显著的抑制作用。