慢病毒介导NEP1-40及NT-3双基因转染神经干细胞的实验研究

目的通过慢病毒载体将NEP1-40(Nogo extracellular peptide residues 1-40)及神经营养因子_3(neurotrophin 3,NT-3)双基因转染入神经干细胞(neural stem cells,NSC_s)内进行表达,探讨NEP1-40及NT-3双基因转染NSC_s的可行性,为NSC_s体内实验奠定基础。方法将SD大鼠胚胎室管膜区NSC_s采用空载慢病毒载体(A组)、NEP1-40慢病毒载体(B组)、NT-3慢病毒载体(C组)及NEP1-40和NT-3慢病毒载体(D组)进行转染,以未转染病毒的细胞作为对照组(E组)。用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为5、10、15的慢病毒载体分别转染24、48、72 h,荧光显微镜观察转染后细胞内荧光表达情况,确定慢病毒载体的最佳MOI和收样时间。再分别通过实时荧光定量PCR及Western blot,检测转染后细胞中NEP1-40及NT-3基因的表达,以及细胞和培养基中NEP1-40及NT-3蛋白的表达。结果荧光显微镜观察示,MOI为10时NEP1-40和NT-3基因慢病毒载体在NSC_s内转染率最高,最佳时间为转染48 h时。实时荧光定量PCR及Western blot检测示,B、D组NEP1-40 m RNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著高于A、C组,差异有统计学意义(P0.05);A、C组间及B、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)。C、D组NT-3 m RNA相对表达量和蛋白相对表达量均显著高于A、B组,差异有统计学意义(P0.05);A、B组间和C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论通过慢病毒载体可将NEP1-40及NT-3双基因成功转染入NSC_s内,在NSC_s内稳定表达,且两种目的基因在表达过程中无相互拮抗或促进作用。     

BMSCs条件培养基改善地塞米松对成骨细胞成骨功能抑制效应的研究

目的探讨BMSCs的旁分泌作用对地塞米松所致成骨细胞成骨功能抑制作用的影响。方法首先通过培养小鼠BMSCs 24 h制备无血清条件培养基备用。将小鼠MC3T3-E1细胞株复苏并传至第3代用于实验,分为4组:A组为对照组;B组于细胞中添加1μmol/L地塞米松;C组于细胞中按1∶1比例添加1μmol/L地塞米松和BMSCs条件培养基;D组仅添加BMSCs条件培养基。培养24 h后收集细胞测定ALP含量,Western blot测定细胞内RUNX2、骨钙素(Osteocalcin)蛋白表达,实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR)测定细胞内α1-Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ-α1,COL1A1)、RUNX2、ALP、Osteocalcin基因表达;21 d后行茜素红染色观察钙结节形成情况。结果培养24 h后,B、C、D组ALP含量均显著低于A组,B组低于C、D组(P0.05),C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。Western blot检测示,B组RUNX2蛋白相对表达量显著低于A、C、D组(P0.05),A、C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05);B组Osteocalcin蛋白相对表达量均显著低于A、C、D组,A、C组低于D组(P0.05),A、C组间差异无统计学意义(P0.05)。RT-q PCR检测示,B、C、D组RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因相对表达量均显著低于A组(P0.05);D组RUNX2、Osteocalcin、ALP基因相对表达量均显著高于B、C组,C组显著高于B组(P0.05);D组COL1A1基因相对表达量显著高于B组(P0.05),B、C组间及C、D组间比较差异均无统计学意义(P0.05)。培养6 d时A组细胞死亡;21 d时B、C、D组均可见钙结节阳性染色,且逐渐增强。结论小鼠BMSCs条件培养基能改善地塞米松对成骨细胞成骨功能的抑制效应。     

