脂肪干细胞来源外泌体对人脐静脉血管内皮细胞增殖、迁移及管样分化的影响

目的探讨脂肪干细胞来源外泌体(adipose-derived stem cell released exosomes,ADSC-Exos)对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖、迁移及管样分化的影响。方法取吸脂患者自愿捐赠的脂肪组织,采用酶消化法分离培养获得ADSCs,并行流式细胞检测及成脂诱导鉴定。收集第3代ADSCs上清液提取外泌体,透射电镜观察其形态,Western blot检测其膜表面标志性蛋白Alix和CD63,用纳米颗粒跟踪分析仪NanoSight分析外泌体粒径分布范围。用PKH26荧光标记的ADSC-Exos与HUVECs共培养后,共聚焦显微镜观察ADSC-Exos能否进入HUVECs。将ADSC-Exos与HUVECs共培养1、2、3、4、5 d,CCK-8法检测ADSC-Exos对HUVECs增殖影响;共培养12 h时ELISA法检测细胞上清液VEGF蛋白表达量。采用Transwell迁移实验检测ADSC-Exos对HUVECs迁移能力的影响。通过体外Matrigel基质胶实验,观察ADSCExos对HUVECs管状结构形成的影响;将HUVECs与Matrigel基质胶混合后联合ADSC-Exos注射在BALB/c雄性裸鼠皮下,2周后检测基质胶中新生血管情况,计算平均血管密度(mean blood vessel density,MVD)。上述实验均以等量PBS作为对照。结果经鉴定所培养细胞符合ADSCs的特征。ADSC-Exos为形态一致的圆形或椭圆形膜性囊泡,表达标志性蛋白Alix和CD63,粒径范围30~200 nm。共聚焦显微镜观察示ADSC-Exos可被HUVECs摄取。CCK-8法检测示,各时间点实验组细胞增殖均优于对照组(P0.05)。Transwell实验结果显示,实验组跨膜迁移细胞数较对照组显著增多(t=9.534,P=0.000)。在体外Matrigel胶成管实验中,实验组管样结构数明显多于对照组(t=15.910,P=0.000);在体内实验中,实验组MVD亦显著高于对照组(t=16.710,P=0.000)。ELISA检测示,实验组细胞上清液VEGF蛋白表达量明显高于对照组(t=21.470,P=0.000)。结论 ADSC-Exos可促进HUVECs增殖、迁移及管样结构形成,提示ADSC-Exos可促进血管新生。     

脂肪干细胞来源外泌体促进糖尿病小鼠创面愈合的实验研究

目的探讨脂肪干细胞来源外泌体(adipose-derived stem cell released exosomes,ADSC-Exos)对糖尿病小鼠创面愈合的影响。方法取患者自愿捐赠脂肪组织,采用酶消化法分离培养ADSCs,并于第3代细胞上清液提取Exos(ADSC-Exos);透射电镜观察ADSC-Exos形态,Western blot检测膜表面标志性蛋白Alix、CD63,纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径分布。取患者自愿捐赠皮肤组织,采用酶消化法分离培养成纤维细胞。将PKH26标记的ADSC-Exos与第5代成纤维细胞培养,共聚焦荧光显微镜观察其能否进入细胞,采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)及划痕法观察ADSC-Exos对成纤维细胞增殖及迁移的影响。取24只8周龄Balb/c雄性小鼠制备糖尿病模型后,背部制备直径8 mm全层皮肤缺损创面,实验组(n=12)及对照组(n=12)创面真皮层分别注射0.2 mL ADSC-Exos及PBS。第1、4、7、11、16、21天大体观察创面愈合情况,计算创面愈合率;第7、14、21天取材,行组织学(HE及Masson)及CD31免疫组织化学染色,观察创面结构、胶原纤维及新生血管情况。结果ADSC-Exos为边缘清晰、大小分布均匀的膜性囊泡;粒径为40~200 nm,平均102.1 nm;膜表面标志性蛋白Alix、CD63均呈阳性。ADSC-Exos与成纤维细胞复合培养观察示,ADSC-Exos可进入成纤维细胞胞内,并能促进成纤维细胞增殖及迁移。动物实验显示,实验组小鼠背部创面愈合明显快于对照组,各时间点创面愈合率差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,实验组创面结构愈合更好,愈合前期新生微血管更多,愈合后期胶原纤维沉积更多;其中,第7、14、21天创面缺损长度,第7、14天微血管数量,第14、21天胶原纤维沉积百分比,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ADSC-Exos通过促进创面血管新生以及成纤维细胞增殖、迁移和胶原合成来促进糖尿病小鼠创面愈合。     

