心肌梗死患者与柯萨奇B组病毒感染关系的研究

心肌梗死与柯萨奇Ｂ组病毒 (ＣｏｘＢＶ)感染的关系 ,已引起国内外关注〔1～3〕,为探讨ＣｏｘＢＶ感染在心肌梗死患者发病中的意义 ,我们对急性心肌梗死 (ＡＭＩ)患者和正常人进行了调查 ,现将结果报告如下。1　对象与方法1 .1 　 对象患者组 :本院心血管内科 1 999年 1 0月～ 2 0 0 1年 4月住院 ,临床诊断为ＡＭＩ患者 1 0 5例 ,男 79例 ,女 2 6例 ;年龄 2 5～ 93岁。入院 1～ 2ｄ内采集血清。对照组 :采集本院门诊健康体检的 40例正常人血清 ,年龄 2 5～ 90岁。1 .2 　 方法逆转录聚合酶链反应 (ＲＴ ＰＣＲ)方法检测急性期患者血清中肠道…     

柯萨奇病毒B3引致心肌细胞钙超载及细胞凋亡的研究

目的以柯萨奇病毒B3(CVB3)感染体外培养的小鼠心肌细胞,探讨CVB3感染心肌细胞后对心肌细胞周期、心肌细胞凋亡和心肌细胞浆游离钙的影响.方法制备心肌细胞样本,设正常对照组及实验组(CVB3感染心肌细胞),流式细胞仪、钙荧光探针标记分别检测细胞周期、细胞凋亡及心肌细胞浆内游离钙.结果CVB3感染心肌细胞后,可显著抑制心肌细胞的分裂增殖,诱导心肌细胞凋亡;显著增高心肌细胞浆内游离钙浓度和减少细胞外钙含量.结论CVB3感染体外培养的心肌细胞,可能引起心肌细胞凋亡和心肌细胞浆内钙超载,初步实验提示此种变化可能是病毒性心肌炎心脏损伤的重要机制.     

抗柯注射液对柯萨奇B3病毒感染小鼠自然杀伤细胞活性的影响

目的 :检测 BAL B/ c小鼠在感染柯萨奇 (cox) B3病毒后自然杀伤 (NK)细胞活性的动态变化以及抗柯注射液 (RSF)对其影响。方法 :将小鼠分为正常对照组、病毒对照组、10 m g/ kg RSF组、2 0 mg/ kg RSF组和 30m g/ kg RSF组 ,每组 17只 ,分别在病毒感染后第 3天、8天、12天用乳酸脱氢酶释放法 ,检测各组小鼠外周血的NK细胞活性 ,并将心脏行组织病理检查。结果 :病毒感染后第 3天 NK细胞活性显著升高 (6 7.11± 2 .5 2 ) % ,之后进行性下降 ,第 12天时低于正常 [(42 .2 6± 1.6 1) %∶ (47.79± 4.0 3) % ];RSF对 cox B3病毒感染小鼠的 NK细胞活性有双向调节作用。大剂量 (2 0 mg/ kg和 30 mg/ kg) RSF在第 3天时对增高的 NK细胞活性有抑制作用 ,第 12天时可使降低的 NK细胞活性恢复至正常水平 ;小剂量 (10 mg/ kg) RSF在第 3天时对增高的 NK活性无抑制作用 ,但第 12天时也能使降低的 NK活性恢复至正常。病毒感染第 8天时心肌病变最重 ,小剂量 RSF组心肌病变改善较少 ,大剂量 RSF组改善明显。结论 :RSF调节 cox B3病毒感染后机体的 NK细胞活性可能是其防治病毒性心肌炎的重要机制之一。     

吉林地区心脏病患者柯萨奇B组病毒感染情况分析

心脏病是一种严重危害人类健康的多发病、常见病。引发心脏病的原因很多，其中由病毒引发的心脏病占有较大比例。能引起心脏病的常见病毒是柯萨奇病毒，特别是柯萨奇B组病毒最为多见。有关心脏病柯萨奇B组病毒感染情况的报道较多，特别是在心肌炎和克山病的病因研究牛报道较多，但未见有关吉林地区心脏病柯萨奇B组病毒感染情况的报道。本文收集心脏病患者1298例抗柯萨奇B组病毒抗体检测结果，分析柯萨奇B组病毒在心肌炎、心包炎、扩张型心肌病和心肌梗塞等疾病中的感染情况，为心脏病的病因研究提供基础数据。     

黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒感染心肌细胞动作电位的作用

目的探讨黄芪总黄酮（TFA）对嗜心性柯萨奇B3病毒（CVB3m）感染心肌细胞动作电位的作用。方法采用体外培养小鼠新生心肌细胞方法,建立柯萨奇B3病毒感染心肌细胞模型,应用膜片钳技术中电流钳记录柯萨奇B3病毒感染心肌细胞动作电位。结果应用TFA组与柯萨奇B3病毒感染模型组相比较,动作电位幅值（APA）下降,差异有统计学意义（P=0．0065,n=8）,动作电位时程（APD）明显延长（P=0．00724,n=8）。结论黄芪总黄酮可显著降低柯萨奇B3病毒感染心肌细胞动作电位幅值（APA）,延长动作电位时程（APD）。     

柯萨奇B4病毒感染与克山病及其病区病毒性心肌炎

目的 探讨柯萨奇B4病毒与克山病及其病区病毒性心肌炎的关系。方法 采用寡核苷酸探针的原位核酸杂交方法,结合病理学观察,对比研究克山病与病毒性心肌炎的异同。结果 克山病与病毒性心肌炎各自具有特征性的病理学改变;发病区88．89％的病毒性心肌炎出现阳性杂交信号,而且几乎每例的所有心肌细胞均见阳性杂交信号;95．24％的亚急型克山病出现阳性杂交信号,且半数以上的标本几乎所有的心肌细胞内出现阳性杂交信号;阳性信号在病毒性心肌炎和亚急型克山病的心肌细胞内的分布及阳性信号颗粒的形态并无明显区别。结论 柯萨奇B4病毒与克山病及其病区病毒性心肌炎密切相关,其不同的病变特征可能是由于组成病因网的诸因素发生变动所致。     

化学合成siRNA体外对柯萨奇B3病毒的影响

目的RNA干扰是近年来研究基因功能的重要工具。本研究是在培养HELA细胞中，体外化学合成siRNA（small interfering RNA）对柯萨奇B3病毒（Coxsackievirus B3，CVB3）的影响，探讨RNA干扰的抗病毒效应与其应用前景。方法根据siRNA靶序列设计原则，设计了一段针对编码CVB3病毒VP4蛋白基因组的siRNA，并在体外通过化学合成形成siRNA。同时合成一段与CVB基因组序列无关的阴性对照siRNA。用CVB3感染培养HELA细胞，将其分为3组，即siRNA组（n=8），阴性siRNA组（n=8），病毒对照组（n=8），分别观察转染后第1天到第5天的细胞病变，并与未感染CVB3的空白对照组进行比较；采用RT-PCR技术检测感染CVB3各组的病毒RNA片断，观察病毒RNA与内参GAPDH的OD比值；用免疫荧光技术检测各组CVB3蛋白的表达。结果RT-PCR检测各组CVB3病毒5’端非编码区（5’UTR）RNA，siRNA组与阴性siRNA组和病毒对照组比较无明显变化（P〉0．05）；免疫荧光检测各组CVB3病毒蛋白也未见显著差异；细胞病理效应（cytophatic effects，CPE）各组问未见明显差异。结论本文选择针对编码CVB3病毒VP4蛋白基因组的siRNA未能抑制CVB3病毒复制。     

柯萨奇病毒B3型VP1基因在酿酒酵母中的表达

目的在酿酒酵母AH109中表达柯萨奇病毒B3型VP1基因，并检测VP1蛋白对报告基因的转录自激活作用。方法用乙酸锂法将重组柯萨奇B3病毒VP1基因的细菌一酵母菌穿梭载体pGBKT7一VP1转化酵母菌。通过表型鉴定、PCR法验证质粒导入宿主菌后，Western blotting验证VP1蛋白的表达，最后经营养缺陷培养基和酶底物x—a-Gal反应检测VP1基因对报告基因的转录自激活作用。结果表型鉴定和PCR法均证实pGBKT7-VP1质粒转入酵母菌成功，Western blotting证实AH109能表达VP1蛋白，营养缺陷型培养基和酶底物X-a—Gal反应结果显示VP1蛋白对3种报告基因均无转录自激活作用。结论柯萨奇病毒B3型VP1蛋白可作为酵母双杂交系统的诱饵蛋白，为筛选与其相互作用的宿主细胞蛋白提供了基础。     