混合共培养条件下骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞成骨性能分析

目的探讨混合共培养条件下骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)和脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSC)成骨分化潜能变化。方法无菌条件下获取BMSC和ADSC,纯化后倒置显微镜下观察细胞形态,对两种细胞分别进行成脂肪诱导、成软骨、成骨诱导,分别利用油红O染色、甲苯胺蓝染色、茜素红染色进行鉴定。实验分四组:A组:BMSC+ADSC未诱导(BMSC︰ADSC=1︰1);B组:BMSC诱导组;C组:ADSC诱导组;D组:BMSC+ADSC诱导组(BMSC︰ADSC=1︰1)。诱导组采用成骨诱导液进行成骨诱导,体外培养14d后Real-time PCR检测骨钙素(osteocalcin,OCN)及Runt相关转录因子2(Runx-2)基因表达情况,以及通过Western-blot法检测OCN及Runx-2蛋白表达情况。结果两种细胞在体外诱导后油红O染色、甲苯胺蓝染色、茜素红染色均为阳性,q-PCR结果显示D组OCN及Runx-2表达量明显高于A、B、C组(P0.05),Westernblot结果显示OCN及Runx-2蛋白表达量D组明显高于其他三组P0.05)。结论 BMSC与ADSC在体外混合共培养条件下可促进干细胞的成骨性能。     

低氧与低氧模拟剂对BMSCs成骨分化影响的对比研究

目的对比低氧培养与常氧条件下低氧模拟剂二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxalylglycine,DMOG)对小鼠BMSCs成骨分化的影响。方法原代分离培养健康3~4周龄昆明小鼠BMSCs,采用流式细胞术对细胞CD29、CD44、CD90、CD34表面标志进行检测,行成骨、成脂、成软骨诱导分化染色鉴定。取第3代BMSCs分为对照组(A组,常氧条件下培养)、低氧培养组(B组,1%O2低氧条件下培养)及DMOG干预组(C组,常氧条件下加入0.5 mmol/L DMOG培养)。分别于培养1、2、3、4 d采用MTT法检测BMSCs增殖情况,7、14 d检测ALP含量,24 h后采用Western blot法检测低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)蛋白表达,3、7 d采用实时荧光定量PCR检测RUNX2、Osterix基因表达,21 d行茜素红染色观察。结果 BMSCs流式细胞术表面标志鉴定示CD29(+)、CD44(+)、CD90(+)、CD34(-);成骨、成脂、成软骨诱导分化后茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色均呈阳性。MTT法检测示,培养1 d,3组细胞增殖比较差异无统计学意义(P0.05);2、3、4 d,与A组比较,C组均抑制细胞增殖,但差异无统计学意义(P0.05);而B组则促进细胞增殖,差异有统计学意义(P0.05)。培养各时间点,B、C组ALP含量、HIF-1α蛋白相对表达量及RUNX2、Osterix基因相对表达量均显著高于A组,ALP含量及RUNX2、Osterix基因相对表达量C组高于B组,而HIF-1α蛋白相对表达量B组高于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。培养21 d茜素红染色示,A组可见少许结节状红染物质,B组可见中等量红染物质,而C组可见大量红染物质。结论低氧能明显促进BMSCs增殖,DMOG对BMSCs增殖无明显影响;低氧与DMOG均能促进BMSCs成骨分化,且DMOG促BMSCs成骨分化能力更强。     

谷胱甘肽在激素诱导的BMSCs功能失调中的作用

目的探讨抗氧化剂谷胱甘肽(glutathione,GSH)对激素诱导的人BMSCs成脂、成骨关键因子表达水平的影响。方法取3例股骨颈骨折患者股骨近端骨髓,采用密度梯度离心联合贴壁法进行BMSCs的分离、培养和纯化。取第3代BMSCs分为5组:A组,单纯BMSCs组(1×10~5个/mL);B组,BMSCs(1×10~5个/mL)+10μmol/L地塞米松;C组,BMSCs(1×10~5个/mL)+10μmol/L地塞米松+5μmol/L GSH;D组,BMSCs(1×10~5个/mL)+10μmol/L地塞米松+10μmol/L GSH;E组,BMSCs(1×10~5个/mL)+10μmol/L地塞米松+50μmol/L GSH。培养7 d,采用流式细胞仪检测细胞内活性氧水平,RT-PCR检测细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(Catalase)mRNA表达水平,实时荧光定量PCR检测成脂转录因子过氧化物酶体增殖激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorsγ,PPAR-γ)、CCAAT增强结合蛋白(CCAAT/enhancer-binding family of proteins,C/EBP)和成骨转录因子Runx2、ALP基因表达情况;培养21 d,采用油红O染色观察细胞成脂分化情况,Western blot检测相关蛋白表达水平。结果 B组细胞内活性氧水平显著高于其余各组,C组高于A、D、E组,D、E组高于A组(P0.05);D、E组间比较差异无统计学意义(P0.05)。B组油红O染色阳性细胞明显多于其余各组,C、D、E、A组依次减少,各组吸光度(A)值比较差异均有统计学意义(P0.05)。RT-PCR检测示,B组SOD和Catalase mRNA相对表达量较其余各组显著降低,C组低于A、D、E组(P0.05);A、D、E组间比较差异无统计学意义(P0.05)。实时荧光定量PCR检测示,B组PPAR-γ、C/EBP m RNA相对表达量显著高于其余各组(P0.05);C组高于A、D、E组,D、E组高于A组,差异均有统计学意义(P0.05);D、E组间比较差异无统计学意义(P0.05)。B组Runx2、ALP m RNA相对表达量显著低于其余各组,C组低于A、D、E组,D、E组低于A组,差异均有统计学意义(P0.05);D、E组间比较差异无统计学意义(P0.05)。Western blot检测示,B组PPAR-γ、C/EBP蛋白相对表达量较其余各组显著提高,C、D、E、A组呈逐渐下降趋势,组间比较差异均有统计学意义(P0.05);B组Runx2、ALP蛋白相对表达量较其余各组显著下降,C、D、E、A组呈逐渐上升趋势,组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 GSH可通过降低细胞内活性氧水平抑制人BMSCs成脂分化,增强成骨分化;在一定范围内,GSH浓度越高,效果越明显。     