脂肪干细胞来源外泌体在皮肤创面修复中的作用机制

皮肤创面修复有多种方法,但均存在一定的局限性.近年来,有关脂肪干细胞来源外泌体的研究日益增多,大量研究表明脂肪干细胞来源外泌体在皮肤创面修复过程中具有积极的作用.本文对脂肪干细胞来源外泌体在皮肤创面修复中的作用机制研究进行综述,并展望其在皮肤组织再生领域的应用前景.     

脂肪干细胞来源外泌体对膝骨关节炎作用机制的研究进展

目前,治疗膝骨关节炎的方式多样且有效,但同时并发症比较明显。近年来,外泌体作为一种新的治疗方式被关注,并且表现出巨大的临床潜力。阐述膝骨关节炎与外泌体的关系,并介绍脂肪干细胞来源外泌体在免疫调节、成骨分化、细胞自噬三个方面的优势,旨在为临床治疗膝骨关节炎提供新思路、新方法。     

脂肪间充质干细胞外泌体改善骨质疏松症的研究进展

骨质疏松症是由于骨吸收和骨形成之间的动态平衡被打破,从而导致骨质流失,骨密度降低以及骨骼微细结构遭到破坏所形成的一种慢性骨代谢疾病。近年来,越来越多的研究证明,外泌体疗法将成为骨质疏松治疗的一个重要方向。外泌体是参与细胞间通信的脂质双分子层细胞外囊泡,可通过传递脂质、蛋白质、核酸的方式调节受体细胞的生物活性。其来源十分广泛,可存在于各种生物体液中,也由多种动物细胞分泌,如间充质干细胞等。脂肪来源的间充质干细胞作为细胞治疗领域最具前途的多功能工具之一,不仅具有分离的简便性和微创性,还可通过分化成不同的细胞谱系参与骨质修复、血管生成以及神经再生等生物环节,并利用旁分泌信号传导释放外泌体,调控相关骨细胞的分化、增殖和凋亡,影响骨组织微环境,从而预防和改善骨质疏松。该文将从脂肪间充质干细胞衍生外泌体在骨质疏松方面的应用及其作用机制进行综述,为未来脂肪间充质干细胞外泌体应用于骨质疏松的临床治疗提供理论依据。     

人脐静脉血管内皮细胞体外培养的方法研究

目的建立人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)体外高效稳定培养的方法,为组织工程及相关医学基础研究提供稳定的细胞来源。方法取自愿捐赠足月妊娠分娩的新生儿脐带,用自制空针软管静脉注入0.1%Ⅱ型胶原酶,置于37℃培养箱中,消化收集,采用含5%FBS及1%内皮细胞生长因子(endothelial cell growth factor,ECGS)的内皮细胞专用培养基进行培养。将消化前后的脐带标本行HE染色,观察HUVECs脱壁情况;流式细胞仪检测原代细胞纯度;细胞培养期间于倒置相差显微镜下观察细胞形态;取第3代HUVECs行免疫细胞化学染色观察、MTT检测细胞增殖情况,并将细胞接种于细胞外基质胶Matrigel上培养24 h,观察细胞管腔形成情况。结果经Ⅱ型胶原酶消化后的脐带内HUVECs大量脱落,细胞消化完全。经Ⅱ型胶原酶37℃培养箱中消化15 min后,可获得纯度为99.56%的HUVECs;原代HUVECs培养后2～3 d生长最快,呈典型的铺路石或鹅卵石样排列,4～6 d融合成片。MTT法检测显示第3代HUVECs培养后3～4 d细胞生长最快,5 d左右融合;免疫细胞化学染色显示内皮细胞Ⅷ因子相关抗原表达阳性,培养24 h后在细胞外基质胶Matrigel上可见类似于毛细血管的完整闭合管腔形成。结论经自制空针软管静脉注入0.1%Ⅱ型胶原酶,使静脉充分充盈,内皮消化完全,采用含5%FBS和1%ECGS的内皮细胞专用培养基,可迅速获取大量高纯度、高存活率的HUVECs。     