柯萨奇B3病毒对HL-1心肌细胞的影响

目的探讨柯萨奇B3病毒对HL-1心肌细胞影响。方法实时荧光聚合酶链反应检测柯萨奇B3病毒感染的HL-1心肌细胞Bcl-2及Bax的表达：Annexin V-PE凋亡检测试剂盒检测感染的HL-1心肌细胞发生凋亡的比率,并与未感染心肌细胞进行对比。结果感染后4h组（0．199±0．005vs0．104±0．014,P=0．0008）及24h组（0．154±0．005vs0．1044-0．014．P=0．0176）的Bel－2／Bax表达均显著高于未感染组,差异有统计学意义。感染后4h组的Bel-2／Bax表达高于感染后24h组,差异有统计学意义（0．199±0．005孤0．154±0．005,P=0．0009）。感染后4h组（9．160％±0．161％vs．0．908％±0．015％,P〈0．0001）、12h组（6．305％±0．231％vs．0．908％±0．015％．P〈0．0001）、24h组（3．260％±0．162％vs0．908％±0．015％,P〈0．0001）的心肌细胞凋亡率显著高于未感染组,差异均有统计学意义。感染后4h组的心肌细胞凋亡率高于感染后12h组（9．160％±0．161％vs．6．305％±0．231％．P〈0．0001）和24h组（9．160％±0．161％vs．3．260％±0．162％,P〈0．0001）,差异均有统计学意义。结论柯萨奇B3病毒导致HL-1心肌细胞的凋亡,在感染4h后增加尤为明显。     

鞘磷脂酶在柯萨奇病毒B3感染心肌细胞中的作用

目的检测柯萨奇病毒B3(CVB3)感染心肌细胞后鞘磷脂酶活性的变化、鞘磷脂酶mRNA、CVB3RNA的表达、病毒滴度的变化及心肌细胞表型的变化。初步探讨鞘磷脂酶在CVB3感染的心肌细胞中的作用。方法 CVB3感染心肌细胞后不同时间点,用薄层色谱法(TLC)检测鞘磷脂酶活性;用Real time-PCR检测心肌细胞中鞘磷脂酶mRNA与CVB3RNA的表达;同时取细胞培养上清液检测CVB3滴度。用Annexin V-FITC,PI双染法观察心肌细胞表型变化。设正常心肌细胞对照组,每个时间点设三个复孔。结果病毒感染组与正常心肌细胞相比,酸性鞘磷脂酶在4h、12h时活性有升高,其mRNA表达在2h时有升高趋势(P0.05);中性Mg2+非依赖性鞘磷脂酶活性在4h时有明显升高,在12h时活性下降,而其mRNA表达在20h时升高(P0.05);中性Mg2+依赖性鞘磷脂酶活性于病毒感染后4h、12h无明显变化,其mRNA表达在各组间也无明显变化。心肌细胞内病毒RNA表达在4h时有升高趋势,8h后开始明显升高(P0.01)。CVB3病毒滴度在2h时明显升高(P0.05)。心肌细胞在病毒感染2h后早期凋亡及坏死开始增加,4h时凋亡坏死增加更明显,到24h时坏死心肌细胞明显增多。以上实验均重复3次。结论中性Mg2+非依赖性鞘磷脂酶与酸性鞘磷脂酶在CVB3侵入心肌细胞及病毒的扩散增殖过程中可能起重要作用;而中性Mg2+依赖性鞘磷脂酶在此过程中可能不起作用。     

蟾甘合剂对柯萨奇B3病毒的抑制作用

目的探讨蟾甘合剂体内外抗病毒作用及机理。方法采用细胞培养法、MTT法检测蟾甘合剂的抗病毒作用;通过不同的给药时间、途径研究其抗病毒作用的环节;建立病毒性心肌炎模型,通过组织病理学检查法观察蟾甘合剂对柯萨奇B3病毒感染动物的保护作用。结果蟾甘合剂具有抑制柯萨奇B3病毒繁殖的作用,并能有效预防及控制小鼠心肌炎的发生与发展。结论蟾甘合剂对柯萨奇B3病毒感染引起的心肌炎具有预防及治疗作用。     