BMP-14联合Noggin shRNA共转染对脂肪来源干细胞成骨分化能力的影响

目的在体外环境下同时下调细胞中Noggin基因和增加BMP-14基因,观察对脂肪来源干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)成骨分化能力的影响。方法取健康成年SD大鼠5只,体质量250~300 g,采用Ⅰ型胶原酶消化法获取原代ADSCs,体外培养、扩增。使用慢病毒载体将目的基因转染大鼠ADSCs,根据目的基因不同将实验分为3组,A组为空载体病毒Lv-增强型绿色荧光蛋白转染对照组,B组为Lv-BMP-14转染组,C组为BMP-14+Noggin sh RNA转染组。分别于转染后3、7、14 d,采用实时荧光定量PCR检测BMP-14及成骨相关基因[Ⅰ型胶原、ALP、骨钙素(osteocalcin,OCN)]的表达,转染后14 d采用茜素红染色鉴定其成骨分化能力。结果转染后3 d,各组BMP-14 m RNA相对表达量比较差异无统计学意义(P0.05);7、14 d,C组BMP-14 m RNA相对表达量高于A、B组,B组高于A组,比较差异均有统计学意义(P0.05)。转染后3 d,C组各成骨相关基因m RNA相对表达量显著高于A、B组(P0.05);A、B组间比较差异无统计学意义(P0.05)。转染后7、14 d,C组各成骨相关基因m RNA相对表达量显著高于A、B组,B组高于A组,除转染后7 d A、B组间Ⅰ型胶原m RNA相对表达量比较差异无统计学意义(P0.05)外,其余各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。转染后14 d茜素红染色示,A、B、C组钙结节量呈递增趋势。结论 BMP-14具有增强大鼠ADSCs向成骨细胞分化的能力;沉默细胞中的Noggin基因、联合BMP-14基因共同作用于大鼠ADSCs,其体外成骨分化能力明显强于BMP-14单基因转染,两者有显著的协同作用。     

基于血管化机制构建萎缩型骨不连类器官芯片与初步实验研究

目的构建基于血管化机制的骨不连类器官芯片, 并探讨无菌性骨不连发生机制。方法设计半开放微流控芯片, 实现人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stromal cells, BMSC)、人胚肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast 1, HFL1)与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)共培养, 建立三维器官芯片体系。设置HFL1与HUVEC不同比例与BMSC共培养, 分为对照组(HFL1∶HUVEC=1∶1)、纤维化组(HFL1∶HUVEC=3∶1)与血管化组(HFL1∶HUVEC=1∶3)。通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、茜素红(alizarin red)染色观察BMSC成骨分化情况, qPCR分析成骨标志基因SP7、RUNX2、ALPL、BGLAP及血管化相关基因KDR、VWF转录情况, Western blot检测成骨标志蛋白RUNX2和ALP表达水平。结果 BMSC、HFL1和HUVEC共培养体系中BMSC正常生...     

