沙雷菌CRISPR-Cas系统的基因结构分析

目的 CRISPR-Cas系统是细菌中的适应性免疫防御系统,能特异性阻止噬菌体、质粒等外源基因的侵袭从而维护自身基因组的完整性。本研究在基因组水平对沙雷菌属CRISPR-Cas系统的整体结构及主要特征进行分析。方法利用CRISPRfinder、BLAST在线工具及DNAstar、MEGA等软件分析CRISPR-Cas系统的分布、重复序列、间隔序列及cas1基因的特点,同时对基因组中的前噬菌体进行筛查并分析其与CRISPR-Cas系统的关系。结果 88株沙雷菌有19株(21.59%)含有确定CRISPR阵列,其中9株(10.22%)同时含有cas基因簇;CRISPR-Cas系统型别主要为Ⅰ-F和Ⅰ-E,cas1基因序列的发育分类与系统分型一致。12.3%的间隔序列可与某些噬菌体或质粒高度同源;含cas基因簇的沙雷菌中前噬菌体数量少于其他组(P0.01)。结论沙雷菌中CRISPR-Cas系统的携带率较其他细菌低且结构不完整,超过半数以孤儿CRISPR阵列形式存在。沙雷菌CRISPR-Cas系统对噬菌体有较强的防御能力,且该功能有赖于CRISPR-Cas系统结构的完整。     

葡萄球菌CRISPR-Cas系统的基因结构及其与耐药基因的关系

目的对分析葡萄球菌基因组中CRISPR-Cas系统基因结构,探讨其与细菌耐药性之间的关系。方法 CRISPRdb数据库中公布的154株及NCBI中下载的171株葡萄球菌基因组共包含20个种,利用生物信息学方法分析CRISPR分布情况、重复序列、间隔序列、cas基因及CRISPR存在与细菌mecA基因之间的关系。结果 325株葡萄球菌基因组中共发现196个确定的CRISPR结构和1757个可疑的CRISPR结构;有25株含有cas基因簇,可分为Ⅲ-A(占48.1%)和Ⅱ-C(占51.9%)两型;确定CRISPR阵列中重复序列数大多数为2,有14种重复序列可以形成茎环结构,遗传进化分析显示其大致可以分为3类。确定CRISPR阵列中437种间隔序列有53种匹配质粒或噬菌体,部分序列同时匹配多个质粒或噬菌体。cas基因簇存在和不存在时的mecA携带率分别为28.00%和54.15%,差异有统计学意义(χ~2=6.37,P0.05),两者呈负相关。结论葡萄球菌基因组中CRISPR-Cas系统携带率低,且基因座、cas基因的结构和功能均不完善,仅较少的菌株中含有完整的CRISPR-Cas系统,基因座中可疑结构较多,且DRs和spacer数量低于其他细菌。完整的葡萄球菌CRISPR-Cas系统可能限制mecA基因的水平转移。     

铜绿假单胞菌CRISPR/Cas系统的基因结构及其与耐药基因的关系北大核心CSCD

目的研究铜绿假单胞菌CRISPR/Cas系统基因结构及其与耐药基因的关系。方法收集95株铜绿假单胞菌的全基因组序列信息,通过CRISPRs web server获取CRISPR系统的信息。通过ClustalW进行重复序列和cas基因的比对分析,采用MEGA7构建cas1和cas3的系统发育树,通过RNAfold预测重复序列RNA的二级结构。通过GenBank数据库对间隔序列进行BLAST比对,并进行同源性分析。通过基因注释查找耐药相关基因,并分析其与CRISPR系统之间的关系。结果95株铜绿假单胞菌中,共发现130个确定的CRISPR位点,分布于58个菌株中,其中47个具有结构完整的CRISPR系统,30个I-F型,7个I-C型,6个I-E型,I-F型可以和I-C型或I-E型共存于同一株菌中;CRISPR位点共有18种重复序列,具有一定的保守性,基本均可形成保守的哑铃状RNA二级结构。不同类型CRISPR系统的cas基因组成不同,但均有cas1和cas3。cas1和cas3比较保守,可作为分型的依据。不同位点中间隔序列的长度和数量不同,2132个间隔序列中526个与噬菌体序列同源,32个与质粒序列同源。耐药基因分析显示,含CRISPR系统的菌株IntI1和OXA-10的携带率高于不含该系统菌株的携带率。结论铜绿假单胞菌基因组中CRISPR系统主要为-F型,其次为-E和-F型;同种类型CRISPR系统中的cas1和cas3基因高度保守;与间隔序列同源的外源基因主要为噬菌体,少数是质粒。CRISPR系统的存在与某些抗生素耐药相关基因的携带率有关。     