脂肪干细胞外泌体抑制 TGF-β1 促进糖尿病创面愈合的研究

目的 检测脂肪干细胞外泌体（ADSC-Exos）对糖尿病创面愈合、瘢痕形成的影响,并以TGF-β1信号为靶点,探讨ADSC-Exos发挥作用的分子机制。方法 分离培养脂肪干细胞,收集外泌体进行鉴定。并在糖尿病大鼠创面多点注射外泌体,通过计算创面面积、组织学染色以及Western Blot检测,评估外泌体对创面愈合、TGF-β1信号通路的影响。结果 获取的ADSC-Exos符合典型的外泌体特征;ADSC-Exos可提高创面愈合率和血管化、抑制瘢痕,并抑制TGF-β1信号通路。结论 ADSC-Exos促进了大鼠糖尿病创面愈合,在创伤后期可抑制关键纤维化信号TGF-β1,减少瘢痕形成     

人脐带血干细胞外泌体对大鼠股骨头坏死的影响

[目的]探讨人脐带间充质干细胞外泌体（human umbilical cord mesenchymal stem cell-exosomes, hUCMSC-Exos）防治大鼠激素性股骨头坏死的疗效及其潜在机制。[方法] 36只雄性7周龄Sprague-Dawley大鼠随机分为3组,每组12只。空白对照组给予0.9%的盐水静脉注射;模型组给予静脉注射脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）和甲泼尼龙（methylprednisolone,MPS）制备股骨头坏死模型;外泌体组在模型组给予的基础上,静脉注射hUCMSC-Exos。在第28 d处死大鼠,取股骨头行组织学Micro CT检测。[结果]透射电子显微镜和Western blot的检测表明,所提取分离物符合Exos基本特征。HE染色组织形态观察,三组的空骨陷窝率：模型组>外泌体组>空白对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。TUNEL染色成骨细胞凋亡率,模型组>外泌体组>空白对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。Micro CT检测方面,与空白对照组相比,模型组大鼠的BV...     

间充质干细胞来源外泌体治疗骨关节炎的研究进展

骨性关节炎(OA)是一种最常见的关节退行性疾病,其病理变化主要是细胞炎症介导的软骨细胞凋亡和软骨细胞外基质(ECM)降解.由于间充质干细胞(MSC)在特定条件培养基诱导下可以分化为软骨细胞,基于此,MSC细胞疗法给OA的治疗带来了新的希望.然而,MSC细胞疗法在技术上存在局限性,包括MSC扩增时去分化,注射后再生效率降...     

干细胞外泌体对骨质疏松大鼠骨生成的影响

[目的]探讨间充质干细胞源性外泌体对骨质疏松大鼠骨生成的调节作用.[方法]体外获取和鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)以及 BMSCs 源性外泌体(exosomes derived from BMSCs,BMSC-Exos).采用CCK8法检测B...     

骨髓间充质干细胞来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤的修复作用

目的 :初步探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的修复作用。方法:全骨髓培养法培养大鼠BMSCs,收集P2代细胞上清,Exo Quick Precipitation提取法分离并纯化外泌体,通过透射电镜观察鉴定外泌体形态,采用Western blot鉴定外泌体表面标志蛋白CD9、CD63。通过脊髓法建立大鼠SCI模型,造模1h后尾静脉给予外泌体移植500μl(外泌体蛋白浓度为200μg/ml),采用随机数字表法分将30只大鼠为三个组:假手术组、对照组(SCI+磷酸盐溶液)、外泌体组(SCI+外泌体),均采用BBB评分、斜板实验于造模后1、3、7、14、21、28d评价大鼠运动功能恢复情况,并于术后28d处死取材,采用苏木精-伊红(HE)染色、髓鞘(luxol fast blue,LFB)染色观察各组脊髓组织形态学改变,尼氏(Nissl)染色观察神经元存活数目。结果:透射电镜下可见大量直径40~100nm的立体圆形或茶托形的小囊泡结构,外周可见完整的类脂质膜性结构,内含低电子密度物质。Western Blot显示CD9、CD63蛋白表达阳性。造模后假手术组各时间点的BBB评分和斜板评分均正常,对照组和外泌体组BBB评分和斜板评分均低于假手术组(P0.05),造模后7、14、21、28d外泌体组BBB评分分别为6.30±0.95、12.70±1.57、16.60±1.08、17.00±0.67分,均高于同时间点对照组的2.50±1.08、6.90±0.99、10.50±0.85、12.50±1.08分(P0.05)。造模后7、14、21、28d外泌体组斜板评分分别为43.00±3.50、55.50±4.38、62.50±2.64、65.00±3.33分,均高于同时间点对照组的34.00±3.16、43.00±4.22、49.00±4.59、52.50±4.25分(P0.05)。造模后28d,假手术组脊髓组织HE染色、LFB染色、Nissl染色正常,对照组脊髓空洞形成、髓鞘排列紊乱、神经元数目减少,外泌体组与对照组比较脊髓组织损伤程度减轻,存活神经元数目增多(P0.05)。结论:MSCs来源的外泌体可减轻脊髓损伤后的病理变化,改善运动功能,促进脊髓损伤后神经功能修复。     