不同机械牵伸条件对大鼠肌腱干细胞分化的影响

目的探讨不同机械牵伸条件对肌腱干细胞(tendon stem cells,TSCs)分化的影响,寻求TSCs成肌腱分化、成骨分化以及成脂肪分化的最佳单轴循环牵伸载荷。方法取8周龄雄性SD大鼠跟腱,采用酶消化法分离培养TSCs。取第3代TSCs,随机分为不同牵拉条件组(实验组A~D组)及静态培养组(对照组E组),其中A组牵拉强度4%、频率1 Hz,B组牵拉强度4%、频率2 Hz,C组牵拉强度8%、频率1 Hz,D组牵拉强度8%、频率2 Hz。利用课题组自行研发的体外细胞单轴循环牵拉设备,沿培养皿长轴对A~D组细胞进行单轴循环机械牵伸,E组细胞行静态培养。分别处理12、24、48 h后收集各组细胞,采用实时荧光定量PCR检测成腱分化相关基因Scleraxis(SCX)、抗细胞黏合素C(Tenascin C,TNC),成脂肪分化相关基因CCAAT/增强子结合蛋白-α(CCAAT-enhancer-binding protein-α,CEBPα)、脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase,LPL)及成骨分化相关基因RUNX2、远端缺失基因5(distal-less homeobox 5,DLX5)的表达;Western blot检测TNC、CEBPα及RUNX2蛋白表达。结果实时荧光定量PCR检测示:SCX、TNC m RNA相对表达量在B组牵拉24 h时显著高于其余各组,差异有统计学意义(P0.05);CEBPα、LPL m RNA相对表达量在D组牵拉48 h时显著高于其余各组,差异有统计学意义(P0.05);RUNX2、DLX5 m RNA相对表达量在C组牵拉24 h时显著高于其余各组,差异有统计学意义(P0.05)。Western blot检测示:B组牵拉各时间点TNC蛋白表达均高于E组(P0.05),同时牵拉24 h与E组相比CEBPα表达有显著抑制作用(P0.05);C组牵拉24 h RUNX2蛋白表达显著高于E组(P0.05),同时牵拉24、48 h TNC蛋白表达显著低于E组(P0.05);D组牵拉48 h CEBPα蛋白表达显著高于E组(P0.05),TNC蛋白表达显著低于E组(P0.05),RUNX2蛋白表达与E组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论机械力学刺激可以促进TSCs发生分化,而且不同条件的牵拉载荷会引起不同方向分化。4%、2 Hz牵拉24 h为成腱分化最佳条件,8%、1 Hz牵拉24 h为成骨分化最佳条件,8%、2 Hz牵拉48 h为成脂肪分化最佳条件。     

环指蛋白11调控Akt信号通路促进BMSCs成骨分化的机制研究北大核心CSCD

目的研究BMSCs成骨分化过程中环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)对Akt信号通路的调节作用,为进一步阐明BMSCs成骨分化机制和用于临床治疗提供思路。方法从健康人体新鲜骨髓中分离培养BMSCs并传代,取第4代细胞经流式细胞术,成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定后用于实验。BMSCs成骨诱导分化培养0~14 d,通过茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,并用Western blot法检测RNF11蛋白表达。取第4代BMSCs,分为空白对照组(A组)、空载慢病毒(Lv-NC)组(B组)和敲低RNF11(Lv-ShRNF11)组(C组),成骨诱导分化培养0~14 d,采用Western blot检测RNF11蛋白表达,茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,14 d实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测BMSCs成骨标志物Runx2、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测Akt、Smad1/5/8及β-catenin信号通路蛋白相对表达量,以磷酸化前后比值表示。为研究RNF11对Akt信号通路的影响机制,取第4代BMSCs分为Lv-NC转染组(A1组)、Lv-ShRNF11转染组(B1组)和添加Akt信号通路激活剂SC79的Lv-ShRNF11转染组(C1组),14 d时采用Western blot检测RNF11和Akt信号通路蛋白相对表达量,茜素红染色、ALP染色及qRT-PCR检测成骨相关指标。结果流式细胞术及成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定显示分离培养细胞为BMSCs。RNF11蛋白相对表达量随成骨分化时间延长而逐渐增加(P<0.05);下调RNF11后,茜素红和ALP染色示C组相较于A、B组BMSCs成骨分化程度降低,qRT-PCR检测示Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量减少(P<0.05)。随成骨分化时间延长,RNF11与Akt信号通路蛋白相对表达量均上升(P<0.05)。下调RNF11后,C组相较于A、B组,其Akt信号通路蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),而对Smad1/5/8以及β-catenin信号通路蛋白相对表达量无明显影响(P>0.05)。B1、C1组相较于A1组,其RNF11蛋白相对表达量减少(P<0.05),B1组相较于A1、C1组,其Akt信号通路蛋白相对表达量降低(P<0.05);茜素红与ALP染色示C1组BMSCs成骨分化程度稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05);qRT-PCR检测示C1组Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05)。结论RNF11通过正向调控Akt信号通路激活水平促进BMSCs向成骨细胞分化。RNF11可作为提高BMSCs修复骨缺损疗效以及治疗骨代谢病的潜在靶点。     