维生素E对柯萨奇B3病毒感染的心肌细胞保护作用的研究

目的 探讨维生素E抗柯萨奇病毒及对感染病毒的心肌细胞的保护作用。方法 应用一定浓度的维生素E作用于柯萨奇病毒B3感染的心肌细胞，待病毒对照组细胞病变达 时，以MTT法测定细胞存活率，应用全自动生化分析仪测定细胞上清液中的心肌酶活性。结果 实验组的细胞存活率明显高于病毒对照组，心肌酶活性明显低于病毒对照组。结论 维生素E有一定的抗病毒作用，并对病毒感染的心肌细胞具有保护作用。     

柯萨奇B组病毒感染与成人隐匿性自身免疫性糖尿病的关系

目的探讨柯萨奇B组病毒（CBV）感染与成人隐匿性自身免疫性糖尿病（LADA）的关系。方法采用1：2配比病例对照研究,以ELISA法对LADA、T2DM和非糖尿病（non-DM）组研究对象进行血清CBVIgM和IgG抗体检测。结果LADA、T2DM和non-DM三组CBVIgM抗体阳性率（分别为6．3％、2．1％和5．2％）及IgG抗体阳性率（分别为14．6％、9．4％和12．5％）的差别均无统计学意义;条件logistic回归分析也未发现血清CBVIgM和IgG抗体与LADA之间有统计学联系。结论本研究未发现血清CBVIgM和IgG抗体与LADA相关。     

克山病患者分离到的柯萨奇B3病毒结构分析

本文对克山病患者分离到的柯萨奇B_3病毒(CVB_3)进行结构分析,用病毒性心肌炎分离的CVB_3株及CVB_3标准株(Nancy 株)作对照,结果是:三株病毒经蔗糖密度梯度离心提纯,用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,三株病毒均有4条主要多肽,其分子量在8～37KD 之间,糖蛋白染色显示Vp_1、Vp_2、Vp_3为糖蛋白;三株病毒相对于抗CVB_9单克隆抗体的抗原位点均在 Vp_1上,三株病毒的核酸在琼脂糖凝胶中电泳,显示单一的 RNA 区带,其电泳迁移率相同。三株病毒的电镜负染色结果观察均为球状病毒,符合肠道病毒的基本形态。实验证明:三株病毒的外壳蛋白及生物学特性方面未见差异。     

柯萨奇B组病毒所致神经系统病变临床探讨

目的柯萨奇B组病毒（CoxsackieBvirusesCBV）所致神经系统病变目前报道较少，其实并非少见。主要因其感染后多系统损害症状复杂，很难使人们确诊为神经系统病变，如不早期确诊及时治疗，个别病人可导致失明或致残。方法所有可疑本病患者均经CBV抗体IgM、IgGI－Ⅳ型测定，采用酶联免疫吸附试验（ELISA），用（CBVI－Ⅳ）抗原分别检查患者血清中的抗体（包括IgM和IgG）IgMI：100·IgG1；800或1：1600视为阳性。结果9例病人IgM1：100、IgG1：1600阳性，5例IgM（－）、IgG1：1600阳性确诊为柯萨奇B组病毒感染。结论以上病人均给抗病毒和脑细胞活化剂治疗一个月，临床体征消失，头颅CT扫描转正常。临床实践证明病原学血清诊断是唯一先决条件，病毒特异性抗体检测已是公认的一种可靠快速可取的诊断方法。     

黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒感染心肌细胞钠电流的作用

目的探讨黄芪总黄酮（TFA）对嗜心性柯萨奇B3病毒（CVB3m）感染心肌细胞钠电流的作用。方法采用体外培养小鼠新生心肌细胞方法,建立柯萨奇B3病毒感染心肌细胞模型,采用全细胞膜片钳记录技术记录心室肌细胞钠电流（INa）。结果应用黄芪总黄酮（TFA）组与柯萨奇B3病毒感染模型组相比较,INa峰值从（-7．79±1．53）nA下降到（-5．64±1．67）nA,差异有统计学意义（P〈0．01,n=6）。结论黄芪总黄酮可显著降低柯萨奇B3病毒感染心肌细胞钠电流的幅值。     