人脂肪间充质干细胞外泌体对小鼠RAW264.7细胞的炎症反应和小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响

目的:探讨人脂肪间充质干细胞（ADSC）外泌体对小鼠RAW264.7细胞介导的炎症反应和小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响。方法:采用实验研究方法。取2020年6—9月于空军军医大学第一附属医院行腹部手术的3例女性患者（10~25岁）废弃脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶消化法提取ADSC,采用流式细胞术进行鉴定。使用差速超高速离心...     

人尿源干细胞外泌体对退变髓核细胞生物学功能的影响

目的:探讨人尿源干细胞外泌体(USC-Exos)对退变髓核细胞(NPCs)生物学功能的影响。方法 :从健康成人尿液中获得人尿源干细胞(USCs)并进行体外培养,通过成骨、成软骨、成脂诱导分化及蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)技术对所提取细胞进行鉴定。使用USCs完全培养基培养USCs 48h后采用差速离心法从培养基中提取外泌体,应用电子显微镜、粒径分析及WB技术对USC-Exos进行形态、直径及表面标志物检测。从腰椎间盘突出症患者术中摘除的髓核中提取NPCs,并培养至P6。以加入50μg/ml USC-Exos干预的P6NPCs为实验组,以50μg/ml未培养过细胞的USCs完全培养基离心沉淀物干预的P6 NPCs为对照组,分别在干预后1～6d使用CCK-8法检测NPCs增殖情况。使用PKH26荧光染料标记USC-Exos,并用标记后的USCExos干预P6 NPCs,12h后在激光共聚焦显微镜下观察NPCs对USC-Exos的摄取情况。两组在干预后48h进行β-半乳糖苷酶衰老染色检测NPCs衰老比例,免疫荧光染色观察蛋白聚糖(ACAN)、Ⅱ型胶原(COL2)的表达。干...     

人脂肪干细胞向内皮细胞的定向分化

目的 为解决血管组织工程种子细胞来源不足问题,分离和培养人脂肪干细胞(hADSCs),并在体外定向诱导hADSCs分化为内皮细胞.方法 利用胶原酶消化法和贴壁筛选法从人脂肪组织中分离、培养及扩增hADSCs;应用纤维粘连蛋白(FN)与富含多种生长因子的内皮细胞支持液EGM2-MV及高浓度血管内皮细胞生长因子(VEGFi6s)50 ng/ml,协同定向诱导hADSCs分化为内皮细胞,然后对其进行形态、表型及功能鉴定.结果 体外分离、培养出高度同源性的hADSCs,hADSCs定向内皮分化后免疫组化及RT-PCR结果显示,内皮特异性标志物CD31、CD34及血管内皮细胞生长因子受体(KDR)阳性表达,透射电镜下观察到内皮特异性结构怀布尔-帕拉德(Weibel-Palade)小体,内皮细胞功能性检测结果显示诱导后hADSCs能够吞噬Dil标记的乙酰化的低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)及在基质胶(Matrigel)上形成小管样结构,成管数(18.9±1.203)、分支数(31.2±1.304)、结点数(16.9±1.183),与HUVEC组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 在体外可成功诱导hADSCs分化为内皮细胞.