锶盐联合淫羊藿苷对大鼠骨髓基质干细胞成骨及成脂分化影响的研究

[目的]探索锶盐联合淫羊藿苷对超生理剂量糖皮质激素作用下大鼠骨髓基质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨、成脂分化的影响,并探讨Wnt/β-catenin信号通路在其中的调控作用。[方法]采用全骨髓培养法获取1周龄SD大鼠乳鼠MSCs,传至第3代时分为对照组、激素(终浓度:10-6mol/L)组、激素+淫羊藿苷(终浓度:10μg/L)组、激素+雷奈酸锶(终浓度:3 mmol/L)组及激素+淫羊藿苷+雷奈酸锶组。培养满21 d后进行HE、油红O、茜素红及ALP染色检测,RT-PCR检测Wnt信号通路相关因子(DKK-1、Wnt7b、GSK-3β、β-catenin、Runx-2和PPAR-γ2)基因的mRNA相对表达量。所有实验重复3次。[结果]所有组的细胞培养至21 d后,油红O染色结果显示激素组低倍镜下出现片状红染区,高倍镜下可见红染圆形脂滴,明显多于其他组;茜素红染色结果显示激素组未见明显紫红色阳性区域,而其他组可见片状阳性区域,由集落为中心放射性向四周生长,明显多于激素组,且联合组的阳性结果更明显;ALP染色结果显示激素组未见明显紫色阳性区域,而其他组可见片状阳性区域,明显多于激素组;RT-PCR结果显示激素组的Wnt相关因子(Wnt7b、GSK-3β和β-catenin)及成骨相关因子Runx-2显著低于其他组(P0.05),而激素组的Wnt信号通路特异性抑制因子DKK-1及成脂相关因子PPAR-γ2显著高于其他组(P0.05)。[结论]超生理剂量地塞米松可以通过抑制Wnt信号通路,诱导MSCs成脂分化,抑制其成骨分化,这可能与激素诱发股骨头坏死的发生、发展密切相关。而淫羊藿苷及锶盐可以在一定程度上减少超生理剂量糖皮质激素对Wnt信号通路的抑制作用,进而促进MSCs成骨分化、抑制其成脂分化,且二者联合应用的效果更好,这为研究激素性股骨头坏死早期防治提供了新的思路及方法。     

联合转染人VEGF165和ANG-1双基因对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]研究联合转染入血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管紧张素-1(ANG-1)双基因对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化潜能的影响.[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,获得腺病毒载体pAd-VIA,将其体外转染大鼠BMSCs,应用诱导培养液定向诱导向成骨细胞分化.实验分为4组:A.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs并诱导组;B.BMSCs诱导组;C.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs组;D.单纯BMSCs组.通过碱性磷酸酶(ALP)染色和活性的测定、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色来评价联合转染双基因对BMSCs成骨分化潜能的影响.[结果]重组腺病毒质粒pAdVIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,有大量的绿色荧光蛋白表达,体外转染大鼠BMSCs后,A、B组的ALP染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色为阳性,而C组和D组为阴性.ALP活性表达具有时间相关性,3 d开始表达,7 d到达高峰,在7、14 d,A、B组与C、D组之间ALP表达均具有统计学差异(P＜0.01),A组和B组之间,在各个时间点均无统计学差异(P＞0.05).[结论]腺病毒载体pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,未明显影响其体外成骨分化潜能.     