不动杆菌CRISPR系统基因结构的分析及其与耐药性关系的研究

目的研究不动杆菌CRISPR-Cas系统的基因结构并探讨其与耐药性的关系。方法收集CRISPR db数据库所有不动杆菌菌株序列信息,利用CRISPRfinder软件分析CRISPR基因座;通过MEGA软件对cas基因序列进行对比及系统进化分析;收集自GenBank中的菌株基因注释,查找相关耐药基因信息,分析其与CRISPR基因座之间的关系。结果 80株不动杆菌包含11个种,21.3%的菌株含有确定CRISPR基因座,26.5%的菌株只含可疑基因座。基因座位于染色体或质粒上。大部分不动杆菌的CRISPR系统属于I-F型,并且根据cas1、cas3、csy2、csy3、cas6/csy4基因序列及csy1基因的存在均可分为I-Fa和I-Fb两个亚型。不动杆菌CRISPR基因座中有14种不同的重复序列,长度为24~31bp,平均重复次数为53,且不同亚型间的重复序列不同,而同一亚型内保守性较高。无CRISPR系统的菌株中A类和D类β-内酰胺酶、乙酰转移酶、核苷酸转移酶及16SrRNA甲基化酶等耐药基因的携带率均显著高于有CRISPR系统菌株。结论不动杆菌CRISPR系统属于I-Fa和I-Fb型,cas3、csy2、csy3、csy4、cas1基因序列均可单独作为不动杆菌属CRISPR系统分亚型的依据;CRISPR基因座的存在可降低某些耐药基因的水平转移,而基因组中相对较低的CRISPR系统携带率可能是导致不动杆菌耐药率日趋增高及更易出现多重耐药的原因之一。     

大肠埃希菌CRISPRs间隔序列的来源研究

目的研究大肠埃希菌全基因组中规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPRs)的间隔序列分布及来源规律。方法通过BLAST、CRISPRs finder、ClustalX和CRISPRTarget分析CRISPR/Cas、间隔序列及其来源。结果 203株大肠埃希菌中74.4%含有I-E CRISPR/Cas,9.4%含有I-F CRISPR/Cas,17.2%存在CRISPR3-4;CRISPR1,CRISPR2,CRISPR3和CRISPR4的间隔序列数目范围分别为1-25、1-27、4-7和2-22;其独特间隔序列数目分别为339、346、57和66。CRISPRTarget分析I-E和I-F CRISPR/Cas的间隔序列分别匹配816条质粒和293条噬菌体,2 428条质粒和139条噬菌体,差异有统计学意义(χ~2=319.30,P0.01)。结论大肠埃希菌中CRISPR/Cas分布广泛,I-E和I-F CRISPR/Cas可能发挥不同的免疫功能。     

大肠埃希菌CRISPRs间隔序列的来源研究北大核心CSCD

目的研究大肠埃希菌全基因组中规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPRs)的间隔序列分布及来源规律。方法通过BLAST、CRISPRs finder、ClustalX和CRISPRTarget分析CRISPR/Cas、间隔序列及其来源。结果 203株大肠埃希菌中74.4%含有I-E CRISPR/Cas,9.4%含有I-F CRISPR/Cas,17.2%存在CRISPR3-4;CRISPR1,CRISPR2,CRISPR3和CRISPR4的间隔序列数目范围分别为1-25、1-27、4-7和2-22;其独特间隔序列数目分别为339、346、57和66。CRISPRTarget分析I-E和I-F CRISPR/Cas的间隔序列分别匹配816条质粒和293条噬菌体,2 428条质粒和139条噬菌体,差异有统计学意义(χ~2=319.30,P<0.01)。结论大肠埃希菌中CRISPR/Cas分布广泛,I-E和I-F CRISPR/Cas可能发挥不同的免疫功能。     

