CRISPR系统中Cas蛋白的分类及作用机制

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统存在于40%细菌与90%古细菌中,由前导序列、回文重复序列、相关Cas蛋白三部分构成。Cas蛋白是CRISPR系统中的一类核酸酶,对CRISPR系统发挥获得性免疫功能具有重要作用。已鉴定出至少45个Cas蛋白家族,其多样性对现有分类系统提出了巨大挑战。不同类型的Cas蛋白在CRISPR系统适应、表达、干扰等作用阶段发挥的功能各异。本文主要讨论Cas蛋白的分类及作用机制的研究进展。     

大肠埃希菌CRISPRs间隔序列的来源研究

目的研究大肠埃希菌全基因组中规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPRs)的间隔序列分布及来源规律。方法通过BLAST、CRISPRs finder、ClustalX和CRISPRTarget分析CRISPR/Cas、间隔序列及其来源。结果 203株大肠埃希菌中74.4%含有I-E CRISPR/Cas,9.4%含有I-F CRISPR/Cas,17.2%存在CRISPR3-4;CRISPR1,CRISPR2,CRISPR3和CRISPR4的间隔序列数目范围分别为1-25、1-27、4-7和2-22;其独特间隔序列数目分别为339、346、57和66。CRISPRTarget分析I-E和I-F CRISPR/Cas的间隔序列分别匹配816条质粒和293条噬菌体,2 428条质粒和139条噬菌体,差异有统计学意义(χ~2=319.30,P0.01)。结论大肠埃希菌中CRISPR/Cas分布广泛,I-E和I-F CRISPR/Cas可能发挥不同的免疫功能。     

大肠埃希菌CRISPRs间隔序列的来源研究北大核心CSCD

目的研究大肠埃希菌全基因组中规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPRs)的间隔序列分布及来源规律。方法通过BLAST、CRISPRs finder、ClustalX和CRISPRTarget分析CRISPR/Cas、间隔序列及其来源。结果 203株大肠埃希菌中74.4%含有I-E CRISPR/Cas,9.4%含有I-F CRISPR/Cas,17.2%存在CRISPR3-4;CRISPR1,CRISPR2,CRISPR3和CRISPR4的间隔序列数目范围分别为1-25、1-27、4-7和2-22;其独特间隔序列数目分别为339、346、57和66。CRISPRTarget分析I-E和I-F CRISPR/Cas的间隔序列分别匹配816条质粒和293条噬菌体,2 428条质粒和139条噬菌体,差异有统计学意义(χ~2=319.30,P<0.01)。结论大肠埃希菌中CRISPR/Cas分布广泛,I-E和I-F CRISPR/Cas可能发挥不同的免疫功能。     

CRISPR/Cas系统在病原体核酸检测中的应用进展

快速、灵敏、特异的检测方法对于传染病防控至关重要。聚合酶链式反应、等温扩增等体外核酸扩增技术已广泛应用于病原体检测。近年来,基于规则成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)系统的核酸检测方法显示出快速、高灵敏度、高特异性与便携性等优点。本文对CRISPR/Cas系统类型、原理及其在病原体检测中的应用进展进行综述,并对其应用前景进行展望。     

规律簇集间断的短回文重复序列及其相关核酸酶9系统应用于糖尿病领域的研究进展

规律簇集间断的短回文重复序列及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统是一种新型的基因编辑工具,可同时研究多个基因的功能及相互关系,已在多种疾病中显示出巨大的潜在价值。与其他基因编辑技术,如锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活样核酸酶(TALENs)相比,CRISPR/Cas9更简单、高效。随着CRISPR/Cas9系统技术的广泛应用,在糖尿病领域有不少相关研究出现。本文从基础到临床对CRISPR/Cas9在糖尿病领域的研究进展作文献回顾,期待为相关人员提供参考。     