慢病毒介导骨形成蛋白-2基因转染骨髓间质干细胞修复大鼠颅骨骨缺损

目的 观察携带人骨形成蛋白-2(hBMP-2)基因的慢病毒(lentivirus)转染骨髓间质干细胞构建的组织工程化骨对大鼠颅骨极量骨缺损的修复效果. 方法 300～350g雄性 SD大鼠取股骨骨髓体外培养扩增骨髓间质干细胞(BMSC),以lentivirus载体介导hBMP-2基因转染BMSC,诱导其向成骨细胞分化.将细胞接种于经纤维连接蛋白修饰的β-磷酸三钙(β-TCP),共同培养10d.30只大鼠均造成颅骨极量缺损(直径8mm)模型,分为Lev- BMP2转染细胞+β-TCP组(A组:n=10);BMSC +β-TCP组(B组:n=10);β-TCP组(C组:n=10)于第4、8、12、20周从影像学及组织学角度观察比较颅骨缺损修复情况.结果 无论X线摄片及组织切片均表明,A组颅骨骨缺损修复优于同期的B组和C组.在各时间点A组和B组在植骨区均有新骨形成,而C组仅见边缘区成骨.术后20周新生骨小梁相对体积(TBV,%)A组为(60.83±11.49),B组为(40.37±9.02),C组为(18.37±6.02),差异有统计学意义(P<0.01). 结论 Lev- BMP2转染BMSC复合β-TCP构建的组织工程化骨对大鼠颅骨极量骨缺损有较好的修复效果.     

腺病毒介导BMP-2联合低氧诱导因子1α突变型与单基因BMP-2分别转染BMSCs后成骨效应的比较研究

目的比较腺病毒载体Ad-BMP-2-内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)-低氧诱导因子1α突变型(hypoxia inducible factor 1αmu,HIF-1αmu)与Ad-巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)-BMP-2-IRES-人源化海肾绿色荧光蛋白1(human renilla reniformis green fluorescent protein 1,hrGFP-1)分别转染BMSCs后的成骨效应,优化成骨细胞种子来源。方法取1月龄新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs。取第3代BMSCs进行病毒液转染,根据转染病毒液不同将实验分为4组,A、B、C组分别采用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50、100、150和200的Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu、Ad-CMV-BMP-2-IRES-hrGFP-1、Ad-CMV-IRES-hrGFP-1(空腺病毒载体)转染细胞,D组为未被转染的BMSCs。选择最佳MOI值进行观察。转染后采用免疫组织化学染色检测BMP-2表达,Western blot检测BMP-2和HIF-1α蛋白表达,ALP活性测定和钙结节茜素红染色检测细胞成骨分化能力。结果 A、B、C组最佳MOI值分别为200、150和100。免疫组织化学染色示,A、B组BMP-2染色呈阳性,C、D组呈阴性;A组阳性细胞数明显多于B组(P<0.05)。Western blot检测示,A、B组BMP-2蛋白表达明显高于C、D组(P<0.05),A组高于B组(P<0.05);A组HIF-1α蛋白表达明显高于其余3组(P<0.05),其余3组间差异无统计学意义(P>0.05)。A、B组ALP活性明显高于C、D组(P<0.05),A组高于B组(P<0.05)。茜素红染色示,A、B组可见明显钙结节,C、D组未见钙结节形成;且A组钙结节数量多于B组(P<0.05)。结论单载体双基因Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu与单载体单基因Ad-CMV-BMP-2-IRES-hrGFP-1分别转染兔BMSCs后,前者BMP-2和成骨效应表达均高于后者。     

缝隙连接蛋白43对激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的探讨缝隙连接蛋白43(Cx43)在激素性股骨头坏死(ONFH)骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达及其对细胞增殖的作用。方法收集20例激素性股骨头坏死和20例股骨颈骨折患者的股骨骨髓, 分离培养BMSCs, 培养至第3代用于实验。构建携Cx43的重组慢病毒载体, 转染、筛选获得阳性细胞。实验分为A组:激素性股骨头坏死患者BMSCs组;B组:激素性股骨头坏死患者BMSCs经Cx43重组慢病毒感染组;C组:激素性股骨头坏死患者BMSCs经空载体感染组;D组:股骨颈骨折患者BMSCs组。检测上述分组中细胞增殖, 细胞内活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)水平, 增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、细胞周期蛋白E1(Cyclin E1)、Cx43 mRNA的表达水平。两组间比较采用t检验。结果 D组细胞增殖能力高于A、B、C组, B组细胞增殖能力高于A、C组;D组线粒体膜电位明显高于A、B、C组(11.07±0.63比4.84±0.42、9.18±0.35、6.09±0.46, t=70.618、10.761、57.631, P<0.05)。B组...     