O157:H7型大肠埃希菌CRISPR结构及耐药基因和毒力基因分布分析

目的了解O157:H7型大肠埃希菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)结构特征以及耐药基因和毒力基因分布情况。方法利用多序列比对、BLAST、RNA二级结构预测等多种生物信息学方法对20株O157:H7型大肠埃希菌的全基因组序列进行分析。结果从GenBank数据库获得2000-2014年20株O157:H7型大肠埃希菌全基因组序列,所有基因组中共存在3个CRISPR位点且每个CRISPR位点的基因序列具有高度一致性(均超过99.7%);CRISPR2被一段序列分隔为CRISPR2a和CRISPR2b;CRISPR1中存在3个不同的间隔序列,CRISPR2也有3个不同的间隔序列,CRISPR3有1个间隔序列;CRISPR1和CRISPR3的重复序列均可形成茎环结构,CRISPR2和CRISPR1的重复序列具有较高的一致性。共检测7个耐药基因,所有菌株ampc均阳性,4株菌株tetB和sul1阳性,其它4个基因均未检出;共检测6个毒力基因,有10株细菌stx1阳性,其他5个毒力基因20株细菌均阳性。结论 CRISPR在O157:H7型大肠埃希菌中广泛分布且结构稳定,毒力基因分布广,耐药性问题不可忽视。     

健康人肠道中肺炎克雷伯菌携带blaNDM-1耐药质粒并介导抗性转移

目的 通过探究健康人群肠道中携带的bla_NDM-1基因的肺炎克雷伯菌的基因组特征,明确健康人肠道定植菌及病原菌的耐药基因组,建立以耐药质粒基因组完成图为基础的耐药质粒监管体系。方法 对健康人群肠道耐药菌监测中携带bla_NDM-1基因的肺炎克雷伯菌开展抗菌药物敏感性实验,同时进行二代和三代测序以获得菌株及质粒全基因组完成图,利用核心基因组及泛基因组方法对该株菌进行序列比对分析,并进行接合转移实验确定质粒转移效率及最优转移条件。结果 基于完成图的序列分析,发现本研究中所获得的肺炎克雷伯菌与来自公共数据库中的临床感染患者的菌株属于同一流行克隆,提示该克隆既可以引起人体感染,也可定植在健康人肠道内。明确bla_NDM-1基因所在质粒为IncX3型,是易于携带bla_NDM-1基因的流行质粒,泛基因组分析发现该类质粒可以突破宿主菌的种属屏障进行跨宿主传播;接合转移实验显示该质粒可转移、介导高水平的碳青霉烯类抗生素耐药性的传递。结论 携带bla_NDM-1基因的肺炎克雷伯菌可以在健康人肠道中定植...     