一株引起病毒性脑炎的柯萨奇B3病毒的生物学特性分析

目的通过分析分离自病毒性脑炎病人的一株柯萨奇病毒B3株KMA103-09生物学特性,研究其致病机理。方法将KMA103-09病毒分别按一定量接种至KMB17细胞、RD细胞、VERO细胞、Hep-2细胞、Hela细胞及MRC-5细胞进行培养,观察细胞的生长情况,并采用微滴法检测病毒在不同时间、不同细胞中的病毒感染滴度;将一定量KMA103-09病毒注射乳鼠和成鼠脑内,观察病毒的致病性,并检查鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-r、TNF、IL-17A、IL-10含量。结果该病毒株在6种细胞上皆能适应生长,并产生明显的细胞病变效应。病毒在Hela细胞上生长繁殖最快,42h时细胞全部发生病变,感染性滴度达8.625lgCCID50/ml;在MRC-5细胞上病毒的感染性滴度最低,120h才全部发生病变,感染性滴度为5.50lgCCID50/ml。该病毒对一日龄乳鼠致死并在脑、肺和心脏等组织产生病理改变,实验乳鼠血清IL-6、IL-10、TNF含量分别为4.71pg/ml、21.08pg/ml和36.79pg/ml,与阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）,其余4种皆无表达。该病毒对成鼠不致病,脑、肺、心脏病理检查无异常。结论 KMA103-09病毒在Hela细胞生长适应性良好,对乳鼠致病而对成鼠不致病。     

黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒感染心肌细胞内向整流钾电流的作用

目的探讨黄芪总黄酮（TFA）对嗜心性柯萨奇B3病毒（CVB3m）感染心肌细胞内向整流钾电流的作用,以明确TFA降低病毒性心肌炎小鼠心律失常发生率作用机制。方法采用体外培养小鼠新生心肌细胞方法,建立柯萨奇B3病毒感染心肌细胞模型,采用全细胞膜片钳记录技术记录心室肌细胞内向整流钾电流（IK1）。结果应用黄芪总黄酮（TFA））组与柯萨奇B3病毒感染模型组相比较,IK1峰值从（-10．11±1．57）nA增加到（-12．25±1．64）nA,差异有统计学意义（P〈0．05,n=6）。结论黄芪总黄酮可增加柯萨奇B3病毒感染心肌细胞内向整流钾电流（IK1）的幅值,这可能是黄芪总黄酮降低病毒性心肌炎小鼠心律失常发生率作用机制之一。     

重组柯萨奇B3病毒VP1基因的穿梭表达载体的构建及鉴定

目的　构建重组柯萨奇B3病毒VP1基因的细菌 -酵母菌穿梭表达载体pGBKT7-VP1。方法　用PCR从质粒pT7-CV3- 5 5中扩增柯萨奇B3病毒VP1基因 ,经NdeⅠ和PstⅠ双酶切后 ,定向插入细菌 -酵母菌穿梭表达载体 pG BKT7中完成质粒构建。用酶切和测序鉴定构建质粒。结果　限制性内切酶酶切和序列分析表明VP1巳成功插入pGBKT7载体的多克隆位点 ,克隆方向和阅读框与病毒VP1基因一致。结论　本研究成功构建VP1基因的细菌 -酵母菌穿梭表达载体 pGBKT7-VP1,为研究VP1蛋白与其宿主细胞之间的相互作用奠定了基础。     

利用直接原位PCR法探讨柯萨奇B3病毒与心肌炎的病原学关系

目的探讨柯萨奇B3病毒(CVB3)感染与急性心肌炎的病原学关系。方法应用生物素标记的核苷酸直接掺入法，建立了直接法原位逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，分别对感染的HeLa细胞、病毒性心肌炎鼠心肌样本及临床心肌炎的心肌活检标本中的CVB3进行检测。结果病毒感染的HeLa细胞可见阳性信号，细胞呈蓝紫色，而未感染的HeLa细胞无阳性信号，细胞不着色。在CVB3感染的病毒性心肌炎小鼠心肌组织中可检测到病毒RNA的存在。16例病理学及临床诊断为心肌炎的患者心肌组织中，7例检测到CVB3 RNA，而16例正常心肌标本中均为阴性。结论CVB3感染与心肌炎发病有密切关系。