H_2O_2下调miR-21对MC3T3-E1细胞成骨分化影响的研究北大核心CSCD

目的探讨H_2O_2诱导的miR-21下调对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用及机制。方法取MC3T3-E1细胞系,培养传至第7代进行实验。取MC3T3-E1细胞,以不同浓度H_2O_2(0、40、80、160、320μmol/L)培养,经实时荧光定量PCR检测miR-21表达、MTS法检测细胞活性,选择H_2O_2最合适实验浓度。取MC3T3-E1细胞分为空白对照组(A组)、H_2O_2组(B组)、成骨诱导组(C组)、H_2O_2+成骨诱导组(D组),对应培养后实时荧光定量PCR检测miR-21表达以及成骨标志基因Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠalpha 1,Col1a1)表达,Western blot检测磷酸酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)蛋白表达,茜素红染色观察细胞外钙基质沉积情况,分析H_2O_2对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。然后再取MC3T3-E1细胞,分为H_2O_2组(A1组)、H_2O_2+成骨诱导组(B1组)、H_2O_2+ miR-21抑制剂+成骨诱导组(C1组)、H_2O_2+ miR-21抑制剂阴性对照+成骨诱导组(D1组);以及H_2O_2组(A2组)、H_2O_2+成骨诱导组(B2组)、H_2O_2+ siRNA-PTEN阴性对照+成骨诱导组(C2组)、H_2O_2+siRNA-PTEN+成骨诱导组(D2组);对应培养后检测成骨标志基因(Runx2、OPN、Col1a1)表达以及细胞外钙基质沉积情况,分析下调miR-21或沉默PTEN对细胞成骨分化的影响。结果结合实时荧光定量PCR检测以及MTS法结果,选择160μmol/L H_2O_2进行实验。第1、2周B组miR-21相对表达量低于A组(P<0.05),D组低于C组(P<0.05);第2周C组PTEN蛋白相对表达量均低于A、D组(P<0.05);第1、2周D组Runx2、OPN及Col1a1 mRNA相对表达量均低于C组(P<0.05),茜素红染色显示D组钙基质沉积少于C组。C1组PTEN蛋白相对表达量高于D1组(P<0.05);第1、2周B1、D1组Runx2、OPN mRNA相对表达量均高于C1组(P<0.05),第2周B1、D1组Col1a1 mRNA均高于C1组(P<0.05);茜素红染色显示C1组钙基质沉积少于B1、D1组。第1周D2组OPN、Col1a1 mRNA相对表达量高于B2、C2组(P<0.05),第3周茜素红染色显示D2组钙基质沉积明显多于B2、C2组。结论 H_2O_2抑制MC3T3-E1成骨分化可能与miR-21下调有关。     

缺氧状态对骨形态发生蛋白-2诱导分化体外复合富血小板血浆凝胶的骨髓间充质干细胞的影响

目的研究缺氧状态对骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导分化体外复合富血小板血浆(PRP)凝胶的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的影响。方法取第三代培养的BMSCs细胞与PRP凝胶相混合,通过构建细胞缺氧模型,根据培养条件的不同确定实验分组:常氧BMSCs+PRP组(A组)、常氧BMP-2+BMSCs+PRP组(B组)、低氧BMSCs+PRP组(C组)、低氧BMP-2+BMSCs+PRP组(D组)。反转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)及Western-blotting检测各组成软骨及成骨基因的表达。结果 RT-PCR检测表明C组和D组的Ⅱ型胶原、蛋白聚糖和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达均较A组和B组明显升高;Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶(ALP)在B组的表达最高;A组与B组runt相关转录因子2(Runx2)的表达较C组和D组明显升高。Western-blotting检测结果表明B组和D组的Ⅱ型胶原表达较A组和C组明显升高;C组与D组的HIF-1α表达较A组与B组显著升高;D组的SOX-9表达较其余3组显著升高。所有结果差异均有统计学意义(P0.05)。结论低氧条件能显著促进BMP-2对BMSCs的成软骨诱导分化,同时抑制BMSCs的成骨分化。HIF-1α可能是这一过程的重要调节因子,其可能通过调节SOX-9的表达来发挥促BMSCs成软骨细胞分化的作用。     