不同来源金黄色葡萄球菌的全基因组序列分析北大核心CSCD

目的了解不同来源金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)的全基因组序列基本特征,探究菌株的分子分型、耐药基因型、毒力及其遗传进化关系。方法应用solexa高通量测序技术对10株医源性和食源性代表株金葡菌进行全基因组测序,以此进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、金葡菌a蛋白(Staphylococcus aureus protein A,spa)基因分型分析,并比较分析不同菌株基因组中携带耐药基因和毒力因子,筛选核心基因,构建系统进化树。结果10株金葡菌染色体基因组大小相似,均为2.7Mbp,包含有2486~2648个基因不等,平均长度约为887bp。耐药基因注释分析显示9株甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)携带的耐药基因少于另一株耐甲氧西林金葡菌(MRSA)。尽管在不同菌株基因组之间的毒力因子数量无显著区别,但不同菌株存在的毒力因子却不同,食品来源金葡菌基因组携带1~4种数量不等的肠毒素基因。进化树分析显示不同来源金葡菌位于不同进化分支,2株为ST8型的MSSA和MRSA进化亲缘性较高,属于同一进化分支内。结论获得10株不同来源金葡菌的全基因组序列数据,并证实食源性或医院来源金葡菌为了适应不同生存环境,通过不同分子进化机制,获得不同耐药基因和毒力因子,形成菌株特定的分子遗传特征,可为金葡菌的分子流行病学和致病性机制研究提供参考依据。     

奶牛粪便分离的伊氏李斯特菌伊氏亚种基因组序列测定及其分子特征分析

目的 了解某奶牛场奶牛粪便中李斯特菌的携带情况及其分离株的遗传特征。方法 用ISO 11290方法分离196份奶牛粪便样本中的李斯特菌,对分离的伊氏李斯特菌进行全基因测序,用MEGA6.0构建系统发育树,网站在线比对分析伊氏李斯特菌株的毒力基因、耐药基因及前噬菌体等。结果 196份奶牛场养殖的奶牛粪便样本中有9份样本为李斯特菌阳性,其中3株为伊氏李斯特菌伊氏亚种,6株为英诺克李斯特菌,分离率分别为1.53%和3.06%。3株伊氏李斯特菌伊氏亚种分离株具有包括LIPI-1和LIPI-2在内的绝大部分致病性李斯特菌毒力相关基因,携带一个不完整的前噬菌体及22个耐药相关基因。结论 养殖场奶牛粪便中携带伊氏李斯特菌伊氏亚种。对伊氏李斯特菌伊氏亚种分离株的全基因组、毒力基因、耐药基因、前噬菌体基因等遗传特征分析,为进一步分析其致病性提供了参考。     

霍乱弧菌新类型溶源性噬菌体nct-CTX~(O139)ф基因组RS区及rstR-ig2基因的功能研究

霍乱弧菌CTXφ基因组RS区的间隔区ig2包括rstR启动子区和rstA操纵区,rstR基因编码产物RstR可以和rstA操纵区结合,抑制rstA基因表达,RS区负责噬菌体的复制、整合和解离等功能。我们克隆并测序了nct- CTX~(O139)φ基因组,RS区的rstR和ig2为首次发现的新类型,故进行上述功能研究。材料与方法一、菌株和质粒霍乱弧菌O1群EI Tor 7763株,不含CTXφ基因组任何基因,具有噬菌体基因组整合位点attRS；pNCT-RZ克隆子,含nct_CTX~(O139)φ基因组；大肠埃希菌HB101和JM109,自杀质粒pKTN701和受体菌SM10；上述菌株和质粒均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所保存。     

CRISPR-Cas系统在结核分枝杆菌研究中的应用进展

成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和他们相关的蛋白(Cas)组成了一个新的分布于结核分枝杆菌(MTB)的获得性免疫防御系统。此外,CRISPR-Cas系统与MTB的毒力、耐药以及定向基因编辑方面可能存在重要的关系。笔者主要通过对CRISPR-Cas系统在MTB的免疫作用及其相关研究进展进行综述,以期为进一步研究MTB致病性和抗结核治疗提供一种新思路。     

鼠疫耶尔森菌的分子生物学研究进展

1 基因组结构、基因转移系统和调控 野生型鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)和假结核耶尔森菌的染色体高度相关,而与小肠炎耶尔森菌关系并非如此密切。Y.pestis的基因组大小约为4 380±135Kb,GC比为46％～47％,尽管有噬菌体存在,但尚未发现原噬菌体和质粒的接合与转导能力。绝大多数分子生物学技术适用于Y.pestis已经可以用结合质粒和一些噬菌体完成遗传转移试验。已用标准技术完成了质粒的分离、转座子和噬菌体插入及融合突变。尽管Y.pestis的一般转化效率非常低,但电转移质粒是极为成功的。根据λ噬     

铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株的构建

目的 构建铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。方法 分别以质粒pUCGM和铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板PCR扩增庆大霉素抗性基因(GM)和铜绿假单胞菌clpP基因及其3'、5'侧翼序列,将clpP基因及其3'、5'侧翼序列克隆至pMD19T载体, EcoRV切除clpP基因37 bp~453 bp片段后,引入庆大霉素抗性基因,构建重组质粒pCKR2;EcoRⅠ/HindⅢ双酶切重组质粒pCKR2,回收FclpP-GM-clpPR片段,与自杀质粒pEX18Tc连接,得到clpP基因缺陷的同源重组载体pCKR3;将pCKR3质粒转化大肠埃希菌SM10,与铜绿假单胞菌PAO1双亲杂交,庆大霉素筛选得到铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。结果 经酶切鉴定同源重组载体pCKR3构建正确;PCR和DNA测序鉴定铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株构建成功。结论 本研究成功敲除了铜绿假单胞菌clpP基因,为进一步研究clpP基因的生物学功能奠定了基础。     

沙雷菌裂解性噬菌体PS2生物学特性及其全基因组测序

目的明确一株粘质沙雷菌裂解性噬菌体PS2的生物学特性及全基因组序列。方法电镜观察PS2的形态;双层平板法分析PS2噬菌谱、生长曲线及理化稳定性;采用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit提取噬菌体基因组,酶解作用鉴定基因组类型;构建噬菌体PS2测序文库,采用MiSeqTM系统测序,Velvet 1.2.08进行序列拼接。结果 PS2为肌尾型噬菌体。其感染S2菌株的潜伏期为21min,爆发量为70PFU。PS2在pH5到pH10的环境中具有较好的稳定性,在50℃和60℃的环境中活性也无明显变化。PS2基因组为双链DNA,全长167 266bp,平均GC含量为41.7%,共预测到276个ORF。BLASTN初步比对结果提示其与多株T4-like噬菌体基因组核酸序列具有显著相似性。结论分离鉴定了一株粘质沙雷菌属噬菌体,进行了生物学特性、全基因组测序和生物信息学初步分析,为噬菌体治疗多重耐药细菌及噬菌体生物信息学深入分析奠定了基础。     

恶性疟原虫海南株STARP基因真核表达重组质粒的构建及基因结构分析

目的 构建恶性疟原虫海南（RCC1／HN株）STARP基因真核表达重组质粒pcDNA3-STARP;分析STARP基因结构,并了解FCC1／HN株与其它分离株STARP基因序列的差异。方法 根据STARP基因已知序列设计合成两对引物,用PCR技术从RCC1／HN株基因组DNA中扩增两个部分序列重叠的STARP基因片段;将两基因片段分别双酶切后定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。酶切,PCR扩增鉴定筛选重组质粒阳性克隆;用双脱氧链末端终止法测序,应用软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果 分别PCR扩增获得1078bp,1092bp的两个STARP基因片段;经双酶切及PCR鉴定表明获得正确重组质粒;恶性疟原虫FCC1／HN株与T9／96株STARP基因核苷酸序列同源性92．2％;推测编码氨基酸序列同源性为90．9％;在STARP蛋白中部重复区推测有多个明显的抗原表位区段。结论 从FCC1／HN株恶性疟原虫基因组DNA中获取STARP基因,并成功构建真核表达重组质粒pcDNA3－STARP;FCC1／HN株与其它分离株STARP基因有高度的同源性。     