Abstract：

Objective To investigate the possibility of directional differentiation of human adipose stem cells (hADSCs) into endothelial cells (EC), so as to provide seed cells for tissue engineered vessels.Methods hADSCs were isolated from human adipose tissue by collagenase digestion, cultured and amplified by adherence to flasks. Then hADSCs were directionally induced to differentiate into EC by a combination of fibronectin ( FN ), endothelial cells support liquid ( EGM2-MV ) containing various growth factors and high concentration of VEGF165 (50 ng/ml). Then, the cells morphology, phenotype and function were identified. Results Highly homologous hADSCs were obtained, and then hADSCs were directionally differentiated into EC. CD31 and CD34, the specific markers for EC, and vascular endothelial growth factor receptor (KDR) were positive by immunohistochemical staining and RT-PCR. In addition,unique Weibel-Palade bodies in EC were observed under transmission electron microscope. Functionally,hADSCs could swallow Dil-Ac-LDL and form tube-like structures in matrigel after endothelial differentiation. Conclusions hADSCs can be successfully induced to differentiate into endothelial cells in vitro.     

脂肪干细胞来源的外泌体对局限性硬皮病成纤维细胞生物学功能的影响

目的探索来源于健康人脂肪干细胞(ADSC)的外泌体对局限性硬皮病成纤维细胞(LSFs)纤维化的体外调控作用。方法取2021年1月至2022年1月中国医学科学院北京协和医院整形外科10例健康人吸脂手术剩余脂肪组织, 体外分离培养ADSC, 以超速离心法收集其外泌体(ADSC-Exo);取同期15例局限性硬皮病患者患处皮肤组织, 体外分离培养成纤维细胞。采用不同方向的诱导分化染色、纳米粒子追踪分析、透射电子显微镜、PKH26染色和蛋白质印迹法对ADSC及ADSC-Exo进行鉴定。通过细胞外囊泡分泌抑制实验检验ADSC是否通过其外泌体影响LSFs纤维化标志物[Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)]的表达。取被ADSC-Exo干预的LSFs, 通过CCK-8法、划痕实验检测LSFs的增殖和迁移能力。采用实时荧光定量PCR、免疫荧光染色和蛋白质印迹法检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA、转化生长因子β(TGF-β)和p-Smad2/3的表达情况。两组比较采用独立样本t检验;多组比较采用方差分析, 组间两两比较采用SNK-q检验。结果成功于体外分离并培养ADSC和LSFs, 并提取A...     

人脂肪间充质干细胞来源外泌体对脓毒症小鼠肺血管内皮细胞损伤的影响及其机制

目的:探讨人脂肪间充质干细胞（ADSC）来源外泌体对脓毒症小鼠肺血管内皮细胞（PMVEC）损伤的影响及其机制。方法:采用实验研究方法。取空军军医大学第一附属医院收治的3例行腹部手术切除患者（均为女性,年龄10~25岁）遗弃的新鲜脂肪组织进行原代人ADSC的分离培养,于第5天采用倒置相差显微镜观察细胞形态。取第3代ADS...     

干细胞源性外泌体修复脊髓损伤的研究进展

脊髓损伤是一个世界性难题。干细胞修复脊髓损伤的研究取得了一些研究进展,然而,干细胞移植的一些缺点限制其临床转化。越来越多的证据表明,干细胞可以旁分泌外泌体的方式修复脊髓损伤,为脊髓损伤患者带来了新的希望。该文主要针对干细胞源性外泌体修复脊髓损伤的研究现状,从分子水平、细胞水平、组织水平对外泌体修复脊髓损伤的作用机制进行综述,以更好地理解外泌体作为干细胞移植的治疗方法。     

辛伐他汀对人脐静脉内皮细胞分泌IL-6和IL-8的影响

目的：研究辛伐他汀对人脐静脉内皮细胞分泌IL-6和IL-8的影响。方法：辛伐他汀（5μg／mL，10μg/mL）分别预处理细胞8h后加入100ng／mL的脂多糖（ipopolysaccharides，LPS）共同孵育，用ELISA方法检测不同时间点（1、12和24h）JL-6和IL-8含量变化。结果：空白对照组细胞在不施加任何刺激的情况下可以分泌少量IL-6和JL-8，并随时间的延长分泌量不断增加；LPS刺激组IL-6和IL-8分泌量比对9鼐组明显增加．差异有统计学意义（P〈0．05）；经过辛伐他汀预处理组IL-6和IL-8分泌量明显低于LPS单独刺激（P〈0．01）。结论：辛伐他汀具有抑制LPS刺激血管内皮细胞分泌炎症因子JL-6和JL-8的作用。