基于CRISPR/Cas9技术对刚地弓形虫假定蛋白TGGT1_310420的研究

目的鉴定刚地弓形虫假定蛋白TGGT1_310420在速殖子阶段的功能及其蛋白N端序列的亚细胞定位作用。方法在线设计针对TGGT1_310420的sgRNA,通过定点突变弓形虫CRISPR/Cas9载体pSAG1::CAS9-GFP-U6::sgUPRT上的sgRNA序列获得针对TGGT1_310420的CRISPR/Cas9载体。利用CRISPR/Cas9编辑技术将含有荧光蛋白mCherry和弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)的PCR片段m CherryTy_HXGPRT插入至TGGT1_310420内源基因编码N端前20个氨基酸残基之后。通过PCR鉴定片段是否正确插入;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析检测融合蛋白的表达情况。间接免疫荧光分析和共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位;空斑实验检测基因缺失株虫体表型的变化。结果 PCR和测序结果显示,成功构建了针对TGGT1_310420的CRISPR/Cas9载体, mCherry-Ty_HXGPRT序列定点插入至靶点位置。蛋白质印迹分析结果显示, mCherry融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为36 000;间接免疫荧光实验表明mCherry融合蛋白与弓形虫滑行相关蛋白45 (Tg GAP45)共定位于虫体的表膜。空斑实验检测结果显示, TGGT1_310420的缺失并未引起虫体出现可测的表型变化。结论 TGGT1_310420编码蛋白前20个氨基酸残基序列具有定位到弓形虫表膜的功能, TGGT1_310420在弓形虫速殖子阶段为非必需基因。     

CRISPR/Cas系统在病原体检测方面的研究进展

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated, CRISPR/Cas)是一种广泛存在于细菌和古细菌内部的特有的适应性免疫系统,用于抵抗外来核酸入侵。目前,该系统被分为6个类型和22个亚型,常见被应用于核酸检测的Cas9、Cas12和Cas13分别属于II型、V型和VI型。根据世界卫生组织的标准,理想的病原体检测方法应该具备灵敏、特异、快速、低成本、易于使用和无需大型设备等特点,而CRISPR/Cas的特性使其在病原体检测方面显示出了巨大的潜力。本文主要总结了Cas9、Cas12、Cas13和Cas14在病原体检测中的应用,并对CRISPR/Cas未来的应用前景进行了展望。     

利用常间回文重复序列丛集及相关蛋白9系统敲除小鼠肾集合管上皮细胞系的水通道蛋白2基因

目的利用常间回文重复序列丛集(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统敲除小鼠肾内髓集合管3(m-IMCD3)上皮细胞的水通道蛋白2(Aqp2)基因。方法在小鼠Aqp2基因的第1、4个外显子上各设计两个小向导RNA(sgRNA),分别为sgRNA1-1、sgRNA1-2、sgRNA4-1、sgRNA4-2,并将其成功克隆进常间回文重复序列丛集慢病毒载体2上。将测序正确的质粒转染到m-IMCD3细胞中,提取各单克隆细胞系的基因组DNA,通过聚合酶链反应扩增出sgRNA作用靶点的DNA片段并测序。利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫荧光检测Aqp2的表达。结果成功构建出含有相应sgRNA的载体;4个sgRNA对Aqp2基因的靶点都有切割作用;sgRNA1-1与sgRNA4-2组合能成功把两者间5500bp的DNA片段敲除;应用RT-PCR及免疫荧光证实应用CRISPR/Cas9系统敲除Aqp2后,该m-IMCD3细胞系中的Aqp2mRNA及蛋白几乎未见表达。结论通过CRISPR/Cas9系统可获得Aqp2基因敲除的肾集合管上皮细胞系。     

CRISPR-Cas系统在结核分枝杆菌研究中的应用进展

成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和他们相关的蛋白(Cas)组成了一个新的分布于结核分枝杆菌(MTB)的获得性免疫防御系统。此外,CRISPR-Cas系统与MTB的毒力、耐药以及定向基因编辑方面可能存在重要的关系。笔者主要通过对CRISPR-Cas系统在MTB的免疫作用及其相关研究进展进行综述,以期为进一步研究MTB致病性和抗结核治疗提供一种新思路。     