利用分子生物学技术对鼠疫耶尔森菌的分类鉴定

目的 对4株可疑菌株进行系列验证实验,以确定其是否为鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)自然分离株.方法 用鼠疫细菌学常规方法和分子生物学手段确定其生物学表型特征、特异性基因及基因组特征.结果 4株菌具备鼠疫菌的典型形态特征;能被鼠疫噬菌体完全裂解;主要生化特性为阿胶糖(+)、鼠李糖(-)、麦芽糖(+)、蜜二糖(-)、甘油(-)、脱氮(+),与鼠疫菌同源菌株菌苗株(EV76)一致;其毒力因子为F1(+),VW(+),Pgm(-),PstⅠ(+),与鼠疫菌菌苗株(EV)特征完全一致;109个/ml可疑菌对实验动物小白鼠无致死能力.具有鼠疫标识基因;差异片段(DFR)分型结果,4株菌的24个DFR扩增,DFR谱不同于任何鼠疫菌自然分离菌株基因组型.结论 尽管4菌株具备鼠疫菌自然分离株的一些表型特征,但基因组特征表明其不是鼠疫菌自然分离株,而是鼠疫菌同源菌株菌苗株(EV菌).     

对1株疑似鼠疫耶尔森氏菌的系统鉴定

目的对1株可疑菌株进行系列验证实验,以确定其是否为鼠疫耶尔森氏菌（以下简称鼠疫菌）。方 法用鼠疫细菌学常规方法和分子生物学手段确定其生物学表型特征、特异性基因及基因组特征。结果该菌 株具备鼠疫菌的典型形态特征;能被鼠疫噬菌体完全裂解;主要生化特性为阿胶糖（＋）、鼠李糖（－） 、麦芽糖（＋）、蜜二糖（－）、甘油（＋）、脱氮（+）,与典型鼠疫菌一致。毒力因子检查结果为均 为阴性;对实验动物小白鼠完全无致死能力。全基因组芯片杂交实验和PCR扩增表明55023菌株没有鼠疫菌 的三个质粒;也不具鼠疫标识基因;pgm位点代表性基因YPO1954扩增阳性,YPO1908扩增阴性,表明其pgm 位点不完整;差异片段（DFR）分型结果表明该菌株缺失了14个DFR,不符合鼠疫菌的特征;多位点序列分 型（MLST）分析结果表明该菌株与鼠疫存在16个碱基的差异,而与血清III型假结核耶尔森氏菌仅相差两 个碱基。结论尽管55023菌株具备鼠疫菌的一些表型特征,但基因组特征表明其不是鼠疫菌,而可能是血 清III型的假结核耶尔森氏菌;噬菌体裂解结果等表型不能作为鼠疫菌鉴定的最终标准。     

卡介苗ERP基因缺失突变株的构建

目的构建卡介苗ERP基因缺失突变株。方法分别设计两对引物,通过聚合酶链反应（PCR）的方法扩增ERP基因两侧的2个目的片段,分别插入pKO质粒中,构建基因敲除质粒pKO-ERP,电转入至卡介苗菌株细胞内并与BCG基因组中的ERP基因同源交换,筛选出ERP基因敲除菌株。结果通过2次PCR筛选和1次蔗糖反筛选后得到的、并在含潮霉素培养基上不能生长的菌株为ERP基因敲除菌株。结论 pKO质粒可作为基因敲除有用的质粒载体,成功构建了卡介苗ERP基因缺失突变株。     

艰难梭菌快速分子诊断方法的建立北大核心CSCD

目的建立用于快速检测艰难梭菌感染的聚合酶链式反应(PCR)和环介导等温扩增(LAMP)方法。方法收集有艰难杆菌感染症状患者的粪便样品,经CCFA选择性培养基筛选和VITEK MS飞行时间质谱仪分析获得艰难梭菌菌株;利用BLAST分析得到艰难梭菌特异性基因,以此为模板建立、优化并验证艰难梭菌PCR检测和LAMP检测方法。结果筛选得到3株产毒艰难梭菌,经数据分析获得艰难梭菌的两个特异性基因FliM和假定蛋白基因(hypothetical protein)。分别建立Flim基因的PCR检测方法和检测假定蛋白基因的LAMP方法,检测下限均达到了100个质粒/μl,且无非特异性扩增。结论 PCR法和LAMP法成本低,快速灵敏、特异性好,可用于艰难梭菌感染的快速检测。