高效抗逆转录病毒治疗对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的观察高效抗逆转录病毒药物血清干预骨髓间充质干细胞(BMSC)增殖及成骨分化的研究,探讨抗病毒药物对骨代谢的影响。方法采用3种HAART药物分别制备药物血清干预BMSC增殖及分化,CCK法检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶、钙茜素及油红O染色观察细胞成骨、成脂分化,PCR检测BMSC向成骨分化过程中Runx 2和OPG基因表达水平。结果替诺福韦酯药物血清组与大鼠血清组比较,药物血清干预72 h时(A72 h)值差异具有统计学意义(F=15.42、P=0.004)。BMSC成骨诱导分化试验中,与对照组比较药物血清组干预组碱性磷酸酶染色阳性细胞减少,茜素红染色钙结节减少,其中替诺福韦酯药物血清组改变最为显著,而且成脂诱导分化中与对照组比较成脂样细胞增多。BMSC成骨诱导分化,PCR检测与对照组比较替诺福韦酯药物血清组Runx 2表达减少,OPG表达增加(F=11.81、P=0.026,F=10.14、P=0.033)。结论 HAART药物可能抑制BMSC增殖和成骨分化,其中替诺福韦酯的影响最为显著。     

H_2O_2下调miR-21对MC3T3-E1细胞成骨分化影响的研究

目的探讨H_2O_2诱导的miR-21下调对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用及机制。方法取MC3T3-E1细胞系,培养传至第7代进行实验。取MC3T3-E1细胞,以不同浓度H_2O_2(0、40、80、160、320μmol/L)培养,经实时荧光定量PCR检测miR-21表达、MTS法检测细胞活性,选择H_2O_2最合适实验浓度。取MC3T3-E1细胞分为空白对照组(A组)、H_2O_2组(B组)、成骨诱导组(C组)、H_2O_2+成骨诱导组(D组),对应培养后实时荧光定量PCR检测miR-21表达以及成骨标志基因Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠalpha 1,Col1a1)表达,Western blot检测磷酸酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)蛋白表达,茜素红染色观察细胞外钙基质沉积情况,分析H_2O_2对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。然后再取MC3T3-E1细胞,分为H_2O_2组(A1组)、H_2O_2+成骨诱导组(B1组)、H_2O_2+ miR-21抑制剂+成骨诱导组(C1组)、H_2O_2+ miR-21抑制剂阴性对照+成骨诱导组(D1组);以及H_2O_2组(A2组)、H_2O_2+成骨诱导组(B2组)、H_2O_2+ siRNA-PTEN阴性对照+成骨诱导组(C2组)、H_2O_2+siRNA-PTEN+成骨诱导组(D2组);对应培养后检测成骨标志基因(Runx2、OPN、Col1a1)表达以及细胞外钙基质沉积情况,分析下调miR-21或沉默PTEN对细胞成骨分化的影响。结果结合实时荧光定量PCR检测以及MTS法结果,选择160μmol/L H_2O_2进行实验。第1、2周B组miR-21相对表达量低于A组(P0.05),D组低于C组(P0.05);第2周C组PTEN蛋白相对表达量均低于A、D组(P0.05);第1、2周D组Runx2、OPN及Col1a1 mRNA相对表达量均低于C组(P0.05),茜素红染色显示D组钙基质沉积少于C组。C1组PTEN蛋白相对表达量高于D1组(P0.05);第1、2周B1、D1组Runx2、OPN mRNA相对表达量均高于C1组(P0.05),第2周B1、D1组Col1a1 mRNA均高于C1组(P0.05);茜素红染色显示C1组钙基质沉积少于B1、D1组。第1周D2组OPN、Col1a1 mRNA相对表达量高于B2、C2组(P0.05),第3周茜素红染色显示D2组钙基质沉积明显多于B2、C2组。结论 H_2O_2抑制MC3T3-E1成骨分化可能与miR-21下调有关。