成簇的规律间隔短回文重复序列/Cas9系统在病毒领域的应用

目前成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统已经在很多物种及细胞中被广泛用来编辑基因组DNA,这一系统是第三代人工核酸内切酶,通过识别短的病毒序列来完成基因的编辑。介绍了该系统的结构特点以及在病毒领域的应用,包括病毒相关基因的功能研究,以及抗病毒治疗(包括HIV、HBV、EB病毒等)方面的研究,同时也对该系统未来在病毒方面的研究方向进行展望。     

利用CRISPR/Cas9技术构建ALK7LoxP/LoxP小鼠品系

目的利用CRISPR/Cas9技术将LoxP序列靶向导入小鼠活化素受体样激酶7(ALK7)基因,构建ALK7LoxP/LoxP小鼠,与组织特异性Cre小鼠杂交,获得时空特异性ALK7基因敲除小鼠,为研究ALK7在特定时间特定组织中的功能奠定基础。方法利用CRISPR/Cas9技术编辑小鼠ALK7基因:设计合成识别ALK7基因外显子4-6上下游非编码序列的sg RNA。设计并合成LoxP-ALK7-LoxP打靶载体,测序正确后,显微注射法将体外合成的sg RNA、Cas9 m RNA和打靶载体注射到小鼠受精卵,移植受精卵至假孕小鼠输卵管代孕。获得仔鼠后通过PCR、Southern blot鉴定子代小鼠基因型,实时荧光定量PCR、Western blot检测ALK7转录表达水平。结果获得了含有目的基因的打靶阳性小鼠,并且插入的LoxP序列不影响ALK7的转录表达水平。结论利用CRISPR/Cas9技术成功将LoxP序列靶向引入小鼠ALK7基因,成功构建ALK7LoxP/LoxP小鼠品系,为进一步构建组织特异性ALK7基因敲除小鼠模型奠定了基础。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在病原微生物中的应用

规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)广泛存在于古细菌及细菌中是细菌在长期进化过程中形成的一种获得性免疫系统。近年来以该系统为基础,经过人工改造形成的一种新型基因编辑技术—CRISPR/Cas9在基因工程领域的应用越发广泛;该技术与前两代编辑技术相比,具有结构简单、成本低廉、实用价值较高等优点。自2012年在基因研究领域成功应用后,已成为当前关注度较高的基因编辑工具;该技术在多种真核生物的基因修饰中已得到成功应用,但在病原微生物上却报道较少。本文将从CRISPR/Cas9系统的结构、作用机制及其在病原微生物基因功能研究中的应用等几个方面进行综述为其深入研究奠定基础。     

微型CRISPR核酸酶Cas12f研究进展及在基因编辑领域中的应用

成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR-Cas)系统是一种存在于大多数细菌和古菌中的“获得性免疫系统”,已被广泛应用于生物、医学等多个研究领域。传统的Cas核酸酶(Cas9、Cas12和Cas13)因为分子尺寸较大，将基因编辑工具精确送到真核细胞内受到阻碍。研究发现，Cas12f是目前已知的最小RNA引导核酸酶，有着与众不同的属性：除分子比较小外；对单链DNA切割不需要靶标前间区序列邻近基序(Protospacer adjacent motif, PAM);非常长的(153～169个核苷酸)反式激活crRNA(tracrRNA);结合单拷贝向导RNA(gRNA)后的二聚化；不对称的双链切割模式；针对单链DNA的附带切割活性；对识别序列中间的碱基要求严格等。基于目前研究，Cas12f具体作用机制尚不明确，本文对近年来CRISPR-Cas12f起源、分类、作用机制及其在基因编辑领域中应用的研究进行综述，以期开发微型Cas12f精准基因编辑和治疗工具，同时为相关研究领域的科研工作提供参考。     

活化转录因子3基因Cas9编辑慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建靶向活化转录因子3(ATF3)在CRISPR/Cas9技术编辑的慢病毒载体。方法:针对ATF3基因设计并合成三条对应的向导(gRNA)序列和一条无意义序列,向导RNA序列与双酶切U6-EF1a-Cas9-FLAG-P2A-EGFP载体链接,DNA测序鉴定重组载体。荧光/绝对定量法测定慢病毒浓度。共转染人微血管静脉内皮细胞(HMEC)后,实时定量荧光PCR检测ATF3 mRNA表达,验证HMEC细胞中是否含有ATF3基因及其是否有突变。对照病毒和三个靶点慢病毒分别感染Cas9蛋白稳定株,感染后混合克隆进行抽提基因组DNA,将得到PCR产物进行错配酶法进行酶切,对于筛靶中阳性的PCR产物一组序列与野生型对比。Western blot检测ATF3蛋白表达,验证转染效果。定量PCR检测ATF3mRNA的改变。结果:测序表明ATF3在Cas9编辑下慢病毒载体构建成功。HMEC倒置荧光显微镜荧光视野和明视野进行对比,感染可达到80%转染率,GFP持续稳定表达。Western blot结果显示,ATF3蛋白表达有明显下调(P<0.05)。结论:本研究成功构建了ATF3Cas9编辑慢病毒载体,为进一步研究ATF3在静脉桥血管再狭窄中早期内皮功能失调作用机制及基因治疗提供了实验依据。     

CRISPR/Cas9在清除潜伏HIV前病毒基因组中的研究进展

抗反转录病毒疗法(ART)是目前治疗艾滋病(AIDS)的首选方法,因无法清除整合到CD4~+T细胞染色体上的艾滋病病毒(HIV)前病毒基因,在停止ART治疗后,整合的HIV前病毒基因会随着T细胞的活化被激活,从而重新复制感染,因此HIV感染者/AIDS患者须终生使用抗病毒药物。成簇规律间隔短回文重复序列及其核酸酶Cas9(CRISPR/Cas9)系统,因其设计简单、操作方便,且无种属间限制,成为最具有发展前景的基因组定点编辑技术。本文就CRISPR/Cas9系统及消除潜伏的HIV前病毒基因中的研究进展进行综述。     

铜绿假单胞菌CRISPR/Cas系统的基因结构及其与耐药基因的关系北大核心CSCD

目的研究铜绿假单胞菌CRISPR/Cas系统基因结构及其与耐药基因的关系。方法收集95株铜绿假单胞菌的全基因组序列信息,通过CRISPRs web server获取CRISPR系统的信息。通过ClustalW进行重复序列和cas基因的比对分析,采用MEGA7构建cas1和cas3的系统发育树,通过RNAfold预测重复序列RNA的二级结构。通过GenBank数据库对间隔序列进行BLAST比对,并进行同源性分析。通过基因注释查找耐药相关基因,并分析其与CRISPR系统之间的关系。结果95株铜绿假单胞菌中,共发现130个确定的CRISPR位点,分布于58个菌株中,其中47个具有结构完整的CRISPR系统,30个I-F型,7个I-C型,6个I-E型,I-F型可以和I-C型或I-E型共存于同一株菌中;CRISPR位点共有18种重复序列,具有一定的保守性,基本均可形成保守的哑铃状RNA二级结构。不同类型CRISPR系统的cas基因组成不同,但均有cas1和cas3。cas1和cas3比较保守,可作为分型的依据。不同位点中间隔序列的长度和数量不同,2132个间隔序列中526个与噬菌体序列同源,32个与质粒序列同源。耐药基因分析显示,含CRISPR系统的菌株IntI1和OXA-10的携带率高于不含该系统菌株的携带率。结论铜绿假单胞菌基因组中CRISPR系统主要为-F型,其次为-E和-F型;同种类型CRISPR系统中的cas1和cas3基因高度保守;与间隔序列同源的外源基因主要为噬菌体,少数是质粒。CRISPR系统的存在与某些抗生素耐药相关基因的携带率有关。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在炎症性肠病中的研究进展

炎症性肠病(IBD)是一类严重影响全球人口健康的疾病,而CRISPR/Cas9基因编辑技术作为一种革命性的基因工具,正在为IBD的治疗带来新的希望。本文综述了CRISPR/Cas9基因编辑技术在炎症性肠病(IBD)研究中的最新进展。介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理和方法,并对其在IBD基因研究中的应用进行了探讨。尽管CRISPR/Cas9技术在IBD领域显示出潜在的巨大优势,但在递送效率、特异性和安全性等方面仍然面临一些挑战。未来的研究需要进一步解决这些问题,以深入探索CRISPR/Cas9技术在IBD治疗中的潜力和应用前景。     

CRISPR/Cas9系统在寄生虫领域的研究进展

CRISPR/Cas9是一种有效的基因组靶向修饰系统,能够实现对基因组特定位点的基因敲除、定点插入和基因修复等遗传操作,为寄生虫的基因功能分析、药物靶点和疫苗分子筛选等研究提供了技术创新平台。本文对CRISPR/Cas9系统的原理及其在刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、疟原虫(Plasmodium)、锥虫(Trypanosoma)和利什曼原虫(Leishmania)等重要寄生虫研究中的新进展进行综述,分析讨论现阶段该系统在寄生虫研究应用方面存在的问题和优化策略。     

CRISPR/Cas9基因编辑系统中两种gRNA活性检测方法比较

目的:比较CRISPR/Cas9系统中gRNA活性检测的两种方法,即利用Surveyor/T7E1核酸酶检测方法或利用Cas9蛋白的体外检测方法。方法:一方面构建表达Cas9和特异gRNA的质粒,转染NIH3T3细胞,然后提取DNA,利用T7E1核酸内切酶检测gRNA介导Cas9切割靶DNA并产生indel突变的效率;另一方面,设计引物并利用PCR扩增出gRNA的DNA模板片段,通过体外转录获得gRNA,利用Cas9蛋白及gRNA进行体外反应检测切割效率。结果:利用Cas9蛋白体外酶切可以检测到较高的gRNA活性,然而通过T7E1核酸酶方法检测gRNA在细胞中活性整体偏低,且在不同基因之间差异较大。结论:细胞Surveyor/T7E1法与Cas9蛋白体外酶切法检测到的gRNA活性不完全一致,体外活性检测法不能替代。     

CRISPR/Cas9沉默Fas可抑制急性肝衰竭细胞线粒体自噬及减轻线粒体损伤

目的 探讨凋亡相关因子(Fas/CD95)在急性肝衰竭疾病进展中的作用及机制。方法 构建刀豆蛋白A诱导的急性肝衰竭小鼠动物模型,通过透射电子显微镜及免疫印迹检测了急性肝衰竭肝细胞内的线粒体自噬发生;在小鼠尾静脉输注靶向Fas基因的CRISPR/Cas9质粒,随后予以刀豆蛋白A诱发急性肝衰竭,检测小鼠肝组织急性损伤情况及肝细胞内线粒体自噬及线粒体损伤的变化,同时体外转染靶向Fas的CRISPR/Cas质粒到细胞内,刀豆蛋白A诱导HepG2肝细胞损伤,验证Fas敲除后对线粒体自噬和线粒体损伤的影响。结果 刀豆蛋白A可诱导小鼠急性肝衰竭,透射电镜观察发现肝细胞中发生了线粒体自噬,肝细胞内p62蛋白水平降低,PINK1/Parkin的蛋白上调,Fas的表达上调;小鼠肝组织和体外肝细胞先予以PX330Fas质粒转染,再予以刀豆蛋白A诱导肝损伤后,LC3II/LC3I表达比值减低,p62蛋白的表达得到恢复,线粒体蛋白COX4I1和线粒体DNA含量的水平下降,Fas表达下调,与转染空白质粒的对照组相比,差异均有统计学意义。结论 CRISPR/Cas9沉默Fas抑制急性肝衰竭进展及肝细胞内线粒体自噬的...